Dbp5p hat eine Funktion bei der Translationstermination

Um einen Anhaltspunkt zu finden, in welcher Phase der Translation Dbp5p eine Funktion besitzt, wurde eine Suppressionsanalyse in temperatursensitiven Translationsmutanten durchgeführt. Somit wurde untersucht, ob die Überexpression von DBP5 das Wachstum dieser Mutanten bei nicht-permissiven Temperaturen verbessert. Die 24 für die Suppressionsanalyse verwendeten unterschiedlichen Hefestämme besitzen spezifische Mutationen in Proteinen, die eine Funktion in verschiedenen Phasen der Translation aufweisen (Tab. 20). Die Überexpression von DBP5 wurde zum einen durch die Verwendung eines 2µ-Plasmides erreicht, da dieses im Vergleich zu einem CEN-Plasmid (1-2 Kopien pro Zelle) in hoher Kopienanzahl (20-80 Kopien pro Zelle) in den Hefezellen vorliegt. Zum anderen wurde eine im Vergleich zum 2µ-Plasmid stärkere Überexpression durch den Austausch der Promotorregion von DBP5 mit einem Galaktose-induzierbaren Promotor erzielt. Bei Verwendung des Galaktose-induzierbaren DBP5-Konstruktes wurde anstatt Glukose ausschließlich Galaktose als Kohlenhydratquelle für die Anzucht verwendet, da die Anwesenheit von Glukose zur Repression der DBP5-Expression führt.

Die Wachstumsanalyse der Mutanten zeigt, dass die Überexpression von DBP5 in pab1-53, sup45-2 und sup35-21 bei nicht-permissiven Temperaturen im Vergleich zum Leervektor zu einem positiven Wachstumseffekt führt (Tab. 20 und Abb. 48).

Tabelle 20: Übersicht der Ergebnisse der Wachstumsanalysen von den verwendeten Translations-mutanten mit einer Überexpression von DPB5.

Translations-phase Protein Gen(e) in S. cerevisiae

Mutanten in S. cerevisiae

Suppression des Wachstums durch DBP5-Überexpession

Initiation

eIF4A TIF1 & TIF2 tif1-1 tif2∆

-

eIF4B TIF3 tif3∆

-

eIF4G TIF4631 & TIF4632

tif4631∆ tif4632-1 tif4631∆ tif4632-6 tif4631∆ tif4632-8 tif4631∆ tif4632-430 tif4631∆ tif4632-N300 tif4631∆ tif4632-459

-

eIF4E CDC33 cdc33-1

-

eIF3 PRT1 prt1-1

-

Ded1 DED1

ded1-21 ded1-120

ded1-199

-

Elongation eEF2 TEF1 & TEF2

tef1∆ tef2-2 tef1∆ tef2-3 tef1∆ tef2-4 tef1∆ tef2-7 tef1∆ tef2-9 tef1∆ tef2-10 tef1∆ tef2-13

-

Termination

Pab1 PAB1 pap1-16

pab1-101

pab1-53

+

eRF1 SUP45 sup45-2

+

eRF3 SUP35 sup35-21

+

Diese Mutanten, in denen eine spezifische Suppression des temperatursensitiven Wachstumsdefektes erfolgt, weisen wichtige Funktionen bei der Translationstermination auf. Im Gegensatz dazu führt die Überexpression von DBP5 in Mutanten der Translations-initiationsfaktoren eIF4A, eIF4B, eIF4G und eIF3 zu keiner verbesserten Wachstumsrate (Tab. 20 und Abb. 49). Beispielsweise bleibt das Wachstum der Mutante der an der Translationsinitiation beteiligten Helikase eIF4A durch die Überexpression von DBP5 im Vergleich zum Leervektor unverändert (Abb. 49A). Ebenso ist nach Überexpression von DBP5 in eEF2-Mutanten, z.B. tef1∆ tef2-9 und tef1∆ tef2-10, die Defekte in der Translationselongation aufweisen, keine Suppression der bei höheren Temperaturen auftretenden Wachstumsdefekte zu erkennen (Tab. 20 und Abb. 49B). Weitere Mutanten der in der Translationsinitiation involvierten DEAD-Box RNA-Helikase DED1, beispiels-weise ded1-199 und ded1-120, zeigen mit einer Überexpression von DBP5 bei

nicht-permissiven Temperaturen kein verbessertes Wachstum im Vergleich zu einem Leervektor (Tab. 20 und Abb. 49C). Zusammenfassend zeigen die Suppressionsanalysen, dass das Wachstum von Mutanten der Translationsinitiations- und Translationselongations-faktoren durch die Überexpression von DBP5 unverändert ist, wohingegen Wachstums-defekte von Mutanten der Translationsterminationsfaktoren supprimiert werden.

Abbildung 48: Eine Überexpression von DBP5 supprimiert die Wachstumsdefekte der Translations-terminationsmutanten pab1-53, sup45-2 und sup35-21.

Das Wachstum von Wildtyp (WT) in Anwesenheit eines Leervektors (2µ) sowie in pab1-53, sup45-2 und sup35-21 in Anwesenheit eines Leervektors (2µ) bzw. eines Plasmides, das DBP5 überexprimierte (2µ DBP5 bzw. 2µ GAL1DBP5), wurde nach einer Inkubation von 3-5 Tagen bei den angegebenen Temperaturen auf Vollmediumagarplatten mit Galaktose (YPG) analysiert. Zur Kontrolle der gleichmäßigen Zellanzahl wurde das Wachstum der Hefestämme auf Vollmediumagarplatten mit Glukose (YPD) nach einer Inkubation von 3 Tagen bei 25°C analysiert.

Die durch die spezifische Suppression der Wachstumsdefekte ermittelte genetische Interaktion von DBP5 mit PAB1 sowie mit beiden Terminationsfaktoren SUP45 (eRF1) und SUP35 (eRF3) sollte durch Herstellung der Doppelmutanten und der darauf folgenden Wachstumsanalyse unterstützt werden. Durch Kreuzung der dbp5-Mutanten, rat8-2 und rat8-3, mit sup45-2, sup35-21 sowie den pab1-Mutanten, pab1-16, pab1-53 und pab1-101, und anschließender Tetradendissektion wurden die Doppelmutanten in Anwesenheit eines DBP5-exprimierenden Plasmides mit einer URA3-Resistenz hergestellt. Im Anschluss wurde das Wachstum der Hefestämme in seriellen Verdünnungen auf FOA-Agarplatten analysiert, auf denen ausschließlich Hefezellen wachsen können, die URA3 auxotroph sind

und somit das DBP5-exprimierende Plasmid verloren haben. Für die Wachstumskontrolle wurden die verwendeten Hefestämme parallel auf -URA-Agarplatten analysiert.

Abbildung 49: Eine Überexpression von DBP5 supprimiert nicht die Wachstumsdefekte von Translationsinitiations- oder Translationselongationsmutanten.

Das Wachstum von Wildtyp (WT) in Anwesenheit eines Leervektors (2µ), der Translationsinitiationsmutante tif1-1 tif2∆, den Translationselongationsmutanten tef1∆ tef2-9 und tef1∆ tef2-10 sowie den beiden Mutanten der in der Translationsinitiation involvierten DEAD-Box RNA-Helikase DED1, ded1-199 und ded1-120, in Anwesenheit eines Leervektors (2µ) bzw. eines Plasmides mit einer Überexpression von DBP5 (2µ

GAL1DBP5) wurde nach einer Inkubation von 3-5 Tagen bei den angegebenen Temperaturen auf Vollmedium-agarplatten mit Galaktose (YPG) analysiert. Zur Kontrolle der gleichmäßigen Zellanzahl wurde das Wachstum der Hefestämme auf Vollmediumagarplatten mit Glukose (YPD) nach einer Inkubation von 3 Tagen bei 25°C analysiert.

Die Einzelmutanten rat8-2, rat8-3, sup45-2, sup35-21, pab-16, pab1-53 und pab1-101 weisen ein zum Wildtyp vergleichbares Wachstum auf FOA-Agarplatten bei 25°C auf, wohingegen die Kombination einer dbp5-Mutantion (rat8-2 oder rat8-3) mit sup45-2 zu einer synthetischen Letalität führt (Abb. 50). Die Doppelmutante rat8-3 sup35-21 ist ebenfalls synthetisch letal und rat8-2 sup35-21 weist ein stark eingeschränktes Wachstum im Gegensatz zu den Einzelmutanten auf. Eine synthetische Letalität tritt ebenfalls bei einer Kombination von sup45-2 mit sup35-21 auf, so dass dieser Effekt vergleichbar zu

dem von rat8-2 sup45-2, rat8-3 sup45-2 sowie rat8-3 sup35-21 ist. Starke Wachstums-defekte zeigen die Doppelmutanten von DBP5 (rat8-2 bzw. rat8-3) mit PAB1 (pab1-16, pab1-53 bzw. pab1-101) im Vergleich zu den entsprechenden Einzelmutanten (Abb. 50).

Zusammenfassend bestätigen diese starken Wachstumsdefekte bzw. die synthetischen Letalitäten der dbp5-Doppelmutanten die in den Suppressionsanalysen ermittelten genetischen Interaktionen von DBP5 mit PAB1, SUP45 (eRF1) und SUP35 (eRF3).

Abbildung 50: DBP5 zeigt genetische Interaktionen mit PAB1 und den Translationsterminations-faktoren SUP45 (eRF1) und SUP35 (eRF3).

Das Wachstum von Wildtyp (WT), den beiden dbp5-Mutanten, rat8-2 und rat8-3, den beiden Translations-terminationsmutanten, sup45-2 und sup35-21, und den pab1-Mutanten, pab1-53, pab1-16 und pab1-101, wurde im Vergleich zu den dbp5-Doppelmutanten auf FOA-Agarplatten, die auf den Verlust des DBP5-exprimierenden Plasmides bzw. im Fall der eRF-Doppelmutante (sup45-2 sup35-21) auf den Verlust des SUP45/SUP35-exprimierenden Plasmides selektionieren, nach einer Inkubation von 3 Tagen bei 25°C analysiert. Zur Kontrolle der gleichmäßigen Zellanzahl wurde das Wachstum der Hefestämme nach einer Inkubation von 3 Tagen bei 25°C auf -URA-Agarplatten analysiert.

Um auf eine spezifische genetische Interaktion von DBP5 mit SUP45 (eRF1) und SUP35 (eRF3) schließen zu können, wurde zusätzlich die genetische Interaktion von DHH1 (DDX6; RCK/p54 in Säugern) mit den beiden Translationsterminationsfaktoren analysiert.

Dhh1p, eine weitere DEAD-Box RNA-Helikase, ist im Gegensatz zu Dbp5p nicht essentiell ist und hat eine Funktion im NMD-Prozess (Tseng-Rogenski et al., 2003; Coller und Parker, 2005). Durch Kreuzung von dhh1∆ mit sup45-2 sowie sup35-21 und anschließender Tetradendissektion wurden die Doppelmutanten in Anwesenheit eines SUP45/SUP35-exprimierenden Plasmides mit einer URA3-Resistenz hergestellt. Im Anschluss wurde das Wachstum der Hefestämme in seriellen Verdünnungen auf FOA-Agarplatten analysiert, die auf den Verlust des SUP45/SUP35-exprimierenden Plasmides selektionieren. Das Ergebnis zeigt, dass die Doppelmutanten dhh1∆ sup45-2 und dhh1∆ sup35-21 bei 25°C ein zu den Einzelmutanten vergleichbares Wachstum auf FOA-Agarplatten aufweisen (Abb. 51).

Abbildung 51: DHH1 zeigt keine genetische Interaktionen mit den Translationsterminationsfaktoren SUP45 (eRF1) und SUP35 (eRF3).

Das Wachstum von Wildtyp (WT), der Deletionsmutante der in NMD involvierten DEAD-Box RNA-Helikase DHH1, dhh1∆, sowie den beiden Translationsterminationsmutanten, sup45-2 und sup35-21, wurde im Vergleich zu den dhh1-Doppelmutanten auf FOA-Agarplatten, die auf den Verlust des SUP45/SUP35-exprimierenden Plasmides selektionieren, nach einer Inkubation von 3 Tagen bei 25°C analysiert.

4.10.2 Die katalytische Aktivität von Dbp5p wird bei der