Das FSME-Virus repliziert in den mit IFNAR-Antikörper

Um die Replikation des FSME-Virus nachzuweisen, wurden pDCs mit und ohne IFNAR-Antikörper inkubiert und jeweils mit Virus infiziert, mit UV-inaktivierten FSME-Virus oder mit Medium als Mock-Kontrolle für 3 Tage kokultiviert. Mit den Zellkulturüberständen wurden TCID50-Analysen zur Virustiterbestimmung durchgeführt (s. Kapitel 2.2.2.3). Zusätzlich wurden die Virustiter der für die Infektionen verwendete Virussuspension als Positivkontrolle und die Restinfektiosität der verwendeten Virussuspension („Inputvirus“, s. Kapitel 2.2.2.5) bestimmt. Die Bilder der einzelnen Verdünnungstufen, bei denen noch ein CPE zu erkennen war und kein CPE mehr sichtbar war, sind in der Abbildung 3.14 dargestellt. In der Abbildung 3.14 sind die jeweiligen Verdünnungsstufen des TCID50 mit den IFNAR-Antikörper behandelten pDC- und ohne Antikörper behandelten pDC-Zellkulturüberständen sowie der Ausgangssuspension des Virus, dem Inputvirus und der Mock-Kontrolle dargestellt, bei denen bei den Vero-B4 Indikatorzellen noch ein CPE sichtbar war (linke Seite) und bei denen kein CPE mehr bei den Vero-B4-Indikatorzellen sichtbar war (rechte Seite). Zur besseren Veranschaulichung sind die aus den TCID50-Analysen berechneten Titer (s. 2.2.2.3) zusammenfassend in der Abbildung 3.15 dargestellt.

pDCs Mock

Abbildung 3.14: Darstellung der mikroskopischen Fotos der TCID50-Analysen der pDC Zellkulturüberstände und der Überstände der IFNAR-Antikörper behandelten pDCs auf Vero-B4-Indikatorzellen.

Auf der linken Seite sind die Verdünnungsstufen abgebildet, bei denen noch bei den Vero-B4 Indikatorzellen ein CPE zu erkennen ist und rechts die jeweiligen Verdünnungsstufen, bei denen kein CPE bei den Vero-B4 Zellen erkennbar ist. Die jeweiligen Verdünnungsstufen sind den Bildern rechts unten zugewiesen. In der Abbildung sind der Reihenfolge nach von oben bis unten folgende Bilder aufgeführt:

Titration des Virusstocks als Positivkontrolle (FSMEV-Hypr Stock), Titration der Überstände der pDCs, die mit dem IFNAR-Antikörper vorinkubiert und mit dem FSMEV-Stamm Hypr infiziert wurden (pDCs+IFNAR-Ak infiziert mit Hypr), Titration der Überstände der pDCs, die mit dem FSMEV-Stamm Hypr infiziert wurden (pDCs infiziert mit FSMEV-Hypr), Titration des Inputvirus zur Darstellung der Restinfektiosität (FSMEV-Hypr (Restinfektiosität)), Titration der Überstände der pDCs, die mit dem IFNAR-Antikörper vorinkubiert und mit dem FSMEV-Stamm Hypr infiziert wurden (pDCs+IFNAR-Ak kokultiviert mit FSMEV-HyprUV), Titration der Überstände der pDCs, die mit dem UV-inaktivierten FSMEV-Stamm Hypr kokultiviert wurden (pDCs kokultiviert mit FSMEV-HyprUV), und die Titration der Überstände der pDCs, die mit dem UV-inaktivierten FSMEV-Stamm Hypr kokultiviert wurden (pDCs kokultiviert mit FSMEV-HyprUV). Auf dem unteren Bild ist die Mock-Kontrolle abgebildet (pDCs Mock).

20 µm

1,0E+00

Abbildung 3.15: Darstellung der Ergebnisse der TCID50-Analysen der pDC Zellkulturüberstände und der Überstände der IFNAR-Antikörper behandelten pDCs.

In der Abbildung sind die Titer der einzelnen Zellkulturüberstände und des FSMEV-Hypr Stocks aufgeführt. Der Reihenfolge nach von links nach rechts sind die Titer des Virusstocks als Positivkontrolle (FSMEV-Hypr Stock), die Titer der Überstände der pDCs, die mit dem IFNAR-Antikörper vorinkubiert und mit dem FSMEV-Stamm Hypr infiziert wurden (pDCs+IFNAR-Ak infiziert mit FSMEV-Hypr), die Titer der Überstände der pDCs, die mit dem FSMEV-Stamm Hypr infiziert wurden (pDCs infiziert mit FSMEV-Hypr), die Titer des Inputvirus zur Darstellung der Restinfektiosität (FSMEV-Hypr (Restinfektiosität)), die Titer der Überstände der pDCs, die mit dem IFNAR-Antikörper vorinkubiert und mit dem FSMEV-Stamm Hypr infiziert wurden (pDCs+IFNAR-Ak kokultiviert mit FSMEV-HyprUV), die Titer der Überstände der pDCs und die Titer der Überstände, die mit dem UV-inaktivierten FSMEV-Stamm Hypr kokultiviert wurden (pDCs kokultiviert mit FSMEV-HyprUV) dargestellt. Bei den beiden rechten Balken handelt es sich um die Titer der Mock-Kontrollen der pDCs, die mit dem IFNAR-Ak behandelt wurden (pDC+IFNAR Mock), und der pDCs ohne Antikörperbehandlung (pDC Mock).

Der Titer in der Ausgangsvirussuspension beläuft sich auf 4,1 x 10⁸ TCID50 / ml. Der Virustiter der Zellkulturüberstände der Zellkulturüberstände der pDCs, die mit dem IFNAR-Antikörper behandelt wurden und darauf mit dem FSME-Virus infiziert wurden, beläuft sich auf 9,4 x 10⁶ TCID50 / ml und der Virustiter der Zellkulturüberstände der pDCs, die nicht mit dem IFNAR-Antikörper behandelt wurden und nur mit dem FSME-Virus infiziert wurden, beträgt 1,8 x 10⁵ TCID50 / ml und liegt damit knapp unter dem

Virustiter, der noch in der Inputvirus-Kontrolle als Restinfektiosität enthalten ist. Die Virustiter der Zellkulturüberstände der pDCs, die sowohl mit dem IFNAR-Antikörper behandelt wurden als auch ohne Antikörperbehandlung anschließend mit dem UV-inaktivierten FSME-Virus kokultiviert wurden, liegen 3 log-Stufen unter den Titern der Überstände der Zellen, die mit dem aktiven Virus infiziert wurden. Das bedeutet, dass das durch die UV-Behandlung replikationsinkompetente FSME-Virus sich erwartungsgemäß nicht weiter in den Zellen vervielfältigt hat. In den Mock-Kontrollen konnte kein CPE der Vero-B4 Indikatorzellen nachgewiesen werden, sodass in den Zellkulturüberständen der Mock-Kontrollen (mit und ohne IFNAR-Antikörper Behandlung) erwartungsgemäß kein Virus vorhanden ist.

Damit lag der Virustiter der Zellkulturüberstände der pDCs, die mit dem IFNAR-Antikörper behandelt wurden und anschließend mit dem FSME-Virus infiziert wurden, um fast 2 log-Stufen über dem Virustiter der Zellkulturüberstände der pDCs, die mit dem FSME-Virus infiziert, aber nicht mit dem IFNAR-Antikörper inkubiert wurden. Dieser wiederum liegt noch knapp unter dem Wert, der für die Restinfektiosität ermittelt wurde, d. h. eine effiziente Replikation des FSME-Virus findet in unbehandelten pDCs nicht statt. Aus den Ergebnissen lässt sich ableiten, dass durch Blockierung des IFNAR eine Replikation des FSME-Virus in pDCs ermöglicht wird, was darauf schließen lässt, dass die starke IFN-α-Produktion nach FSME-Virusinfektion für die Hemmung der Virusreplikation verantwortlich ist.

3.1.7.2 Bestimmung der Zellviabilität nach FSME-Virusinfektion mittels