4 DISKUSSION
4.1 D IADENYLATZYKLASEN – EINE WEIT VERBREITETE E NZYMFAMILIE
Die Existenz von Diadenylatzyklasen (DACs) wurde bisher in verschiedenen Gram-positiven Spezies wie Bacillus subtilis, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium smegmatis und Mycoplasma pneumoniae nachgewiesen (Witte et al., 2008, Woodward et al., 2010, Corrigan et al., 2011, Bai et al., 2012, Zhang & He, 2013, Schmeisky, 2013). Kürzlich wurde der erste Nachweis in dem Gram-negativen Bakterium Chlamydia trachomatis erbracht (Barker et al., 2013). Diese Enzyme tragen alle die, für ihre
Aktivität verantwortliche, DAC-Domäne. Aufgrund der hohen Konservierung dieser Domäne lassen sich DACs leicht vorhersagen. So wurden die B. subtilis DACs CdaA und CdaS schon früh als solche betrachtet (Römling, 2008), jedoch erst im Rahmen dieser Arbeit wurde der erste experimentelle Nachweis gezeigt, dass beide Enzyme tatsächlich c-di-AMP synthetisieren. Daraufhin wurden diese Proteine neu benannt (vorher YbbP und YojJ).
Durch ihre DAC-Domäne sind DACs klar von Diguanylatzyklasen (GGDEF-Motiv wichtig für Aktivität) zu unterscheiden. Beide Enzymfamilien sind nicht homolog und müssen evolutionär unabhängig voneinander entstanden sein (Witte et al., 2008). Mit ihren Produkten c-di-AMP und c-di-GMP stellen sie durchaus ähnliche Moleküle her. Daher stellt sich die Frage, ob es nicht einfacher gewesen wäre ein Enzym „umzuprogrammieren“ als ein gänzlich neues zu erschaffen. Das letzteres durchaus möglich ist zeigt der Bericht von Baker und Kelly über verschiedene Adenylatzyklasen – welche dasselbe cAMP-Molekül herstellen – die ebenfalls unabhängig voneinander entstanden sind (Baker & Kelly, 2004).
Ausnahmestellung von B. subtilis hinsichtlich seiner DACs
Dass B. subtilis über drei verschiedene DACs verfügt (CdaA, DisA, CdaS) ist besonders, bedenkt man, dass die meisten anderen DAC exprimierenden Organismen nur eins dieser Enzyme besitzen. Es gibt einige Clostridienarten, die zwei DACs haben (CdaA und DisA).
Einige wenige, hauptsächlich Bacillus-Vertreter, verfügen über drei DACs. So trägt B. cereus beispielsweise zwei cdaA-Gene und ein disA-Gen. Die Abwesenheit von CdaS in diesen sporenbildenden Organismen spricht dafür, dass CdaS für die Sporulation nicht essentiell ist.
In B. subtilis scheint CdaS jedoch eine wichtige Funktion in diesem Zusammenhang zu spielen, da das Protein spezifisch während der Sporulation exprimiert wird (Nicolas et al., 2012). Die konstitutiv exprimierten DACs DisA und CdaA spielen während des exponentiellen Wachstums von B. subtilis eine wichtige Rolle. Für DisA wurde gezeigt, dass es die Integrität der DNA überprüft, indem DisA an DNA bindet und am Chromosom entlang gleitet. Beim Treffen auf DNA-Schäden wird die c-di-AMP-Synthese inhibiert (Witte et al., 2008). Diese Integritätskontrolle wurde mit dem Eintritt in die Sporulation in Verbindung gebracht (Oppenheimer-Shaanan et al., 2011). Bei der Frage nach der Rolle von CdaA ist besonders die hohe Verbreitung des konservierten cda-glm-Moduls zu beachten. Die direkt
aufeinanderfolgenden Gene cdaA, cdaR und glmM lassen einen funktionellen Zusammenhang vermuten.
Aufgrund bioinformatischer Analyse wurde spekuliert, dass CdaR membranständig sein könnte (Corrigan & Gründling, 2013). Das Protein lässt sich jedoch gut isolieren, was beispielsweise für die Herstellung eines CdaR-Antikörpers notwendig war. Die Isolierung von Membranproteinen ist hingegen meistens sehr schwierig. Deshalb ist anzunehmen, dass CdaR gelöst im Cytosol vorliegt. Im Gegensatz dazu wurde die Reinigung und Isolierung von CdaA mehrfach erfolglos versucht, was in guter Übereinstimmung mit der experimentell bestätigten Membranständigkeit des Proteins ist (Abbildung 3.7).
CdaR stimuliert die Zyklaseaktivität von CdaA
Die in dieser Arbeit gezeigten Daten zeigen, dass die DAC-Aktivität von CdaA aufgrund einer regulatorischen Protein-Protein-Interaktion mit CdaR gesteigert wird (Abbildung 3.8, Abbildung 3.9, Abbildung 3.11). CdaR fungiert daher als ein Regulator von CdaA. Diese CdaR-vermittelte Aktivierung erfolgt nicht auf die anderen beiden Diadenylatzyklasen DisA und CdaS und ist somit spezifisch für CdaA. CdaA trägt einen kurzen C-terminalen Rest (ca. 40 Aminosäuren, Abbildung 3.6) dem bisher keine Funktion zugeordnet werden konnte. Dieser Rest ist deshalb auffällig, da er in direkter Nachbarschaft zur DAC-Domäne eine mögliche Interaktionsfläche für CdaR darstellt. So käme CdaR in Kontakt mit der DAC-Domäne um diese zu aktivieren. Eine durch Interaktion induzierte Konformationsänderung würde die Aktivitätssteigerung erklären. Der funktionelle Zusammenhang der Proteine CdaA und CdaR wird weiter durch die Tatsache unterstrichen, dass beide Gene benachbart im cda-glm-Modul kodiert und exprimiert sind.
In der Zwischenzeit wurde auch für andere Beispiele gezeigt, dass die DAC-Aktivität durch Protein-Protein-Interaktion beeinflusst werden kann. RadA ist mit seiner Rolle in der Stabilisierung und Prozessierung von „Holliday junctions“ an der DNA-Reparatur beteiligt (Carrasco et al., 2004). Zusätzlich interagiert RadA mit DisA, woraufhin die DAC-Aktivität von DisA inhibiert wird (Zhang & He, 2013). Diese Inhibierung ist in guter Übereinstimmung mit der bisher beschriebenen Funktion von DisA, das an der DNA entlang gleitet und die Synthese von c-di-AMP beim Treffen auf Doppelstrangbrüche und „Holliday junctions“
stoppt (Bejerano-Sagie et al., 2006, Witte et al., 2008, Oppenheimer-Shaanan et al., 2011).
Interessanterweise sind die Gene radA und disA benachbart kodiert und reguliert (Krüger et al., 1996, Jervis et al., 2007). Diese Nachbarschaft wurde in über 85 bakteriellen Spezies gefunden (Zhang & He, 2013). Genau wie für CdaA/CdaR zeigt sich mit DisA/RadA ein funktionelles Paar, das gemeinsam exprimiert ist und die DAC-Aktivität durch Protein-Protein-Interaktion reguliert.
Für die RadA-DisA-Interaktion wurde noch kein direkter Zusammenhang zur Prozessierung von „Holliday junctions“ gezeigt. Die eindeutige Assoziation beider Proteine zu dieser Funktion spricht dafür, dass DNA-Schäden ein Stimulus für RadA sind, die Interaktion mit DisA einzugehen. Im Gegensatz dazu ist der Stimulus für CdaR noch unbekannt. CdaR trägt vier YbbR-Domänen. Die Struktur dieser Domänen aus Desulfitobacterium hafniense zeigt eine hohe Ähnlichkeit mit dem ribosomalen Protein L25 (Barb et al., 2011). L25 bindet die 5 S ribosomale RNA (Gongadze et al., 1999, Schmalisch et al., 2002), daher könnte die Bindung von RNA ein Stimulus für CdaR sein, wodurch die CdaA-CdaR-Interaktion beeinflusst wird.