3.2 Methoden
3.2.17 Bindungsexperimente mit [ 3 H]AVP
Exponieren Nach dem Trocknen der Nitrozellulose wird ein X-OMAT-Röntgenfilm (Kodak) aufgelegt. Die Exposition erfolgt je nach Signalstärke zwischen 1-5 Tagen.
3.2.17.1.1 Bindungsversuch nahe dem Sättigungsbereich
Hier wird nur eine AVP Konzentration (10 nM) nahe dem Sättigungsbereich der V2-Rezeptor-Sättigungskurve verwendet, um eine vorläufige Angabe der Bindungskapazität der Mutanten zu erhalten.
Die spezifische Bindung wird über die gemessene totale- und nicht spezifische Bindung berechnet. Jede Mutante sowie die Positiv- und Negativkontrolle werden im dreifach Ansatz gemessen.
Die 24-Well-Platte wird während des ganzen Versuches auf ein mit Eis unterfüttertes Tablett gestellt. Zuerst wird das Medium abgesaugt und jedes Well 1x mit eiskaltem Waschpuffer gewaschen (2 ml pro Well). Zur Bestimmung der totalen Bindung werden 450 µl Bindungspuffer mit 10 nM [3H]AVP in jedes Well pipettiert (3 Wells pro Mutante). Zur Bestimmung der unspezifischen Bindung werden 450 µl Verdrängungspuffer in jedes Well gegeben (3 Wells pro Mutante). Es folgt eine Inkubation bei 4 °C für 2 Stunden. Anschließend werden die Wells 3x schnell mit Waschpuffer gewaschen (je 2 ml). Die Zellen werden dann mit 500 µl Lysis-Puffer (60 °C) lysiert und 30 min bei RT inkubiert. Das Lysat wird in ein 5 ml Szintillationsgefäß überführt und mit 4 ml Aquasafe 300 Plus vermischt. Die Proben werden mit Hilfe eines ß-Counters ausgewertet.
Um die spezifische Bindung zu berechnen, wird die unspezifische von der totalen Bindung abgezogen. Ferner werden der Mittelwert und die Standardabweichung berechnet.
3.2.17.1.2 Sättigungskurve
Bindungsversuchs zwischen 0,1 und 50 nM AVP, mit immer verdoppelten [3 H]AVP-Konzentrationen abgedeckt, d.h. für jede Mutante, Positivkontrolle und Negativkontrolle werden 10 einzelne Bindungsversuche mit verschiedenen [3 H]AVP-Konzentrationen durchgeführt (s. 3.2.17).
Zusätzlich müssen noch vier Wells mit gleicher Zelldichte ausgesät werden, mit denen die Zellzahl (zwei Wells) und der Proteingehalt (zwei Wells) bestimmt wird, um später die Anzahl der Bindungsstellen pro Zelle berechnen zu können. Außerdem, werden aus jedem Bindungspufferansatz 450 µl entnommen, mit 4 ml Szintillator gemischt und im ß-Counter gemessen, um die eingesetzte Aktivität zu bestimmen.
3.2.17.1.2.1 Berechnung der KD und BMAX
Die gemessenen Zerfälle pro Minute (dpm) bei den Ansätzen zur Bestimmung der totalen und unspezifischen Bindung sowie bei denen im Bindungspuffer (mit 0,5-50 nM [3H]AVP) werden in das RADLIG Programm eingegeben. Die KD- und BMAX -Werte werden durch eine iterative, nicht lineare Regression berechnet.
3.2.17.1.2.2 Zellzählung
Die Zellen aus 2 Wells werden in einer Neubauer-Zählkammer gezählt (s. 3.2.13; das PBS-Volumen beträgt hier nur 1 ml und das der STV-Lösung nur 500 µl pro Well).
3.2.17.1.2.3 Proteinkonzentrationsbestimmung
Die Zellen aus 2 Wells werden mit je 500 µl NaOH (60 °C) lysiert. Es werden je 5 µl entnommen und die Proteinkonzentrationen wie unter 3.2.14 bestimmt.
3.2.17.1.2.4 Berechnung der Anzahl der Bindungsstellen pro Zelle
Anhand der Werte von BMAX (Mol/l), Zellzahl pro Well (n), Inkubationsvolumen in ml (V) und Proteinkonzentration in mg/l (P) wird die Anzahl der Bindungsstellen pro Zelle (N) und pro mg Protein (Np) (fmol/mg Prot.) berechnet.
BMAX x n
(1000 / V) x 6,23E+23
=
N BMAX
= Np
P x 1E+15
3.2.17.2 [3H]AVP-Bindung an Gesamtmembranen
Bei diesem Versuch werden die Zellen vor dem Bindungsversuch aufgeschlossen, wodurch die AVP-Bindung an intrazellulären Rezeptoren untersucht werden kann. In dieser Arbeit wurde nur die [3H]AVP-Bindung im Sättigungsbereich (50 nM [3H]AVP) bestimmt.
Reagenzien
PBS (s. 3.2.13)
1 N HCl-Lösung HCl 1 N
Tris-ME5 Tris HCl
EGTA MgCl2
50 mM 2 mM
10 mM → pH 7,2 Bacitracin-Stocklösung Bacitracin
H2O
2,13 g ad 10 ml
(Thermische Behandlung: 1 Stunde bei 70 °C)
Aprotinin-Stocklösung Aprotinin H2O
0,15 g ad 10 ml Tris-BAME Puffer Tris-ME
Bacitracin-Stocklösung Aprotinin-Stocklösung
500 ml 500 µl 500 µl [3H]AVP-Lösung [3H]AVP
Tris-BAME (pH 7,4)
10 nM
AVP-Lösung AVP
Tris-BAME (pH 7,4)
0,4 mM
Polyethylenimin-Puffer Polyethylenimin 0,1% (w/v)
Aquasafe 300 Plus
5Bei der Herstellung des Tris-ME Puffers muss zuerst Tris (6,057 g) und EGTA (0,761 g) in etwa 800 ml H2O gelöst werden. Der pH wird dann mit 1 N HCl-Lsg. auf 7,5 eingestellt. Anschließend wird MgCl2 (2,033 g) hinzugefügt und der pH mit der 1 N HCl-Lsg. auf 7,2 eingestellt. Zuletzt, wird die Lsg.
mit H2O auf 1 l aufgefüllt.
Durchführung
Eine mit transient transfizierten COS.M6-Zellen konfluent bewachsene 60er Schale (s.
3.2.13) wird 2x mit je 2 ml eiskaltem PBS gewaschen. Die Zellen werden in 1 ml PBS mit einem Schaber vom Boden abgelöst. Die Zellsuspension wird abzentrifugiert (400 g, 5 min, 4 °C), das Pellet in 1 ml Tris-BAME aufgenommen und im Dounce Homogenisator mit 10 Impulsen bei 800 rpm lysiert. Anschließend wird die Suspension bei 26000 g für 35 min bei 4 °C abzentrifugiert und das Pellet in 500 µl Tris-BAME resuspendiert. Danach werden 10 µl der Membransuspension für die Proteinkonzentrationsbestimmung entnommen.
Nach Bestimmung der Proteinkonzentration (s. 3.2.14) wird die Membransuspension auf 0,5 µg Protein/µl mit Tris-BAME verdünnt (Membran-Stocklösung). Für die totale Bindung werden im vierfachem Ansatz 100 µl Membran-Stocklösung mit 50 µl [3H]AVP-Lösung und 50 µl Tris-BAME gemischt. Für die nicht spezifische Bindung werden ebenfalls vier Ansätze hergestellt, nur dass hier die 50 µl Tris-BAME-Lösung durch 50 µl AVP-Lösung ersetzt werden. Alle Ansätze werden 2 Stunden bei 25 °C im Schüttelwasserbad inkubiert.
Im Anschluss daran werden die Proben durch ein in Polyethylenimin-Puffer präinkubiertes Wathman Filterpapier in einer Harvester-Anlage gesaugt. Die Membranen binden dabei an die Filter. Die Filter werden 2x mit PBS gewaschen, ausgeschnitten und in einem 5 ml Szintilationsgefäß mit 4 ml Aquasafe 300 Plus versetzt. Die Proben werden im ß-Counter gemessen und mit Hilfe des GraphPad Prism Programms (Version 3.00) ausgewertet. Die spezifische Bindung ergibt sich aus der Differenz von totaler und nichtspezifischer Bindung.
3.2.18 Adenylylzyklase-Versuch
Reagenzien
Homogenisierungspuffer (HP) Saccharose EDTA HEPES H2O
27% (w/v) 1 mM 20 mM
ad 500 ml (pH →7,8) Rehomogenisierungspuffer
(RP)/2% BSA
EDTA HEPES BSA H2O
1 mM 20 mM 2% (w/v)
ad 500 ml (pH → 7,8) AVP Verdünnungsreihe AVP
RP/2% BSA
0-10000 nM ad 120 µl Forskolin-Lösung Forskolin
RP/2% BSA
1 mM ad 60 µl
PGE1-Lösung PGE1
RP/2% BSA
1 mM ad 60 µl
PBS (s. 3.2.13)
ReaMix Tris-HCl MgCl2
EDTA IBMX cAMP ATP GTP DTT
Creatine Phosphokinase Phosphocreatin
BSA [α32P]ATP H2O
166,66 mM 13,33 mM 6,66 mM 3,33 mM 3,33 mM 0,33 mM 0,03 mM 3,33 mM 51 mg 13,2 mg 60 mg
0,75 µCi pro Säule ad 3 ml
Stopp-Lösung ATP
cAMP SDS [3H]cAMP H2O
4 mM 1,4 mM 2% (w/v)
0,0125 µCi pro Säule ad 250 ml
Imidazol Puffer Imidazol
H2O
0,1 M
ad 1 l (pH → 7,4) Durchführung
Eine mit transient transfizierten HEK293-Zellen konfluent bewachsene 60er Schale (s.
3.2.13) wird 2x mit je 3 ml eiskaltem PBS gewaschen. Die Zellen werden mit einem Schaber vom Boden abgelöst und in 1 ml PBS aufgenommen. Die Zellsuspension wird abzentrifugiert (400 g, 5 min, 4 °C), das Pellet in 1 ml HP aufgenommen und im Dounce Homogenisator mit 10 Impulsen bei 750 rpm lysiert. Anschließend wird das Homogenat bei 20000 g bei 4 °C für 10 min abzentrifugiert und das Pellet in 500 µl
Die frischen oder aufgetauten Membranen werden zu einer Konzentration von 40 µg/
20 µl mit RP/2% BSA verdünnt und bei 4 °C gelagert. 10 µl der AVP Verdünnungsreihe (0,3; 1; 3; 10; 30; 100; 1000; 1000; 100000 nM) werden in 5 ml Plastikröhrchen bei 4 °C vorgelegt. Als Negativkontrolle dienen 10 µl RP/2% BSA, als Positivkontrollen 10 µl Forskolin-Lösung und 10 µl PGE1-Lösung. Einzelne Messpunkte werden jeweils als Triplikat angesetzt. Die Röhrchen werden in einem Wasserbad auf 32 °C erwärmt. In jedes Röhrchen werden 70 µl ReaMix pipettiert und dann im 15 Sekunden Abstand jeweils 20 µl Membransuspension. Die Reaktion wird nach 20 min mit 500 µl Stopp-Lösung abgebrochen zugegeben.
Das fertige Reaktionsgemisch (600 µl) wird auf Dowex-Säulen pipettiert. Die Röhrchen werden mit 1000 und danach mit 1800 µl H2O gespült. Beide Spülungen werden ebenfalls auf die Dowex-Säulen gegeben. Wenn die Flüssigkeit ausgetropft ist, werden die Dowex-Säulen auf Alox-Säulen umgesetzt und mit 5 ml H2O gespült.
Nachdem die Flüssigkeit durch die Alox-Säulen getropft ist, werden 2 ml Imidazol-Puffer pro Säule zugegeben. Wenn keine Flüssigkeit mehr aus den Säulen tropft, werden die Säulen auf 20 ml Szintillationsgefäße gestellt und mit 3 ml Imidazol-Puffer eluiert. Das Eluat wird anschließend mit 13 ml Szintillator verdünnt. Die Messung erfolgt im ß-Counter. Die [3H]- und [32P]-Aktivitäten werden mit Hilfe des Microsoft Excel Programms ausgewertet. Das gebildete cAMP in (pmol) × (mg Protein)-1× (min)-1 wird mit folgender Formel berechnet:
[32P] x EST x 10000 [3H] x ESP x Prot x 20 min [cAMP] =
Dabei ist [32P] die gemessene [32P]-Aktivität in cpm, EST der Tritium-Einsatz pro Säule in cpm, [3H] die gemessene [3H]-Aktivität in cpm, ESP der [32P]-Einsatz pro Säule in cpm und Prot die eingesetzte Proteinmenge pro Säule in mg.
Anschließend werden die Daten mit Hilfe des GraphPad Prism Programms (Version 3.00) analysiert und der EC50 Wert über eine nicht lineare Regression ermittelt. Die Daten werden in einer Verlaufskurve dargestellt.
3.2.19 Immunfluoreszenzstudien
Reagenzien
PBS (s. 3.2.13)
IF-Fixierpuffer PFA HEPES Saccharose
2,5% (w/v) 100 mM 100 mM Permeabilisierungs-Puffer Triton X-100â
PBS
0,1% (v/v)
Monoklonale Maus-anti-c-myc-Antikörper
1:100 in PBS
Polyklonales Cy™3- konjugiertes-Ziege-anti-Maus IgG
1:400 in PBS
Mountingmedium PBS
Glyzerin DABCO
1 Volumen 1 Volumen 100 mg/ml Nagellack
Durchführung
Für den Versuch werden mit Lipofectamin™ transient transfizierte COS.M6-Zellen auf einem Deckglas (∅ 33 mm) 1-2 Tage nach der Transfektion verwendet. Das Deckglas mit den Zellen wird 1x mit PBS gewaschen, 30 min in IF-Fixierpuffer inkubiert und anschließend erneut 2x mit PBS gewaschen.
Wenn gewünscht, können die Zellen jetzt mit Permeabilisierungs-Puffer behandelt werden (3 min, RT). Danach muß 2x mit PBS gewaschen werden.
PBS) in einer feuchten Kammer inkubiert. Anschließend wird das Deckglas 3x 10 min mit jeweils frischem PBS gewaschen. Die Deckgläser werden dann in einer feuchten Kammer bei 37 °C für 1 Stunde mit Cy™3-konjugiertem-Ziege-anti-Maus IgG (1:400 in PBS) inkubiert.
Nach dreimaligem Waschen mit PBS gibt man etwa 10 µl Mountingmedium auf einen Objektträger und legt das Deckglas mit den Zellen nach unten auf. Nach dem Trocknen wird der Rand mit Nagellack abgedichtet. Das Präparat kann nach 2 Stunden am LSM untersucht werden. Hierbei wird eine Anregungswellenlänge (λexc) von 525 nm und eine Emissionswellenlänge (λem) von 568 nm verwendet.
3.2.20 Mikroskopie an lebenden Zellen
Für diese Studien werden transient transfizierte COS.M6- und HEK293-Zellen verwendet, die GFP-Fusionsproteine exprimieren.
Die Zellen werden auf Deckgläser (∅ 33 mm) ausgesät (s. 3.2.13.1) und transient mit Lipofectamin™ oder SuperFect™ transfiziert (s. 3.2.13.2 oder 3.2.13.3). Je nach Zelldichte werden die Zellen nach 1 oder 2 Tagen für den Versuch verwendet.
Das Deckglas wird 2x mit PBS gewaschen, in eine Kammer eingespannt und mit 1 ml PBS bedeckt. Die GFP-Fluoreszenzen werden dann bei einer λexc= 488 nm und λem≥ 515 nm mit dem LSM untersucht. Es werden sowohl x/y-Scans als auch z-Scans aufgenommen.
Trypanblau Färbung
Mit Trypanblau kann man an intakten Zellen die Plasmamembran färben.
Durchführung
Nach Aufnahme der GFP-Fluoreszenzen werden unter dem Mikroskop 50 µl Trypanblau (0,05% (w/v)) zu den Zellen pipettiert. Die Trypanblaufluoreszenz wird nach einer 1 min Inkubation (λexc= 543 nm, λem≥ 690 nm) aufgenommen.
Rhodamin 6G Färbung (TERASAKI UND REES, 1992)
Mit Rhodamin 6G kann man an lebenden Zellen das ER färben.
Durchführung
Nach Aufnahme der GFP-Fluoreszenz werden unter dem Mikroskop 50 µl Rhodamin 6G (5 µM) zu den Zellen pipettiert. Die Rhodamin 6G-Fluoreszenz wird nach 20 min Inkubation (λexc= 543 nm, λem≥ 570 nm) aufgenommen.