3.2 Die T-Zell-Antwort auf die FSME-Virusinfektion
3.2.4 Das FSME-Virus repliziert nicht effizient in T-Zellen
Neben den DC-Subtypen können auch die T-Zellen einen möglicherweise wichtigen Faktor bei der Verbreitung des FSME-Virus im menschlichen Wirt darstellen. Dabei könnten die T-Zellen sogar als Shuttle bzw. als Art „Trojanisches Pferd“ für das FSME-Virus bei der Passage der Blut-Hirn-Schranke fungieren. Sie könnten aber auch von dem FSME-Virus zur Replikation benutzt werden und sich somit weiter im menschlichen
Körper zu verbreiten. Ob das FSME-Virus auch in den T-Zellen repliziert, wurde anhand einer Replikationsanalyse untersucht. Dabei wurde der Virustiter der Zellkulturüberstände mittels TCID50 und einer zusätzlichen Zellviabilitätsanalyse der Vero-B4 Indikatorzellen anhand des MTT-Assays durchgeführt.
3.2.4.1 Replikationsanalyse
Um zu untersuchen, ob das FSME-Virus in den T-Zellen repliziert und diese somit als Verbreitungsfaktor in Frage kommen, wurden die Titer der Zellkulturüberstände der T-Zellen, die mit dem FSME-Virus infiziert wurden, von T-Zellen, die mit UV-inaktivierten FSME-Virus kokultiviert wurden, mittels TCID50-Analyse (s. Kapitel 2.2.2.3) bestimmt. Neben der Virustiterbestimmung der Zellkulturüberstände wurde zusätzlich der Virustiter des Inputvirus bestimmt, um die Restinfektiosität dieser Virussuspension nach 72 h bei 37 °C in zellfreier Umgebung zu ermitteln. Die Bilder der TCID50-Analysen von den einzelnen Verdünnungstufen, bei denen noch ein CPE zu erkennen war und kein CPE mehr sichtbar war, sind in der Abbildung 3.23 dargestellt.
Die Ergebnisse der TCID50-Analysen der T-Zellkulturüberstände sind zusammenfassend in der Abbildung 3.24 aufgeführt.
In der Abbildung 3.23 sind die jeweiligen Verdünnungsstufen des TCID50 mit den T-Zellüberständen sowie der Ausgangssuspension des Virus, dem Inputvirus und der Mock-Kontrolle dargestellt, bei denen bei den Vero-B4 Indikatorzellen noch ein CPE sichtbar war (linke Seite) und bei denen kein CPE mehr bei den Vero-B4-Indikatorzellen mehr sichtbar war (rechte Seite). Zur besseren Veranschaulichung sind die aus den TCID50-Analysen berechneten Virustiter (s. Kapitel 2.2.2.3) zusammenfassend in der Abbildung 3.24 dargestellt.
Mock
CPE kein CPE
10-8
10-4
10-4
10-9
10-5
10-5
10-3 10-2
10-1
20 µm
T-Zellen infiziert mit FSMEV-Hypr
FSMEV-Hypr Stock
T-Zellen kokultiviert mit FSMEV-HyprUV FSMEV-Hypr
(Rest-infektiosität)
Abbildung 3.23: Darstellung der mikroskopischen Fotos der TCID50-Analysen der T-Zellkulturüberstände auf Vero-B4-Indikatorzellen.
Auf der linken Seite sind die Verdünnungsstufen abgebildet, bei denen bei den Vero-B4 Indikatorzellen noch ein CPE zu erkennen war und rechts die jeweiligen Verdünnungsstufen, bei denen kein CPE mehr erkennbar war. Die jeweiligen Verdünnungsstufen sind den Bildern rechts unten zugewiesen. In der Abbildung sind der Reihenfolge nach von oben bis unten folgende Bilder aufgeführt: Titration des Virusstocks als Positivkontrolle (FSMEV-Hypr Stock), Titration der Überstände der T-Zellen, die mit dem FSMEV-Stamm Hypr infiziert wurden, (T-Zellen infiziert mit FSMEV-Hypr), Titration der Überstände der T-Zellen, die mit dem UV-inaktivierten FSMEV-Stamm Hypr kokultiviert wurden (T-Zellen kokultiviert mit FSMEV-HyprUV), und die Titration des Inputvirus als Nachweis für die Restinfektiosität (FSMEV-Hypr (Restinfektiosität). Auf dem unteren Bild ist die Mock-Kontrolle abgebildet (pDCs Mock).
Aus der Abbildung 3.24 wird ersichtlich, dass der Virustiter in den Zellkulturüberständen der T-Zellen, die mit den FSME-Virus infiziert wurden, knapp unter dem Titer liegt, der noch in der Inputvirus-Kontrolle vorhanden ist. Der Titer der T-Zellüberstände beläuft sich auf 1,8 x 105 TCID50 / ml und der Titer des Inputvirus auf 3,61 x 105 TCID50 / ml.
Das bedeutet, dass die Restinfektiösität des FSME-Virus fast gleich mit der Infektiösität des Virus in den Überständen der infizierten T-Zellen ist und es scheint somit, dass sich das FSME-Virus nicht wesentlich in den T-Zellen vermehrt hat. Der Titer der Ausgangssuspension des FSME-Virus, die als Positivkontrolle mitgeführt wurde, liegt fast 3 log-Stufen über den Virustitern des Inputvirus und des T-Zellüberstandes.
1,0E+00
Abbildung 3.24: Graphische Darstellung der Ergebnisse der TCID50-Anaylsen der T-Zell-Kulturüberstände.
In der Abbildung sind die Titer der einzelnen T-Zellkulturüberstände und des FSMEV-Hypr Stock aufgeführt. Der Reihenfolge nach von links nach rechts sind die Titer des Virusstocks als Positivkontrolle (FSMEV-Hypr Stock), die Titer der Überstände der T-Zellen, die mit dem FSMEV-Stamm Hypr infiziert wurden (T-Zellen infiziert mit FSMEV-Hypr), die Titer des Inputvirus zur Darstellung der Restinfektiosität (FSMEV-Hypr (Restinfektiosität)) und die Titer der Überstände der T-Zellen, die mit dem UV-inaktivierten FSMEV-Stamm Hypr kokultiviert wurden (T-Zellen kokultiviert mit FSMEV-HyprUV), dargestellt. Bei dem rechten Balken handelt es sich um die Titer der Mock-Kontrolle.
Bei den Überständen der T-Zellen, die mit dem UV-inaktiverten FSME-Virus kokultiviert wurden, war ein niedriger Titer von um die 5 x 103 TCID50 / ml vorhanden.
Somit konnte gezeigt werden, dass das FSME-Virus wohl nicht effektiv in den T-Zellen repliziert. In den Mock-Kontrollen konnte kein CPE der Vero-B4 Indikatorzellen festgestellt werden, sodass hier erwartungsgemäß kein messbarer Virustiter bestimmt werden konnte.
3.2.4.2 Zellviabilitätsanalyse mittels MTT-Assay
Durch den MTT-Assay sollte zusätzlich die Viabilität der Indikatorzellen, die mit den Zellkulturüberständen der mit FSME-Virus infizierten T-Zellen inkubiert wurden,
0
überprüft werden (s. Kapitel 2.2.7). Die Ergebnisse der TCID50-Analysen mit verschiedenen T-Zell-Überständen sind in der Abbildung 3.25 graphisch aufgeführt.
Abbildung 3.25: Ergebnisse des TCID50 des MTT-Assays mit Zellkulturüberständen der T-Zellen.
Auf der Abszisse sind die einzelnen Verdünnungsstufen der Überstände dargestellt und auf der Ordinate die Absorptionswerte bei einer Wellenlänge von 570 nm. Die grauen Balken stellen das Inputvirus dar und der schwarze Balken den Zellkulturüberstand der Mock-Kontrolle. Die blauen Balken stehen für die Zellkulturüberstände der T-Zellen, die mit dem FSME-Virus infiziert wurden, und die roten Balken für die Überstände der T-Zellen, die mit dem UV-inaktivierten Virus kokultiviert wurden.
Wie in der Abbildung 3.25 dargestellt, war die Viabilitätsrate der Vero-B4 Indikatorzellen, die mit den infizierten T-Zellüberständen inkubiert wurden (blaue Balken), höher als bei der Kontrolle der Restinfektiosität (grüne Balken). Dagegen waren bei der Mock-Kontrolle und bei den Indikatorzellen, die mit dem replikationsinkompetenten Virus inkubiert wurden, die Absorptionswerte und damit die Zellviabilität sehr hoch (schwarzer Balken bzw. rote Balken).
In insgesamt sechs Versuchsreihen mit T-Zellen verschiedener Spender ergab sich mit einer Ausnahme, bei der eine FSME-Virusreplikation nachgewiesen wurde, ein ähnliches Bild. In humanen T-Zellen scheint daher in der Regel keine effiziente Replikation des FSME-Virus stattzufinden.