Die Trennung von Transkription und Translation bietet nicht nur den Vorteil der Kontrolle der Genexpression, sie macht auch einen selektiven Transport zwischen dem Zellkern und dem Zytoplasma notwendig, damit die spezifische Zusammensetzung beider Kompartimente erhalten bleibt. Die Kernhülle erweist sich hierbei als eine Barriere, welche diese Aufgabe erfüllt und einen selektiven Transport gewährleistet. Auf diese Weise wird ein unspezifischer Eintritt von Makromolekülen in den Zellkern unterbunden (Stewart, 2007). Um einen selektiven Transport von Makromolekülen zwischen Zytoplasma und Zellkern über die Kernhülle zu ermöglichen sind die Kernporenkomplexe in diese Hülle eingelassen und bilden so einen wässerigen Kanal mit selektiven Eigenschaften (Maco et al., 2006; Schwartz, 2005; Tran and Wente, 2006). Moleküle mit einem Molekulargewicht bis 40 kDa ist es möglich den Kernporenkomplex passiv zu durchqueren, Moleküle mit einem höheren Molekulargewicht interagieren mit löslichen Molekülen, den Transportrezeptoren, um den NPC passieren zu können. Der Prozess dieses selektiven Transportes zwischen Zytoplasma und Zellkern bezeichnet man als nukleozytoplasmatischen Transport (Cook et al., 2007; Stewart, 2007).
1.2.1 Der Kernporenkomplex
Der Kernporenkomplex ist ein makromolekularer Komplex aus über 30 verschiedenen Proteinen. Viele dieser Proteine liegen in mehrfachen Kopien vor und bilden eine achtfache Symmetrie (Cronshaw et al., 2002; Rout et al., 2000). Der NPC der Vertebraten besitzt eine Abmessung von ca. 1450 x 800 Å und ein Molekulargewicht von ca. 100-125 MDa (Akey and Radermacher, 1993; Cronshaw et al., 2002; Yang et al., 1998).
Im Allgemeinen gliedert sich der NPC in mehrere Bereiche (Abb. 2). Auf der zytoplasmatischen Seite der Kernhülle befinden sich die zytoplasmatischen Filamenten, welche an der Erkennung und Bindung von Transportkomplexen beteiligt sind. In der Mitte des Komplexes befindet sich ein Gerüst, welches sich aus einem zytoplasmatischen Ring, einem Speichenring und einem nukleären Ring zusammensetzt. Dieses Gebilde umschließt den Zentralkanal, welcher den Transportprozess vermittelt. Auf der nukleären Seite befindet sich am NPC eine Korb ähnliche Struktur (engl. nuclear basket). Dies Struktur setzt sich dabei aus nukleären Filamenten zusammen, die sich am distalen Ende zu der Korb ähnlichen Struktur zusammen schließen und mit dem nukleären Ring des zentralen Kanals in Verbindung stehen (Beck et al., 2004, 2007; Sorokin et al., 2007).
Der NPC ist über die Proteine gp210, POM121 und POM152 in der Kernhülle verankert (Panté and Aebi, 1996; Söderqvist et al., 1997). In der Mitte des zentralen Kanals befinden sich Kernporenproteine (Nups), die Phenylalanin-Glycin (FG) reiche Wiederholungen (FG-repeats) besitzen. Diese Proteine generieren durch die FG-repeats ein hydrophobes Netzwerk, welches den zentralen Kanal des NPC ausfüllt und den Eingang in den Nukleus darstellt, es entsteht somit eine hydrophobe Umgebung (Denning and Rexach, 2007; Frey and Görlich, 2009; Frey et al., 2006; Mohr et al., 2009).
Abb. 2: Darstellung vom Aufbaus eines Kernporenkomplex (NPC). Schematische Darstellung eines Kernporenkomplex in Seitenansicht (A) und Rekonstruktion der Kernporenstruktur auf Basis von Kryo-Elektronentomatographie Daten (B und C). Der NPC gliedert sich auf der zytoplasmatischen Seite in die zytoplasmatischen Filamenten (CyF) am zytoplasmatischen Ring (CR). Ein zentraler Ring, der Speichenring (SR) verbindet den zytoplasmatischen Ring mit dem nukleären Ring (NR). Im Zellkern bildet der NPC eine korbähnliche Struktur, den nuclear basket (NB), aus den nukleären Filamenten (NF) und einem distalen Ring (DR). B) Sicht von der zytoplasmatischen Seite. C) Querschnitt durch den NPC in der Kernmembran (ONM= äußere Kernmembran, INM= innere Kernmembran). Das NPC Modell http://sspatel.googlepages.com; © 2000-2006 Samir S. Patel entnommen.
B modifiziert nach Beck et al., 2004, C entnommen Beck et al., 2007
Kleinere Moleküle bis zu einem Molekulargewicht von 40 kDa können durch dieses hydrophobe Netzwerk passiv diffundieren. Größere Moleküle, hydrophile Proteine oder auch solche, deren Passage durch den Kernporenkomplex streng reguliert werden muss,
werden durch das hydrophobe Netzwerk der Kernpore an der Passage durch den NPC gehindert (Cook et al., 2007; Paine et al., 1975; Peters, 2006; Weis, 2007). Um die Kernporenkomplexe passieren zu können, müssen Moleküle, welche größer als 40 kDa sind, aktiv durch den NPC transportiert werden. Für diesen Vorgang sind lösliche Faktoren notwendig, die Transportrezeptoren (Cook et al., 2007; Stewart, 2006; Conti et al., 2005;
Görlich und Kutay, 1999).
1.2.2 Der rezeptorvermittelte Kerntransport
Der Transport von Molekülen über 40 kDa zwischen dem Zellkern und dem Zytoplasma wird von löslichen Faktoren, den Kerntransportrezeptoren, vermittelt. Es gibt drei Familien: 1. Ein komplexes ATP abhängiges mRNA Exportsystem, 2. Ein einfaches System zum Transport der kleinen GTPase Ran in den Kern bestehend aus einem Faktor und 3. Das Ran abhängige System der Importinβ-Superfamilie. Die Mehrheit der Kerntransportrezeptoren zählt zu den Proteinen der 3. Familie, der Importinβ-Superfamilie oder auch β-Karyopherine (Abb. 3). Sie lassen sich in zwei Klassen unterteilen, in Importrezeptoren (Importine) und in Exportrezeptoren (Exportine). Importine vermitteln den Import von Makromolekülen in den Zellkern, wohingegen Exportine den Export von Makromolekülen aus dem Zellkern in das Zytoplasma ausführen (Cook et al., 2007;
Madrid and Weis, 2006) (Abb. 4). Die Proteine der Importinβ-Superfamilie selbst bestehen aus einem sich wiederholenden Motiv, dem sogenannten HEAT-repeat (Huntingtin, elongation factor 3, PR65/A subunit of protein phosphatase 2A und TOR lipid kinase), welches wiederum aus ungefähr 40 Aminosäuren besteht (Abb. 3A). Ein HEAT-repeat besteht aus zwei antiparallel verlaufenden α-Helices (bekannt als A und B-Helix), die durch eine kurze Schleife von einander getrennt werden. Durch eine leichte Drehung und Neigung der beiden Helices eines HEAT-repeats zueinander entsteht die superhelikale Struktur der Transportrezeptoren (Chook and Blobel, 1999, 2001; Cingolani et al., 1999;
Cook et al., 2007; Lee et al., 2005; Matsuura and Stewart, 2004; Vetter et al., 1999a).
Der am besten untersuchte Vertreter dieser Proteinfamilie ist in Abb. 3 dargestellt. Sie zeigt die Kristallstruktur des humanen Importinβ als cartoon- Modell, eingefärbt in rot und gelb nach der jeweiligen Helix des HEAT-repeat und deren Lage. Die Transportrezeptoren, sowie der NPC sind die Hauptkomponenten des Kerntransports.
Der Kerntransport an sich gliedert sich in den Import von Makromolekülen (Substrat auch als Cargo bezeichnet) in den Zellkern und in den Export von Makromolekülen aus dem Zellkern in das Zytoplasma (Abb. 4).
A B
Abb. 3: Strukturelle Organisation von Transportproteinen der Importinβ-Superfamilie. A) Typische Anordnung der zwei Helices eines HEAT-repeat Motivs. In der Cartoon Darstellung ist ein HEAT-repeat des Importinβ (Impβ) gezeigt (Cingolani et al., 1999). Typisch, die A-Helix (rot) bildet die äußere, konvexe Oberfläche des Moleküls und die B-Helix (gelb) die innere, konkave Oberfläche. A- und B-Helix interagieren hauptsächlich via hydrophober Seitenketten in der eingeschlossenen Spalte. Die kleine Neigung der A-Helix zur B-Helix führt letztlich zur Bildung der superhelikalen Struktur der β-Karyopherine. B) Dargestellt ist die Kristallstruktur von Importinβ im Komplex mit der Importinβ-Bindedomäne von Importinα (orange) (IBBα, Cingolani et al., 1999). IBBα ist als Cartoon-Modell gezeigt. Impβ besteht aus 19 HEAT-repeats, das Molekül ist wie A) eingefärbt.
Die Transportrezeptoren binden ihre Transportsubstrate (Cargo, Abb.4) über Signalsequenzen. Im Kerntransport sind zwei Arten von Signalsequenzen notwendig, das Kernlokalisationssignal (engl. Nuclear Localisation Signal, NLS) und das Kernexportsignal (engl. Nuclear Export Signal, NES). Diese Signale bestehen aus Sequenzen die bestimmten Regeln folgen, wie das klassische NLS (classical Nuclear Localisation Signal, cNLS) aus einer kurzen Sequenz aus 7-8 Aminosäuren mit mindestens vier Lysinen, wie z.B. PKKKRKV (Kalderon et al., 1984; Lanford and Butel, 1984; Lanford et al., 1986) oder wie das NES mit einer Leucin reichen Sequenz, die vier typisch hydrophobe Aminosäuren beinhaltet. Außer dem cNLS und dem NES werden in der Zelle noch andere verwendet, wie z.B. das bpNLS (bipartite NLS(Robbins et al., 1991)) oder das M9-Transportsignal (Pollard et al., 1996), welches sowohl als Kernimportsignal als auch als Kernexportsignal fungiert, so dass ein Pendeln des Transportsubstrats zwischen Zytoplasma und Nukleus stattfinden kann.
Transportrezeptoren binden ihr Substrat über die Signalsequenz des Substrats. Dies kann
direkt zwischen dem Rezeptor und dem Substrat passieren oder indirekt über ein Adaptermolekül das die Interaktion von Rezeptor zu Cargo vermittelt (Fried and Kutay, 2003). Eine weitere, eher spezielle, Möglichkeit bietet ein Komplex aus zwei Transportrezeptoren, die ein Cargo binden (Baake et al., 2001; Bäuerle et al., 2002; Jäkel et al., 1999). Dabei wird das NLS von den Importinen gebunden, sowie das NES von den Exportinen.
Abb. 4: Schematische Darstellung des Kernimport und Kernexport durch Rezeptoren der Imortinβ-Superfamilie. Auf der linken Seite ist der Kernimport gezeigt. Das Importin (gold) bindet das Substrat (Cargo, magenta) im Zytoplasma. Der Komplex wird durch den NPC transportiert, wo das Cargo durch Interaktion des Rezeptors mit der GTPase Ran (grün) in GTP gebundener Form (RanGTP) frei gesetzt wird.
Auf der rechten Seite ist der Kernexport gezeigt. Ein Exportin (gelb) bindet RanGTP und folgend das Cargo.
Der ternäre Komplex wird den NPC transportiert und fällt im Zytoplasma durch GTP Hydrolyse auseinander.
Die verwendeten Komplexe und Einzelproteine stammen aus der RCSB Protein Datenbank, Cargo PDB ID 1IAL, Importin:RanGTP Komplex PDB ID 2X19, Importin: Cargo Komplex PDB ID 1QGK, RanGDP PDB ID 3GJ0, Exportin:Cargo:RanGTP Komplex PDB ID 1WA5, Exportin PDB ID 1Z3H. Die Lipiddoppelschicht wurde aus malvern.com entnommen. Das NPC wurde aus Modell http://sspatel.googlepages.com; © 2000-2006 Samir S. Patel entnommen. Für die Oberflächendarstellung der Proteine wurde Pymol verwendet
In Abb. 4 ist ein einfaches Schema des Kernimports und- exports gezeigt. Im Zytoplasma wird das Cargo über das NLS von Importinen erkannt und gebunden. Dieser entstandene Importkomplex interagiert mit einem NPC und wird in den Zellkern transferiert. Im Zellkern interagiert der Rezeptor des Importkomplexes mit der kleinen GTPase Ran (von engl. Ras related nuclear protein), die sich in GTP gebundener Form befindet (RanGTP).
Das Substrat wird freigesetzt und der Rezeptor im Komplex mit RanGTP in das Zytoplasma zurück transportiert. Durch die Hydrolyse des Ran gebundenen GTP wird der Komplex aufgelöst und das Importin steht für einen neuerlichen Transport von Makromolekülen zu Verfügung (Cook et al., 2007; Stewart, 2007). Der Kernexport läuft im Grunde sehr ähnlich ab. Im Unterschied zum Importin ist die Bindung von RanGTP an das Exportin eine Voraussetzung um das Substrat zu binden. Dieser ternäre Komplex Exportin:RanGTP:Substrat ist in der Lage mit dem NPC zu interagieren und diesen zu passieren. Im Zytoplasma führt die Hydrolyse des Ran gebundenen GTP zu GDP zum Auseinanderfallen des Exportkomplex und zur Freisetzung des Transportsubstrates. Der Kerntransport lässt sich somit in vier Schritte gliedern, 1) Bildung des Transportkomplex, 2) Transport durch den Kernporenkomplex, 3) Freisetzung des Substrates und 4) Transportrezeptor Recycling (Stewart, 2007).