Stabilisierung wird durch die erhöhte Menge des spezifischen, durch die semiquantitative RT-PCR amplifizierten Produktes der pgk1N103-mRNA nachgewiesen (Abb. 59). Somit ist im Gegensatz zu upf1∆ die Menge der pgk1N103-mRNA sowohl in Wildtyp als auch in rat8-2 und rat8-3 unter der Detektionsgrenze der in der semiquantitativen RT-PCR verwendeten Bedingungen. Daher wird in den beiden dbp5-Mutanten die pgk1N103-mRNA dem NMD-Prozess zugeführt. Zusätzlich wurden die Stabilitäten der pgk1N103-mRNA in Mutanten von SUP45 (eRF1) und SUP35 (eRF3) analysiert. In sup45-2 erfolgt ebenso wie in upf1∆ eine Stabilisierung der pgk1N103-mRNA (Abb. 59). Allerdings ist in sup45-2 diese Anreicherung der pgk1N103-mRNA im Vergleich zu upf1∆ schwächer. Im Gegensatz dazu wurde in sup35-21 keine Anreicherung der pgk1N103-mRNA beobachtet, so dass in dieser eRF3-Mutante die pgk1N103-mRNA dem NMD zugeführt wird.
Abbildung 59: Die beiden dbp5-Mutanten rat8-2 und rat8-3 besitzen im Gegensatz zu der eRF1-Mutante sup45-2 keinen Defekt im NMD-Prozess.
Die Menge der pgk1N103-mRNA von Wildtyp (WT), den dbp5-Mutanten rat8-2 und rat8-3, upf1∆, sowie den beiden Translationsterminationsmutanten, sup45-2 und sup35-21, wurde mittels spezifischer semi-quantitativer RT-PCR analysiert. Die Hefezellen wurden bis zur logarithmischen Wachstumsphase in Selektionsmedium bei 25°C angezogen und anschließend für 30 min bei 37°C inkubiert. Daraufhin wurde die Gesamt-RNA isoliert und die Menge der pgk1N103-mRNA mittels spezifischer RT-PCR semiquantitativ analysiert. Zum Ausschluss einer DNA-Kontamination wurde zum einen eine plasmidspezifische PCR des Beta-Laktamasegenes (bla), welches für die Ampicillinresistenz kodiert (ampR), durchgeführt (PK:
Positivkontrolle, Plasmid-DNA). Zum anderen wurde mittels einer RT-PCR der Actin-mRNA (act1) eine gDNA-Kontamination ausgeschlossen, da die verwendeten Primer Exon-Exon-Grenzen übergreifend waren.
Diese diente parallel als Kontrolle der gleichmäßig eingesetzten mRNA-Gesamtmenge.
4.12 Dbp5p reguliert die Sup45p-Sup35p-Interaktion und die
Durch die Behandlung der Lysate mit RNase A erfolgt eine hydrolytische Spaltung der mRNA an den Positionen, die nicht von Proteinen, z.B. den Ribosomen, geschützt werden, geht die Interaktion zwischen Dbp5p und Pab1p verloren. Diese indirekte Interaktion erfolgt daher durch die Präsenz beider Proteine auf den gleichen mRNA’s allerdings an verschiedenen Positionen, so dass Dbp5p und Pab1p nicht in einem Proteinkomplex miteinander assoziieren.
Abbildung 60: Dbp5p interagiert physikalisch mit Sup45p (eRF1), jedoch nicht mit Sup35p (eRF3).
Die in vivo Interaktion von Dbp5p mit den beiden Translationsterminationsfaktoren Sup45p (eRF1) (A) und Sup35p (eRF3) (B) wurde in Wildtyp durch eine Ko-IP von Dbp5p-myc mit Hilfe eines myc-spezifischen Antikörpers mittels Western Blot analysiert. Für die Detektion der Proteine wurden spezifische Antikörper gegen myc, GFP bzw. Por1p verwendet (L = Lysat, E = Eluat).
Für den Nachweis der physikalischen Interaktion von Dbp5p mit Sup45p bzw. Sup35p wurden weitere Ko-IP’s durchgeführt. Die Ko-IP von Dbp5p-myc zeigt eine RNase-insensitive und somit eine direkte Interaktion von Dbp5p-myc mit Sup45p-GFP, da sowohl mit als auch ohne RNase-Behandlung der Lysate Sup45p-GFP im Western Blot in den Eluaten detektiert wird (Abb. 60A). Im Gegensatz dazu ist unter gleichen Bedingungen in der Ko-IP von Dbp5p-myc keine Interaktion mit Sup35p-GFP nachweisbar (Abb. 60B).
Abbildung 61: Dbp5p interagiert physikalisch mit endogen exprimiertem Sup45p (eRF1), jedoch nicht mit endogen exprimiertem Sup35p (eRF3).
Die in vivo Interaktion von Dbp5p mit den beiden Translationsterminationsfaktoren Sup45p (eRF1) und Sup35p (eRF3) wurde in Wildtyp durch eine Ko-IP von Dbp5p-myc mit Hilfe eines myc-spezifischen Antikörpers mittels Western Blot analysiert. Für die Detektion der Proteine wurden spezifische Antikörper gegen myc, Sup45p, Sup35p bzw. Por1p verwendet (L = Lysat, E = Eluat).
Ebenso ist nach Veränderung der Bedingungen der Ko-IP, wie Pufferzusammensetzung, keine Interaktion von Dbp5p mit Sup35p (eRF3) detektierbar (Daten nicht gezeigt). Da die Interaktion zwischen Sup45p (eRF1) und Sup35p (eRF3) über die jeweiligen carboxyterminalen Regionen erfolgt, könnten die Anhänge der Proteine (GFP bzw. myc) einen störenden Einfluss auf die Detektion einer möglichen Interaktion von Dbp5p mit Sup35p (eRF3) ausüben. Aufgrund dessen wurden Ko-IP’s von Dbp5p-myc mit endogen exprimiertem Sup45p (eRF1) bzw. Sup35p (eRF3) durchgeführt. Diese Ko-IP’s zeigen ebenso eine RNase-insensitive Interaktion von Dbp5p-myc mit endogenem Sup45p, wohingegen unter gleichen Bedingungen erneut keine Interaktion mit in diesem Fall endogenem Sup35p nachweisbar ist (Abb. 61).
Abbildung 62: Die Expression der mit GFP-, myc- bzw. TAP-gekoppelten Versionen von DBP5/rat8-2, SUP45 (eRF1) bzw. SUP35 (eRF3) führt nicht zu Wachstumsdefekten.
Die Funktionalität der mit GFP-, myc- bzw. TAP-gekoppelten Versionen wurde mittels Wachstumsanalyse überprüft. Das Wachstum der jeweiligen gekoppelten Versionen wurde im Vergleich zum Wildtyp auf Vollmediumagarplatten (YPD) nach einer Inkubation von 3 Tagen bei 25°C bzw. 37°C analysiert.
Des Weiteren wurde die Funktionalität der gekoppelten Proteine mittels Wachstums-analysen von verschiedenen Hefestämmen getestet. Zum einen zeigen Hefestämme, die ausschließlich eine Expression von myc- oder GFP-gekoppeltem DBP5 bzw. der
dbp5-Mutante rat8-2 aufweisen, bei 25°C ein zu Wildtyp unverändertes Wachstum (Abb. 62). Durch die Inkubation bei 37°C sind die dbp5-Mutanten mit oder ohne Anhang aufgrund der Temperatursensitivität nicht lebensfähig. Zum anderen wachsen die temperatursensitiven Mutanten sup45-2 und sup35-21, die eine zusätzliche Expression der GFP-gekoppelten Version von SUP45 (eRF1) bzw. SUP35 (eRF3) aufweisen, bei der nicht-permissiven Temperatur von 37°C ähnlich dem Wildtyp (Abb. 62). Demzufolge werden die essentiellen Funktionen von Dbp5p, Sup45p (eRF1) bzw. Sup35p (eRF3) durch die jeweiligen gekoppelten Versionen vollständig ersetzt.
Abbildung 63: Dbp5p wird für die Rekrutierung von Sup35p (eRF3) in die Translationsterminations-komplexe benötigt.
Für die Analyse der Ko-Sedimentation wurden Wildtyp (WT) und die dbp5-Mutante rat8-2 bis zur logarithmischen Wachstumsphase bei 25°C angezogen und anschließend für 20 min bei 37°C inkubiert.
Daraufhin wurden die Lysate mittels linearer Saccharose-Dichtegradienten (15-45%) analysiert. Nach der Zentrifugation der Saccharose-Dichtegradienten für 2 h bei 40.000 rpm wurden diese fraktioniert. Die Ko-Sedimentation mit Polysomen von den in den Fraktionen enthaltenen Proteine wurde mittels einer SDS-PAGE und anschließendem Western Blot untersucht. Für die Detektion der Proteine wurden spezifische Antikörper gegen GFP und Rps3p verwendet. Da der sekundäre Antikörper gegen Kaninchen das Protein A bindet, war dieser ausreichend für die Detektion des TAP-Anhangs. Das Verhältnis der im Western Blot detektierten Proteine und deren Ko-Sedimentation mit nicht-ribosomalen bzw. ribosomalen Fraktionen wurde von 3 unabhängigen Experimenten quantifiziert (rechts). Die Fraktionen des 80S-Ribosoms (Monosom) sowie der Polysomen sind gekennzeichnet.
Bei der Translationstermination erfolgt eine direkte Assoziation von Sup45p (eRF1) mit Sup35p (eRF3), so dass über diese Interaktion der Terminationsprozess koordiniert wird.
Die physikalische Interaktion zwischen Dbp5p und Sup45p (eRF1) im Gegensatz zu der nicht detektierbaren Proteininteraktion mit Sup35p (eRF3) stellt gewissermaßen ein Paradoxon dar. Beide Terminationsfaktoren liegen in einem Proteinkomplex vor, demzufolge sollte ebenso eine Interaktion von Dbp5p mit Sup35p (eRF3) zu erwarten sein.
Um diese offensichtliche Widersprüchlichkeit zu klären, wurde die Ko-Sedimentation von Sup45p (eRF1) und Sup35p (eRF3) mit Polysomen in der dbp5-Mutante rat8-2 analysiert.
Die Saccharose-Dichtegradienten von Wildtyp und rat8-2 zeigen, dass das rat8-2p-GFP (dbp5p-GFP) im ähnlichen Verhältnis wie das wildtypische Dbp5p-GFP mit Polysomen ko-sedimentiert (Abb. 63). Daher erfolgt in rat8-2 trotz des mRNA-Exportdefekts keine reduzierte Assoziation von rat8-2p-GFP (dbp5p-GFP) mit den sich in der Translation befindlichen mRNA’s. Des Weiteren ist Sup45p (eRF1) in rat8-2 trotz reduzierter Protein-menge im gleichen Verhältnis wie in Wildtyp mit Polysomen assoziiert. Allerdings zeigt rat8-2 im Gegensatz zum Wildtyp eine stark verringerte Ko-Sedimentation von Sup35p (eRF3) mit Polysomen. Daraus lässt sich ableiten, dass in der dbp5-Mutante die Rekrutierung von Sup35p (eRF3) in den Terminationskomplex gestört ist.
Abbildung 64: Dbp5p reguliert die Sup45p (eRF1)-Sup35p (eRF3)-Interaktion.
(A) Die in vivo Interaktion von Sup45p (eRF1) und Sup35p (eRF3) wurde in Wildtyp und der dbp5-Mutante rat8-2 durch eine Ko-IP von Sup45p-TAP mit Hilfe eines Isotyp-spezifischen Antikörpers und anschließendem Western Blot analysiert. Die Hefezellen wurden dafür bis zur logarithmischen Wachstums-phase in Selektionsmedium bei 25°C angezogen und anschließend für 20 min bei 37°C inkubiert. Für die Detektion der Proteine wurden spezifische Antikörper gegen GFP bzw. Por1p verwendet. Da der sekundäre Antikörper gegen Kaninchen das Protein A bindet, war dieser ausreichend für die Detektion des TAP-Anhangs (L = Lysat, E = Eluat). (B) Die in vivo Interaktion von Sup45p (eRF1) und Sup35p (eRF3) wurde in Wildtyp, den beiden dbp5-Mutanten, rat8-2 und rat8-3, sowie in der NMD-defizienten Mutante upf1∆ durch eine Ko-IP von endogen exprimiertem Sup45p mit Hilfe eines Sup45p-spezifischen Antikörpers mittels Western Blot analysiert. Die Hefezellen wurden dafür bis zur logarithmischen Wachstumsphase in Selektionsmedium bei 25°C angezogen und anschließend für 20 min bei 37°C inkubiert. Für die Detektion der Proteine wurden spezifische Antikörper gegen Sup35p bzw. Por1p verwendet (L = Lysat, E = Eluat).
Das veränderte Verhältnis der Ko-Sedimentation von Sup35p (eRF3) mit Polysomen in rat8-2 offenbart einen Rekrutierungsdefekt von Sup35p (eRF3) in den Terminations-komplex. Demzufolge müsste die Assoziation von Sup45p (eRF1) mit Sup35p (eRF3) in
dbp5-Mutanten ebenfalls vermindert sein. Zur Analyse, ob mutiertes Dbp5p einen Einfluss auf die physikalische Interaktion zwischen den beiden Terminationsfaktoren besitzt, wurde eine Ko-IP von Sup35p-TAP mit Sup45p-GFP in rat8-2 durchgeführt. In der dbp5-Mutante ist im Vergleich zum Wildtyp kein Sup45p-GFP in den Eluaten detektierbar, so dass durch mutiertes Dbp5p die Assoziation von Sup45p (eRF1) und Sup35p (eRF3) verhindert wird (Abb. 64A). Zum Ausschluss, dass die Anhänge der Proteine (GFP bzw.
TAP) einen störenden Einfluss auf die Detektion besitzen, wurde eine Ko-IP durchgeführt, in der Antikörper gegen endogen exprimiertes Sup45p (eRF1) und Sup35p (eRF3) verwendet wurden. Die Analyse der physikalischen Interaktion beider Translations-terminationsfaktoren zeigt, dass die Assoziation von endogenem Sup35p (eRF3) mit Sup45p (eRF1) in rat8-2 und rat8-3 ebenfalls nicht vorhanden ist (Abb. 64B). Zusätzlich wurde als Kontrolle die Interaktion von Sup45p (eRF1) mit Sup35p (eRF3) in upf1∆
analysiert. In upf1∆ ist in den Eluaten im Gegensatz zu den dbp5-Mutanten Sup35p detektierbar, so dass die Deletion von UPF1 keinen zu den dbp5-Mutanten vergleichbaren Defekt in der Sup45p (eRF1)-Sup35p (eRF3) -Interaktion aufweist. Demzufolge ist Dbp5p für die Rekrutierung von Sup35p (eRF3) verantwortlich und reguliert über diese Funktion die Interaktion zwischen den beiden Terminationsfaktoren Sup45p (eRF1) und Sup35p (eRF3).
5 Diskussion
Für die einzelnen Prozesse bei der Genexpression, beginnend mit der Transkription bis hin zur Translation, und deren Regulation werden zahlreiche Proteine benötigt. Viele dieser Proteine sind nicht nur in einem Prozess involviert, sondern verbinden mehrere Prozesse miteinander. So besitzen beispielsweise die mRNA-bindenden Proteine nicht nur beim mRNA-Export wichtige Funktionen, sondern können ebenso an der Transkription bzw. an der Regulation dieser beteiligt sein. Zu den mRNA-bindenden Proteinen gehört das pendelnde SR-Protein Npl3p aus S. cerevisiae, welches am mRNA-Export involviert ist und im Gegensatz zu anderen pendelnden, mRNA-bindenden Proteinen mit Polysomen assoziiert. Neben Npl3p besitzt die mRNA-bindende DEAD-Box RNA-Helikase Dbp5p essentielle Funktionen beim mRNA-Export. Obgleich dieses Protein vorwiegend an der Zellkernmembran angereichert vorliegt, um die Translokation der mRNA durch den NPC zu gewährleisten, ist das Protein ebenfalls im Zytoplasma lokalisiert und assoziiert mit Polysomen. Aufgrund dieser Tatsachen ist die Aufklärung etwaiger zytoplasmatischer Funktionen beider Proteine von besonderem Interesse.