Desoxyribonukleinsäuren (DNA)

3.1.4.1 Vektoren

Vektor Resistenzen Replikon Herkunft/Referenz

pcDNAI.Neo kn^R ColE1, SV40, M13 Invitrogen^â

pUC19 amp^R ColE1 Promega

pEGFP.N1 kn^R ColE1, SV40, M13 Clontech

M13mp19 - M13 Amersham LIFE SCIENCE

3.1.4.2 Rekombinante Plasmide

Rekombinante Plasmide

Vektor Funktionelle Bereiche

Herkunft

pRSA468 pUC19 PhoA SCHÜLEIN et al., 1992

M13.V2R M13.mp19 V2R SCHÜLEIN et al., 1996a

Rekombinante Plasmide

Vektor Funktionelle Bereiche

Herkunft

Plasmide mit V2R-cDNA für das COS.M6 und HEK293 Zellexpressionssystem

pRCDN2.∆336-340 pcDNAI.Neo V2R, kn^R diese Arbeit

pRCDN2.∆L62-R64 pcDNAI.Neo V2R, kn^R diese Arbeit

pRCDN2.L62P pcDNAI.Neo V2R, kn^R diese Arbeit

pRCDN2.E335Q pcDNAI.Neo V2R, kn^R diese Arbeit

pRCDN2.L339A pcDNAI.Neo V2R, kn^R diese Arbeit

pRCDN2.L340A pcDNAI.Neo V2R, kn^R diese Arbeit

pRCDN2.L339/340A pcDNAI.Neo V2R, kn^R diese Arbeit

pRCDN2.L339I pcDNAI.Neo V2R, kn^R diese Arbeit

pRCDN2.L340I pcDNAI.Neo V2R, kn^R diese Arbeit

pRCDN2.L339/340I pcDNAI.Neo V2R, kn^R diese Arbeit

pRCDN2.L339T pcDNAI.Neo V2R, kn^R diese Arbeit

pRCDN2.L340T pcDNAI.Neo V2R, kn^R diese Arbeit

pRCDN2.L339/340T pcDNAI.Neo V2R, kn^R diese Arbeit

Plasmide mit V2R-c-myc-Markierung für das COS.M6 Zellexpressionssystem

pRCDN2.Nmyc pcDNAI.Neo V2R-c-myc-Fusion, kn^R

ANDERSEN-BECKH et al., 1999 pRCDN2.E335Q.Nmyc pcDNAI.Neo V2R-c-myc-Fusion, kn^R diese Arbeit pRCDN2.L339T.Nmyc pcDNAI.Neo V2R-c-myc-Fusion, kn^R diese Arbeit pRCDN2.L340T.Nmyc pcDNAI.Neo V2R-c-myc-Fusion, kn^R diese Arbeit pRCDN2.L339/340T.Nmyc pcDNAI.Neo V2R-c-myc-Fusion, kn^R diese Arbeit Plasmide mit V2R-PhoA-Fusionsproteinen für das COS.M6 Zellexpressionssystem

pEU367.PhoA pcDNAI.Neo V2R-PhoA-Fusion, kn^R SCHÜLEIN et al.,

1996b pEU367.E335Q.PhoA pcDNAI.Neo V2R-PhoA-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU367.L339I.PhoA pcDNAI.Neo V2R-PhoA-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU367.L340I.PhoA pcDNAI.Neo V2R-PhoA-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU367.L339/340I.PhoA pcDNAI.Neo V2R-PhoA-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU367.L339T.PhoA pcDNAI.Neo V2R-PhoA-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU367.L340T.PhoA pcDNAI.Neo V2R-PhoA-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU367.L339/340T.PhoA pcDNAI.Neo V2R-PhoA-Fusion, kn^R diese Arbeit

pEU71.PhoA pcDNAI.Neo V2R-PhoA-Fusion, kn^R SCHÜLEIN et al.,

1996b pEU71.CT.PhoA pcDNAI.Neo V2R-PhoA-Fusion, kn^R diese Arbeit

Rekombinante Plasmide

Vektor Funktionelle Bereiche

Herkunft

pEU71.CT.E335Q.PhoA pcDNAI.Neo V2R-PhoA-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU71.CT.L339I.PhoA pcDNAI.Neo V2R-PhoA-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU71.CT.L340I.PhoA pcDNAI.Neo V2R-PhoA-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU71.CT.L339/340I.PhoA pcDNAI.Neo V2R-PhoA-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU71.CT.L339T.PhoA pcDNAI.Neo V2R-PhoA-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU71.CT.L340T.PhoA pcDNAI.Neo V2R-PhoA-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU71.CT.L339/340T.PhoA pcDNAI.Neo V2R-PhoA-Fusion, kn^R diese Arbeit Plasmide mit V2R-GFP-Fusionsproteinen für das COS.M6 und HEK293 Zellexpressionssystem

pEU367.GFP pEGFP-N1 V2R-GFP-Fusion, kn^R diese Arbeit

pEU367.∆L62-R64.GFP pEGFP-N1 V2R-GFP-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU367.L62P.GFP pEGFP-N1 V2R-GFP-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU367.E335Q.GFP pEGFP-N1 V2R-GFP-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU367.L339I.GFP pEGFP-N1 V2R-GFP-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU367.L340I.GFP pEGFP-N1 V2R-GFP-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU367.L339/340I.GFP pEGFP-N1 V2R-GFP-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU367.L339T.GFP pEGFP-N1 V2R-GFP-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU367.L340T.GFP pEGFP-N1 V2R-GFP-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU367.L339/340T.GFP pEGFP-N1 V2R-GFP-Fusion, kn^R diese Arbeit

pEU71.CT.GFP pEGFP-N1 V2R-GFP-Fusion, kn^R diese Arbeit

pEU71.CT.E335Q.GFP pEGFP-N1 V2R-GFP-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU71.CT.L339T.GFP pEGFP-N1 V2R-GFP-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU71.CT.L340T.GFP pEGFP-N1 V2R-GFP-Fusion, kn^R diese Arbeit pEU71.CT.L339/340T.GFP pEGFP-N1 V2R-GFP-Fusion, kn^R diese Arbeit

3.1.4.3 Oligonukleotide

Bezeichnung Sequenz (5’→→→→3’) Verwendung

P∆336-340 CAGCGTGTCCTCCTCAGAGCT

CTGCTGCTGTGCCCGG

Deletion der Aminosäuren 336 bis 340 des V2-Rezeptors

P∆L62-R64 5’ CCTGGTGCTGGCGGCCCGGGG

CCGGCGGGGCC

Aminosäuredeletion L62, A63 und R64 beim V2-Rezeptor

P∆L62-R64 3’ GGCCCCGCCGGCCCCGGGCCG

CCAGCACCAGG

Aminosäuredeletion L62, A63 und R64 beim V2-Rezeptor

PA5 5’ CTGGGCCTGCTTTGCG PCR-Oligonukleotid für Umklonierung

des C-Terminus des V2-Rezeptors und für diverse Sequenzierungen

PBA2 BamHI 3’ CCTCACGATGAAGGATCCTTG GCCAGGG

Einführung einer BamHI-Schnittstelle für die Umklonierung des C-Terminus des V2-Rezeptors

PBA2 BamHI 5’ CCCTGGCCAAGGATCCTTCAT CGTGAGG

Einführung einer BamHI-Schnittstelle für die Umklonierung des C-Terminus des V2-Rezeptors

PDL-BglII 3’ CTGCTGCTGAAAGATAGATCT

ATCCAGGGGTTGGTG

Einführung einer BglII-Schnittstelle für die Umklonierung des C-Terminus des V2-Rezeptors

PDL-BglII 5’ CACCAACCCCTGGATAGATCT

ATCTTTCAGCAGCAG

Einführung einer BglII-Schnittstelle für die Umklonierung des C-Terminus des V2-Rezeptors

PL62P 3’ CCACGACCGCCGGGGTCGAGC Aminosäureaustausch L62P beim V2-Rezeptor

PL62P 5’ GGTGCTGGCGGCCCCAGCTCG Aminosäureaustausch L62P beim V2-Rezeptor

PE335Q CAGCAGCGTGTCCTCACAGCT

GCGAAGCTTGC

Aminosäureaustausch E335Q beim V2-Rezeptor

PL339I CAGAGCTGCGAAGCATTCTCT

GCTGTGCCCG

Aminosäureaustausch L339I beim V2-Rezeptor

PL340I GCTGCGAAGCTTGATTTGCTG

TGCCCGG

Aminosäureaustausch L340I beim V2-Rezeptor

Bezeichnung Sequenz (5’→→→→3’) Verwendung

PL339/340I CAGAGCTGCGAAGCATTATTT

GCTGTGCCCGGGG

Aminosäureaustausch L339/340I beim V2-Rezeptor

PL339T CAGAGCTGCGAAGCACTCTCT

GCTGTGCCCG

Aminosäureaustausch L339T beim V2-Rezeptor

PL340T CAGAGCTGCGAAGCTTGACTT

GCTGTGCCCGGGGGAC

Aminosäureaustausch L340T beim V2-Rezeptor

PL339/340T CAGAGCTGCGAAGCACTACTT

GCTGTGCCCGGGG

Aminosäureaustausch L339/340T beim V2-Rezeptor

PSP6 3’ TCACAAAGATCCTCTAGC PCR-Oligonukleotid für Umklonierung des C-Terminus des V2-Rezeptors und für diverse Sequenzierungen

PT339A 3’ CGGGCACAGCAGAGAGCGCTT

CGCAGCTCTG

Aminosäureaustausch T339A bei pRCDN2.L339T

PT339A 5’ CAGAGCTGCGAAGCGCTCTCT

GCTGTGCCCG

Aminosäureaustausch T339A bei pRCDN2.L339T

PT340A 3’ CCGGGCACAGCAAGCCAAGCT

TCGCAGC

Aminosäureaustausch T340A bei pRCDN2.L340T

PT340A 5’ GCTGCGAAGCTTGGCTTGCTG

TGCCCGG

Aminosäureaustausch T340A bei pRCDN2.L340T

PT339/340A 3’ CCCGGGCACAGCAAGCAGCGC

TTCGCAGCTCTG

Aminosäureaustausch T339/340A bei pRCDN2.L339/340T

PT339/340A 5’ CAGAGCTGCGAAGCGCTGCTT GCTGTGCCCGGG

Aminosäureaustausch T339/340A bei pRCDN2.L339/340T

3.1.5 Flüssigmedien und Agarplatten für E. coli

Sofern nichts vermerkt ist, wurden sowohl die Flüssigmedien als auch die Medien mit Agarzusatz 15 min bei 120 °C autoklaviert. Für das Gießen der Agarplatten wurden pro Petrischale (∅ 100 mm) ca. 25 ml der auf 55 °C abgekühlten Flüssigkeit verwendet.

Medien:

Luria Bertani (LB)-Medium (Typ Lennox)

Peptone 140 Hefeextrakt NaCl H2O

16 g 10 g 5 g ad 1 l

LB-Agarplatten Wie LB-Medium; vor den Autoklavieren werden jedoch 12,5 g Agar pro l hinzugefügt.

H Top-Agar Peptone 140

NaCl Agar H2O

10 g 8 g 8 g ad 1 l LB-Medium für

QuikChange™

Wie LB-Medium; nach dem Autoklavieren werden folgende Chemikalien pro l hinzugefügt:

1 M MgCl2 12,5 ml

1 M MgSO4 12,5 ml

2 M Glukose (steril filtriert) 10 ml

3.1.6 Antibiotika und andere Medienzusätze

Allen Agarplatten und Flüssigmedien wurden bei Bedarf nach dem Autoklavieren Antibiotika und andere hitzeempfindliche Komponenten zugesetzt. Bei Agarplatten wurde der heiße Agar auf ca. 45 °C abgekühlt, bevor die entsprechenden Substanzen hinzugefügt wurden.

Konzentrationen der verwendeten Antibiotika und Medienzusätze:

Antibiotikum Stammlösung Flüssigmedium Agarplatten Ampicillin 100 mg/ml H2O 100 µg/ml 100 µg/ml Tetracyclin 10 mg/ml Ethanol 10 µg/ml 10 µg/ml

Kanamycin 30 mg/ml H2O 30 µg/ml 30 µg/ml

IPTG 100 mM - 0,1 mM

X-Gal 40 mg/ml DMFA - 40 µg/ml

Im Dokument Charakterisierung einer transportrelevanten Domäne im intrazellulären C-Terminus des humanen Vasopressin-V2-Rezeptors (Seite 40-47)