Diagnostik von HCoV-Infektionen

Abgesehen von SARS werden HCoV assoziierte Infekte normalerweise nicht diagnostiziert, da die resultierende Symptomatik relativ mild und die Infektionen selbstlimitierend sind. Antivirale Medikamente sind kaum vorhanden und selten erforderlich. Wie die meisten respiratorischen Viren können Coronaviren nicht einfach durch klinisch apparente Merkmale festgestellt werden. Hierfür wird labortechnische Diagnostik benötigt, die größtenteils zum Zwecke klinischer und epidemiologischer Studien durchgeführt wird (Lai et al., 2007).

3.1 Virusisolierung und Elektronenmikroskopie

Isolierung von humanen Coronaviren und ihre Kultivierung direkt aus Patientenmaterial ist oft sehr schwierig. HCoV-229E kann in humanen diploiden Zelllinien, wie MRC-5 vermehrt werden, während HCoV-OC43 meist Organkultursysteme benötigt. Laboradaptierte OC43-Stämme replizieren allerdings in verschiedenen Zelllinien. SARS-CoV und HCoV-NL63 wurden u. a. in Meerkatzen Nierenzellen erfolgreich kultiviert (Lai et al., 2007), während HCoV-HKU1 bislang noch nicht in Zellkultur vermehrt werden konnte (Drosten, C., pers. Komm.). Obwohl die Elektronenmikroskopie einen wichtigen Beitrag bei der Identifizierung und

Charakterisierung von Coronaviren geleistet hat (Ksiazek et al., 2003), dient sie nicht standardmäßig zu diagnostischen Zwecken, da andere Partikel in klinischen Proben ähnlich wie Coronaviren aussehen können und darüber hinaus ein hoher Titer im zu untersuchenden Material benötigt wird. Die elektronenmikroskopische Visualisierung Coronavirus-ähnlicher Partikel wird meist nur noch bei Kleinkindern und Säuglingen mit Durchfallerkrankungen durchgeführt (Lai et al., 2007).

3.2 Nukleinsäurenachweis mittels RT-PCR

In einer Vielzahl diagnostischer Verfahren werden Nukleinsäuretechniken routinemäßig zum schnellen und sicheren Erregernachweis herangezogen. So stellen real-time RT-PCR Assays eine sehr sensitive Methode zur HCoV-Detektion dar. Weniger als fünf RNA-Kopien pro Reaktionsansatz können reproduzierbar nachgewiesen werden (Emery et al., 2004). Allerdings muss das Probenmaterial von guter Qualität sein und entsprechend sorgfältig gehandhabt werden. In klinischen Untersuchungen lassen sich meist Nasenabstriche, Bronchiallavage oder auch Serum als Ausgangsmaterial verarbeiten. Zur allgemeinen Coronavirus-Detektion können universelle Oligonukleotide herangezogen werden, die die Amplifikation konservierter Genombereiche (z. B. Regionen der ORFs 1a/1b) erlauben. Durch entsprechendes PCR-Primerdesign, kann durch Amplifikation typspezifischer, variabler Bereiche eine sehr hohe Spezifität erreicht werden. So lassen sich in einem einzigen Ansatz die fünf humanpathogenen CoV Stämme unterscheiden (Adachi et al., 2004; Moes et al., 2005; Stephensen et al., 1999). Die exzellente Sensitivität erhöht jedoch auch die Gefahr falsch-positiver Ergebnisse aufgrund von Kontaminationen.

Die Nukleinsäurediagnostik eignet sich vor allem zum Nachweis akuter Infektionen, da mit beginnender Rekonvaleszenz Coronaviren komplett aus dem System entfernt werden und somit nicht mehr direkt nachweisbar sind.

3.3 Serologische Methoden

Zur HCoV-spezifischen Antikörperbestimmung in humanem Serum oder Plasma werden mehrere serologische Methoden wie Neutralisationstest, Immunfluoreszenz (IF), Enzyme-linked Immunoassay (EIA) und Western-Blotting (WB) in verschiedenen

Varianten eingesetzt (Bermingham et al., 2004; Han et al., 2004a; Sizun et al., 1998;

Woo et al., 2004c). Als Antigene treten hierbei Pseudoviren, synthetisierte Peptide und rekombinante Strukturproteine (S, E, M, N) immer weiter in den Vordergrund (Temperton et al., 2005; Wang et al., 2003). Die Entwicklung von Tests zur Diagnose von SARS-CoV-Infektionen wird durch rekombinante Techniken immens erleichtert, da die Viruspropagierung in Zellkultur, welche BSL-3 Einrichtungen erfordert, vermieden werden kann. SARS spezifische IFAs und ELISAs erreichen je nach Antigen und zu detektierender Immunglobulin-Subklasse (IgA, IgM, IgG) meist eine Sensitivität und Spezifität zwischen 90 und 98% (Bermingham et al., 2004), gelegentlich auch mehr (Yu et al., 2007). Der diagnostische Nutzen serologischer Assays ist auch für akute SARS-CoV-Infektionen offensichtlich, da IgM und IgG Serokonversion oft bereits wenige Tage nach Krankheitsbeginn festgestellt werden kann (Hsueh et al., 2004; Yu et al., 2007).

Zur Früherkennung von SARS wird auch der Einsatz neuartiger Proteomik-Technologien wie SELDI-TOF diskutiert. Bei dieser Methode werden diagnostische und prognostische Biomarker in Körperflüssigkeiten (z. B. das Akutphase-Protein Serum Amyloid A, SAA) identifiziert. Durch einen Vergleich mit Kontrollseren von gesunden Probanden ist eine schnelle Diagnose und eine Überwachung des Krankheitsverlaufs möglich (Kang et al., 2005; Yip et al., 2005).

Der direkte Virusnachweis mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern kann die RT-PCR Methodik ergänzen, ist aber in der Regel weniger empfindlich und kommt allenfalls in Sonderfällen zum Einsatz. Virusdetektion in Nasenabstrichen wurde für HCoV-229E und HCoV-HKU1 von Gerna et al. beschrieben (Gerna et al., 2007). Ebenso konnte das SARS Nukleokapsid Protein in Serumproben von akut an SARS erkrankten Patienten direkt nachgewiesen werden (Li et al., 2005b).

Serologische Methoden sind unerlässlich, um etwa positive RT-PCR Ergebnisse zu bestätigen oder bei negativen Resultaten eine Infektion gänzlich auszuschließen. Für großflächig angelegte epidemiologische Untersuchungen und Überwachung der Seroprävalenz humaner Coronaviren im großen Maßstab, sollten immunologische Testverfahren weiter entwickelt werden.

3.4 Nachweis erregerspezifischer T-Zellen

Der Nachweis erregerspezifischer Lymphozyten bei viralen Erkrankungen gilt als sehr effiziente Methode, um Aufschlüsse über eine akute oder bereits überwundene Infektion zu erhalten.

T-Zellen lassen sich allgemein in zwei Klassen unterteilen. T-Helferzellen sind durch Expression von CD4-Molekülen auf ihrer Oberfläche charakterisiert. Sie können von antigenpräsentierenden Zellen (APZ; Makrophagen, dendritische Zellen, B-Lymphozyten) aufgenommene, prozessierte und als Peptide auf HLA-Klasse-II-Molekülen geladene Antigene erkennen. Die dadurch aktivierten T-Helferzellen steuern die zelluläre Immunantwort durch Produktion von TNF - -2 (TH 1-Subtyp) und aktivieren den humoralen Arm des Immunsystems durch Sezernierung von IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13 (TH2-Subtyp). CD8⁺ zytotoxische T-Zellen hingegen lysieren ihre Zielzellen. Sie erkennen in Assoziation mit HLA-Klasse-I-Molekülen lineare Epitope endogener Herkunft, die also von der Zelle selbst oder von intrazellulären Parasiten, wie etwa Viren, synthetisiert wurden. HLA-Klasse-I assoziierte Peptide besitzen eine Länge von nur 8-11 Aminosäuren, während auf HLA-Klasse-II-Moleküle geladene Peptide meist 12-16 AS umfassen (Zinkernagl, 2005). Die T-Zellantwort ist somit äußerst spezifisch. Für jedes HLA-Molekül existieren mehrere Allele und in der Regel wird ein bestimmtes Peptid nur von einem einzigen HLA-Typ präsentiert. Einerseits wird hierdurch die Spezifität weiter erhöht, andererseits aber auch die Kenntnis des HLA-Genotyps des Patienten und die Verfügbarkeit des entsprechenden Peptids vorausgesetzt. Diese HLA-Restriktion kann durch den Einsatz vollständiger viraler Proteine, worauf meist mehrere Epitope vorhanden sind, umgangen werden (Barabas, 2007).