Die molekulare Basis der circadianen Uhr von Drosophila

Meilenstein der Aufklärung des molekularen Mechanismus circadianer Systeme. Dadurch konnte erstmals gezeigt werden, dass dem rhythmisch regulierten Verhalten eine genetische Basis zugrunde liegt. Im Laufe der Jahre brachte die Forschung weitere Komponenten ans Licht: timeless (tim: Sehgal et al., 1994), Clock (Clk: Allada et al., 1998), cycle (cyc: Rutila et al., 1998), double-time (dbt: Price et al., 1998 ), vrille (vri: Blau and Young, 1999), shaggy (sgg: Martinek et al., 2001), Par domain protein 1 (Pdp 1: Cyran et al., 2003), CKIIa/b (Akten et al., 2003; Blau et al., 2003; Lin et al., 2002) und PP2A (Sathyanarayanan et al., 2004). Auffallend ist, dass sich nahezu alle, in der Natur identifizierten circadianen Systeme auf ein ähnliches Prinzip stützen: eine negative Rückkopplungsschleife auf molekularer Ebene (Abb. 3).

An der Ausbildung der beschriebenen Schleife sind sowohl zentrale Komponenten beteiligt, die für die Oszillation verantwortlich sind, als auch solche, die den Rhythmus modifizieren. In Drosophila findet man zwei vernetzte Rückkopplungsschleifen, die durch

DNA

Ein Transkriptionsfaktor (TF) induziert durch Bindung an die DNA die Genexpression (+). Die RNA wird transkribiert und zum Protein translatiert, das anschließend seine eigene Expression hemmt (-). Die Synchronisation erfolgt über einen Zeitgeber. Dessen Signal wird durch Rezeptoren aufgenommen und beeinflusst die Konzentrationen beteiligter RNAs oder Proteine durch eine nachgeschaltete Signalkaskade.

die Gene Clk und cyc verbunden werden. Während in der Hauptschleife die Transkription der essentiellen Komponenten PER und TIM gesteuert wird, reguliert die Nebenschleife die Transkriptionsfaktoren vrille und Pdp1 (Abb. 4).

Die Gene Clk und Cyc kodieren für Transkriptionsfaktoren sowohl mit einer bHLH-Domäne (basic Helix-Loop-Helix), die unter anderem zur Dimerisierung beider Proteine dient, als auch mit einer PAS-Domäne (Per-Arndt-Sim), die den CLK-CYC-Heterokomplex und dessen DNA-Bindung stabilisiert (Erbel et al., 2003). Beide Proteine bilden in aktiver Form einen Heterodimer, der an die E-Box-Sequenzen (hexamerische DNA Struktur: 5'-CACGTG-3') bestimmter Gene bindet (Kyriacou and Rosato, 2000).

Ähnlich period und timeless sind auch sie zentrale Komponenten der circadianen Uhr, da Mutationen in einem dieser Gene zum Verlust der Schlupf- und Lokomotorrhythmik führen (zusammengefasst bei Stanewsky, 2002a).

Die E-Box von period liegt ca. 500 bp upstream in einer 69 bp großen circadianen Regulatorsequenz (CRS). Dieser Sequenzbereich ist für rhythmische period m-RNA Oszillationen in-vivo, räumliche Expression und rhythmisches Lokomotorverhalten ausreichend und notwendig (Hao et al., 1997; Hao et al., 1999; Darlington et al., 2000;

Lyons et al., 2000). Mutationen in den E-Box-Sequenzen von period und timeless führen nicht zum Zusammenbruch rhythmischer Transkription, sondern lediglich zu gedämpften Transkriptionslevels (Hao et al., 1997; McDonald et al., 2001). Folglich tragen Sequenzbereiche außerhalb der period E-Box essentiell zur Regulation räumlicher period Expression und rhythmischer Lokomotorrhythmik bei (Lyons et al., 2000).

In der Hauptschleife induziert der CLK-CYC-Dimer die Transkription von period und timeless (Abb. 5; Darlington et al., 1998; Lee et al., 1999). Daraufhin wandern m-RNAs

CLK CYC CLK

CYC PDP1PDP1 VRIVRI

I II

vom Zellkern ins Zytoplasma, wo sie in Proteine translatiert werden. Das PER-Protein wird durch die Kinase DBT phosphoryliert, wodurch es instabil wird (Kloss et al., 1998, Price et al., 1998).

Phosphoryliertes PER-Protein wird durch das F-Box-Protein SLIMB erkannt, ubiquitiniert und durch das Proteasom abgebaut (Abb. 7; Grima et al., 2002). Die Kinase SGG phosphoryliert TIM (Martinek et al., 2001), welches das PER-Protein bindet und dessen Proteolyse verhindert. Die Proteinphosphatase 2a dephosphoryliert das PER Protein, wodurch dessen Abbau verzögert und die Dimerbildung begünstigt wird (Sathyanarayanan et al., 2004). PER und TIM akkumulieren im Zytoplasma, bis sich nach ca. 6 Stunden der Heterodimer auflöst und beide Proteine getrennt in den Nukleus wandern (Meyer et al., 2006; Shafer et al., 2002; Curtin et al., 1995). Die Kinase DBT tritt ebenfalls in den Zellkern ein (Kloss et al., 2001). Im Nukleus dimerisieren PER und TIM erneut (Meyer et al., 2006), hemmen den aktiven CLK-CYC-Dimer und stoppen somit ihre eigene Transkription (Lee et al., 1998; Lee et al., 1999; Bae et al., 2000).

period

Abb. 5. Die molekulare Rückkopplungsschleife von PER und TIM

Ein Heterodimer der beiden Transkriptionsfaktoren CLK und CYC bindet an die E-Box-Sequenzen von period und timeless, um deren Transkription zu initiieren. Die m-RNA wandert ins Zytoplasma und wird dort in die Proteine PER und TIM translatiert, die einen Dimer bilden. Beide Proteine wandern getrennt in den Zellkern, um dort als Dimer die Transkriptionsfaktoren CLK und CYC zu inhibieren, wodurch ihre eigene Transkription gestoppt wird. An der Regulation dieser Rückkopplungsschleife sind auch die Kinasen DBT, SGG und CKII, sowie die Phosphatase PP2a beteiligt (siehe Text).

Der Eintritt von PER und TIM in den Zellkern wird durch die Kinasen CKII und shaggy unterstützt (Akten et al., 2003; Lin et al., 2005; Lin et al., 2002, Martinek et al., 2001), während DBT jenen Vorgang zu verzögern scheint (Bao et al., 2001). Diese drei Kinasen werden konstitutiv exprimiert, wohingegen bei den beiden regulatorischen Untereinheiten der PP2a, TWS (twins) und WDB (widerborst) die Expression in einem 24 h Rhythmus stattfindet (Sathyanarayanan et al., 2004). Dies offenbart deren wichtige Rolle bei der post-translatorischen Regulation der PER-Oszillation (durch Phosphorylierung bzw.

Dephosphorylierung).

Die Expression von cyc erfolgt konstitutiv. Dagegen regulieren zwei weitere Transkriptionsfaktoren in der Nebenschleife die rhythmische CLK-Transkription (Abb. 6):

Während PDP1 (bZIP; PAR=Proline and acidic rich) die CLK Expression induziert, wird diese durch VRILLE (bZIP= basic Leucine zipper) reprimiert. Anfangs aktiviert CLK-CYC die Expression von vrille und Pdp1 (Cyran et al., 2003). Verursacht durch die zeitlich verzögerte Transkription akkumulieren die Proteine jedoch zu unterschiedlichen Zeiten im Zytoplasma. VRILLE erreicht sein Maximum in der frühen Nacht (ZT 13-17) und unterdrückt die weitere Transkription von CLK (Glossop et al., 2003), bis diese ca. 3-4 h später durch PDP1 erneut angeregt wird (Cyran et al., 2003). Dadurch erreicht die Clk m-RNA zwischen ZT 22 und ZT 4 ihr Maximum im Zytoplasma. Während des Tages sind dort die Level an VRI und PDP1 niedrig, an CLK hingegen hoch, was wiederum zur Bildung des Heterodimers zusammen mit CYC führt. Daraufhin wandert dieser in den Zellkern, um von Neuem die Expression von vri und Pdp1 zu aktivieren. Somit schließt sich dieser Zyklus.

Die Expression von Clk verläuft also antiphasisch zur period und timeless m-RNA (Lee et al., 1998; So and Rosbash, 1997; Sehgal et al., 1995; Hardin et al., 1990). Somit stellt sich die Frage, warum gerade während des Tages trotz des hohen Levels an CLK, und folglich an CLK-CYC, nur wenig period und timeless m-RNA vorhanden ist. PER und TIM inhibieren den CLK-CYC-Dimer lediglich gegen Ende der Nacht und in den frühen Morgenstunden (Darlington et al., 1998; Lee et al., 1998; Lee et al., 1999). Jedoch konnte gezeigt werden, dass das CLK-Protein einer post-translatorischen Regulation unterliegt (Kim et al., 2002) und darüber hinaus einen rhythmischen Wechsel in der Phosphorylierung aufweist (Yu et al., 2006; Kim et al., 2006). Realisiert wird dies unter anderem durch die beiden Antagonisten DBT und PP2a, da deren Wechselwirkung in Form von Phosphorylierung bzw. Dephosphorylierung die Stabilität des CLK-Proteins reguliert (Kim et al., 2006; Yu et al., 2006).

Auf diese Weise akkumuliert das hyperphosphorylierte CLK-Protein zu jenem Zeitpunkt, in dem CLK-CYC durch PER inhibiert bzw. PER hyperphosphoryliert wird (Yu et al., 2006; Kim et al., 2002; Lee et al., 1998; Bae et al., 2000).