Die Charakterisierung der Xylanasen aus A. sydowii auf ihre

70 ein Enzym der GH10 Familie, aber vier Enzyme der GH11 Familie [Cantarel et al. 2009;

Lombard et al. 2014]. Beim Abbau der Pflanzenzellwand arbeiten vielen xylolytische Enzyme synergistisch zusammen. Gonçalves et al. [2015] zeigte, dass die synergistische Wirkung von fünf Xylanasen aus unterschiedlichen thermophilen Mikroorganismen, Thermobifida fusca und Clostridium thermocellum, die Produktion von reduzierten Zuckern erhöht.

3.4.2 Die Charakterisierung der Xylanasen aus A. sydowii auf ihre biotechnologische

71 Xylanasen von Trichoderma inhamatum wurden ebenso aufgrund ihrer hydrolytischen Katalyse von Xylo-Oligosacchariden als Endoxylanasen ermittelt [Silva et al. 2015].

Das Substratspektrum eines Proteins gibt Aufschluss darüber, welches Substrat bevorzugt eingesetzt wird, um eine erhöhte Abbaurate zu erlangen. Xylanase I und Xylanase II wurden auf verschiedene Substrate getestet und haben eine vergleichbare Substratspezifizität. Xylan aus Buchenholz ist das bevorzugte Substrat gegenüber anderen getesteten Oligosacchariden wie Stärke, Arabinoxylan vom Weizen oder CMC. Ab einer Kettenlänge von fünf Zuckern bauen beide Xylanasen das Substrat ab. Obwohl die Xylanase II eine Endoxylanase ist, weist sie eine leichte Aktivität von 10% bei Xylotriose als Substrat auf. Xylanase II ist demnach in der Lage, kurzkettige Zucker ab einer Kettenlänge von drei Xylosen abzubauen. Dieses Ergebnis wurde auch mit der Dünnschichtchromatographie belegt. In dieser Studie wurde neben der Xylanase I, die ausschließlich längerkettige Xylo-Oligosaccharide schneidet, eine Exo-1,4--Xylanase identifiziert, die wahrscheinlich Xylobiose in Xylose spaltet. Für genauere Aussagen müsste dieses Enzym charakterisiert werden. Man kann spekulieren, dass die Xylanase II gebraucht wird, um die Xylo-Oligosaccharide ab einer Kettenlänge von drei Xylosen zu spalten. Dies erklärt die Produktion von zwei Endoxylanasen mit einer unterschiedlichen Substratspezifizität. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass eine erhöhte Substratkonzentration die Aktivität des Enzyms steigert. Es konnte gezeigt werden, dass die höhere Xylankonzentration zu einer höheren Aktivität führt. Allerdings ist die Löslichkeit des Xylans in Flüssigkeit mit steigender Xylankonzentration erschwert. Dies führte zu einer hohen Standardabweichung bei den Messungen.

Dass beide in dieser Arbeit untersuchten Xylanasen unterschiedlichen sind, ist auch aus ihrer spezifischen Aktivität bei unterschiedlichen Temperaturen ersichtlich. Eine hohe Temperaturtoleranz der Xylanasen ist in der Industrie erstrebenswert, um unter anderem eine Kontamination durch andere Mikroben zu verhindern [Yeoman et al. 2010]. Die Xylanase II hat eine fast doppelt so hohe Aktivität bei 50°C wie Xylanase I, die ihr Optimum bei 30°C hat. Diese Aktivität kann sie über 2 h Stunden lang beibehalten. Bei 70°C ist die Xylanase II noch bis zu einer halben Stunde mit 70% aktiv. Diese Toleranz gegenüber hohen Temperaturen ist höher als die Toleranz der Xylanase Bacillus amyloliquefaciens XR44A, die nur fünf Minuten bei einer Temperatur von 70°C stabil bleibt [Amore et al. 2015].

Xylanase II behält außerdem seine Aktivität bis zu 24 h bei einem sauren pH-Wert von 4,8 und bis zu 24 h bei einem basischen pH-Wert von 9. Die Xylanase von Penicillium sp. CGMC 1669 weist ebenso ein Temperaturoptimum und eine

72 Temperaturstabilität von 40°C und eine pH-Stabilität zwischen einem pH-Wert von 4,5 - 9 auf [Liu et al. 2010]. Diese Werte sind vergleichbar mit der Xylanase von Aspergillus lentulus, die ein pH-Optimum von 5,3 und ein Temperatur-Optimum von 50°C aufweist [Kaushik et al. 2014].

Die Xylanase XynVII von Aspergillus niger hat vergleichbare Temperatur- und pH-Stabilität. Sie ist aktiv bei einem pH-Wert bis zu 10 und einer Temperatur bis etwa 60°C über 24 h [Takahashi et al. 2013]. In industriellen Prozessen, wie das biobleaching von Zellstoff und Papier, bei dem Xylanasen bevorzugt zum Einsatz kommen, bieten beide Charakteristiken einen Vorteil [Sridevi et al. 2017]. Die Xylanasen von Aspergillus sydowii identifiziert von Nair et al. [2008] zeigten ihr Temperaturoptimum bei 50°C jedoch bei einer Inkubationszeit von 4 h. Xylanase I erreicht ihre höchste Aktivität bei 30°C, bleibt aber bis zu 192 h stabil. Ebenso bleibt sie bei einem basischem sowie saurem pH-Wert für ca. 7 Tage stabil. Demnach ist die Xylanase I für Verfahren, bei denen das Enzym für längere Zeit in nicht neutralem pH-Wert das gewünschte Substrat umsetzen soll, geeignet. Diese hohe Aktivität in einem breiten pH-Spektrum ist für die biotechnologische Nutzung von Vorteil verglichen mit einer Xylanase von Aspergillus niger, die ihren optimalen pH-Wert bei 8 aufweist [Taneja et al. 2002].

Ein weiterer Aspekt, um die biotechnologische Nutzbarkeit der Enzyme zu untersuchen, ist ihre Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln, Salzen und nichtionischen Tensiden, die häufig in industriellen Reinigungsmitteln angewendet werden. Xylanase I und Xylanase II weisen eine unterschiedliche Aktivität in Gegenwart verschiedener Chemikalien auf. Während Xylanase I eine höhere Toleranzgrenze bei organischen Lösungsmitteln und Alkoholen hat, weist Xylanase II auch bei niedrigen Konzentrationen dieser Chemikalien nur eine geringe Aktivität auf. Bei dem Lösungsmittel DMSO allerdings, welches in biotechnologischen Prozesse aufgrund seiner lösenden Eigenschaft von organischen Materialien und anorganisch Salze eingesetzt wird [Gaylord Chemical Company 2014], hat die Xylanase II keinerlei Einbußen bei der Aktivität bei 5% sowie 30% im Gegensatz zur Xylanase von Aspergillus niger C3486, welche schon bei geringen Konzentration von 2%

DMSO inhibiert wird [Yang et al. 2010]. Xylanase I weist bei einer DMSO-Konzentration von 30% nur noch 30% Aktivität auf.

Bei der Untersuchung der Toleranz gegenüber anorganischen Salzen, zeigten sich unterschiedliche Inhibitionen von Xylanase I und Xylanase II gegenüber den Salzen MgCl2

und MnCl2. Die Xylanase I wird erst bei einer Konzentration von 100 mM MgCl2 zu 50%

73 inhibiert, die Xylanase II hat schon bei einer Konzentration von 5 mM MgCl2 nur noch 50%

Aktivität. Die Glykosidhydrolasen sind aufgrund ihres katalytischen Mechanismus nicht Co-Faktor abhängig. Um die Inhibierung durch die Salze erklären zu können, sind weitere Untersuchungen notwendig. Im Gegensatz zu nicht Co-Faktor abhängigen Enzymen sind die Glykosyltransferasen fold-A Co-Faktor abhängig [Lairson et al. 2008]. Das nichtionische Tensid DDT, welches Disulfidbrücken aufbricht und somit die Faltung des Enzymes beeinflusst, hat in beiden getesteten Konzentrationen keinen Einfluss auf die Aktivität beider Xylanasen. Xylanase I besitzt nur ein Cystein und kann keine Disulfidbrücken bilden, Xylanase II besitzt in seiner AA Sequenz drei Cysteine, jedoch in einem Abstand von

> 5 Ångstrom. Daher sind die in dieser Arbeit identifizierten Xylanasen wahrscheinlich nicht in der Lage intramolekulare Disulfidbrücken auszubilden und werden aufgrund dessen nicht von DDT inhibiert.

Die Anwesenheit des Komplexbildners EDTA mit einer Konzentration von 2 mM bewirkt bei der Xylanase I eine spezifische Aktivität von 110%, was höher ist als die Aktivität von einer β-Xylosidase von Dictyoglomus thermophilum mit 94% relativer Aktivität bei einer EDTA Konzentration von 1 mM [Li et al. 2018]. EDTA in einer Konzentration von 50 mM wirkt dagegen hemmend auf beide Xylanasen. EDTA kann durch Komplexbildung bivalente Ionen entziehen und somit die Aktivität von Proteinen hemmen, die zweiwertige Ionen als Co-Faktoren benötigen. Wie bereits diskutiert, sind die Glykosidhydrolasen nicht Co-Faktor abhängig, wobei es dennoch möglich ist, dass die Proteinfaltung leicht gestört wird.

Gegenüber den Tensiden Tween 20 und Triton X 100 hat die Xylanase I eine höhere Toleranz als Xylanase II. Xylanase I besitzt bei Zusatz von 5% Triton X 100 noch eine spezifische Aktivität von etwa 100%. Im Gegensatz dazu hat die Xylanase von Dictyoglomus termophilum nur eine spezifische Aktivität von 32% bei 0,5% Triton X 100 [Zhang et al. 2010]. SDS hat eine derart inhibitorische Wirkung, dass beide in dieser Arbeit untersuchten Xylanasen keine Aktivität mehr aufweisen. Dies war zu erwarten, da SDS die nichtkovalenten Bindungen der Proteine aufbricht und somit deren Quartär- und Tertiärstruktur zerstört, was zu einer Fehlfaltung bzw. Auffaltung der Enzyme führt. Es gibt nur wenige Enzyme, die nicht durch SDS gehemmt werden [Vincenzini et al. 1985]. Die Proteasen von Bacillus clausi I-52 [Joo et al. 2003] und Bacillus sp. RGR-14 [Oberoi et al. 2001] gehören beispielsweise dazu. Die Gründe dafür sind die Ausbildung von mehr nichtkovalenten Bindungen bei Proteasen.

74 Neben der Charakterisierung der Xylanasen, also der Bestimmung ihres optimalen pH-Wertes und Temperaturstabilität sowie deren Inhibition durch organische Lösungsmittel, Salze und nichtionische Tenside, ist die Analyse des aktiven Zentrums ein wichtiger Aspekt für die biotechnologische Anwendung. Die 3D-Struktur der Xylanasen der Glykosidhydrolasen Familien GH10 und GH11 ist bekannt [Henrissat et al. 1995;

Wakarchuk et al. 1994]. Aufgrund von Sequenzhomologien von den beiden in dieser Arbeit analysierten Xylanasen und von Aminosäuresequenzen von Xylanasen aus der Datenbank PDB war es möglich, die 3D-Struktur der Xylanase I und Xylanase II zu modulieren.

Xylanase I bildet in der Tertiärstruktur eine jelly roll fold, was für die Glykosidhydrolasen Gruppe GH11 zutrifft [Wakarchuk et al. 1994]. Weitere Xylanasen der Familie GH11 bilden ebenso eine jelly roll fold, wie die Xylanase 1 von Aspergillus niger [Krengel und Dijkstra 1996] und eine Xylanase von Trichoderma longibrachiatum [Moukhametzianov et al. 2008].

Xylanase II hingegen bildet in ihrer 3D-Struktur eine (α/β)8 TIM barrel fold, was für die Glykosidhydrolasen Familie GH10 zutrifft [Henrissat et al. 1995]. Die GH10 Xylanasen von Thermoascus aurantiacus und Fusarium oxysporum bilden ebenso eine TIM barrel fold [Dimarogona et al. 2012; Vardakou et al. 2005]. Die Art der Faltung der Proteine ist nicht verknüpft mit einer funktionellen Klassifizierung der Enzyme. Das aktive Zentrum der Familien GH10 und GH11 wurde schon beschrieben [MacLeod et al. 1994; Miao et al. 1994;

Tull et al. 1991] und konnte somit mittels zielgerichteter Mutagenese ausgeschaltet werden.

Hierfür wurden jeweils zwei Glutaminsäuren (Xylanase I an Position 97 und 155, Xylanasen II an Position 155 und 241), die für die Bindung des Substrates im aktiven Zentrum wahrscheinlich verantwortlich sind, durch zwei Methionine ausgetauscht. Der Austausch des Kodons für Glutaminsäure zu Methionin ist eine gängige Methode bei der Ausschaltung des aktiven Zentrums von Enzymen, da beide in etwa den gleichen sterischen Raumanspruch haben. Die Distanz zwischen den substratbindenden Aminosäuren und dem Substrat selber liegt bei der Xylanase I bei 3,7 und 4,7 Å und bei Xylanase II bei 3,0 Å und 5,4 Å. Der Abstand zwischen dem Enzym und dem bindenden Substrat sollte keinen größeren Abstand als 5 Å haben, da sonst keine Enzym-Substrat-Bindung zustande kommt.

Bei der Distanzmessung ist zu berücksichtigen, dass es sich bei den Homologie-Modellen um starre Strukturen handelt, quasi eine Momentaufnahme. Proteine, in Lösung, sind jedoch in Bewegung und dadurch werden zeitweise größere und kleinere Distanzen möglich. Es wurden für beide Xylanasen jeweils zwei Einzelmutanten durch Austausch von Glutaminsäure in Position 97 und 188 bei Xylanase I und bei Xylanasen II an Position 155 und 241 bzw. eine jeweilige Doppelmutante für jede Xylanase generiert. Vergleicht man die

75 katalytische Aktivität der Mutanten mit den nicht mutierten Xylanasen, so beobachtet man eine Aktivitätseinbuße von mehr als 90% bei allen Einzelmutanten (E97M, E188M, E155M und E241M) sowie bei den Doppelmutanten (E97M / E188M und E155M / E241M). Durch den Koshland-Haltemechanismus, die Bindung und Umsetzung des Substrates durch zwei Aminosäuren (siehe Einleitung 1.5), war zu erwarten, dass die Einzelmutanten E97M der Xylanase I und E155M der Xylanase II noch Substrat in kleinen Mengen umsetzen. Bei den Einzelmutanten wird das Substrat noch am aktiven Zentrum gebunden, wodurch eine andere Aminosäure als Nukleophil agieren kann. Bei der Doppelmutante hingehen sollte die Enzym-Substrat-Bindung nicht zustanden kommen. Da bei den Doppelmutanten von Xylanase I (E97M / E188M) und von Xylanase II (E155M / E241M) jeweils bis zu 10%

Aktivität nachgewiesen wurde, kann man spekulieren, dass andere Aminosäuren im unmittelbaren Umfeld des aktiven Zentrums die Katalyse zum Teil übernehmen.

Die in dieser Arbeit identifizierten und charakterisierten Xylanasen können wegen ihrer Eigenschaften in der Biotechnologie für die verschiedensten Anwendungsgebiete (siehe Einleitung 1.4.2) angewendet werden. Xylanase I ist bei 30°C für bis zu sieben Tage stabil und hat eine hohe Toleranz gegenüber Lösungsmitteln, Salzen und Detergenzien.

Xylanase II ist für eine Stunde bei 70°C aktiv und für mindestens zwei Stunden bei 50°C.

Xylanase II ist bei 2 mM EDTA noch zu 100% aktiv und ist vermutlich in der Lage, Xyloseketten mit weniger als fünf Xylose-Einheiten zu spalten. Die untersuchten Xylanasen könnte man auch für die Anwendung zur Erstellung eines Xylanosomes verwenden.

Xylanosome sind Protein-Komplexe, die aus Xylanasen und anderen Hemicellulasen bestehen [McClendon et al. 2012]. Diese Xylanasome weisen eine erhöhte Produktivität auf und können synergistisch mit Cellulasen die Pflanzenzellwand effizient abbauen. Die Existenz von Protein-Komplexen wurde bereits durch das Cellulosome des Mikroorganismus Clostridium thermocellum beschrieben [Lamed und Bayer 1988]. Sie sind zusammengesetzt aus Zellwand abbauenden Enzymen. Wie auch die Cellulosome können die Xylanasome künstlich hergestellt und für die Biotechnologie angewendet werden [Nordon et al. 2009; McClendon et al. 2012].