Auswirkungen des c-di-AMP-Spiegels auf Wachstum und

Die Isolierung einer hyperaktiven Variante der Diadenylatzyklase CdaSL44F (s. Kapitel 3.4.1) ermöglichte die Untersuchung von hohen c-di-AMP-Konzentrationen in B. subtilis. Im Vergleich zum Wildtyp-Protein zeigte diese Variante eine fast 100-fach gesteigerte Aktivität.

Um einen möglichen Abbau von c-di-AMP durch die Phosphodiesterase GdpP zu verhindern, wurde das entsprechende Gen deletiert. So entstand der Stamm GP1344 (PxylcdaSL44F ΔgdpP), der das hyperaktive cdaS-Allel ektopisch unter der Kontrolle eines xyloseinduzierbaren Promotors exprimiert. Zunächst wurden intrazelluläre c-di-AMP Konzentrationen des Wildtyps (168) und des Stamms GP1344 (Wachstum in Gegenwart von Xylose) bestimmt. Im Wildtyp wurden 9,0 ± 0,2 ng c-di-AMP / mg Protein detektiert. Im Gegensatz dazu wurden für die Mutante 34,6 ± 0,8 ng c-di-AMP / mg Protein ermittelt. Die Wildtyp-Konzentration war damit in guter Übereinstimmung mit dem unter 3.1 ermittelten Wert. Die Konzentration von GP1344 betrug mehr als das 3-fache, was zeigt, dass der

intrazelluläre c-di-AMP Spiegel tatsächlich aufgrund der ektopischen Expression von CdaSL44F

und der Abwesenheit von GdpP erhöht war.

Um den Einfluss einer gesteigerten c-di-AMP-Konzentration auf das Wachstum von B. subtilis zu untersuchen, wurden zwei Stämme hergestellt. Diese exprimierten entweder das Wildtyp-Allel cdaS (GP1341) oder das hyperaktive Allel cdaSL44F (GP1342) ektopisch unter der Kontrolle eines xyloseinduzierbaren Promotors. Zusätzlich wurde in den Stamm GP1341 eine Deletion der Phosphodiesterase GdpP eingebracht (GP1343), um den Abbau von c-di-AMP zu unterbinden. Zusammen mit GP1344 standen für die Untersuchung des Wachstums vier Stämme zur Verfügung (Übersicht s. Abbildung 3.2). Diese wurden in CSE-Medium mit 0,5%

Glucose in An- oder Abwesenheit von Xylose (1%) kultiviert. Die Ergebnisse sind in Abbildung 3.2 dargestellt. Wenn die Zellen ohne den Induktor Xylose wuchsen, das ektopische cdaS-Allel also nicht exprimiert war, konnte nur für GP1344 ein minimal langsameres Wachstum festgestellt werden (Generationszeit 53,6 min im Vergleich zu 48,5 min des isogenen Stamms GP1343 mit Wildtyp-cdaS). Wenn die cdaS-Allele Xylose exprimiert wurden, zeichneten sich deutliche Wachstumsunterschiede ab. Der Stamm GP1341, der Wildtyp-cdaS in Gegenwart der Phosphodiesterase exprimierte, zeigte keinen Einfluss. Bei zusätzlicher Deletion von gdpP (GP1343) war ein geringer Unterschied feststellbar (Generationszeit 47,7 min für GP1341 im Vergleich zu 60,0 min für GP1343). Genauso hatte der Stamm GP1342 mit dem hyperaktiven cdaSL44F-Allel im Vergleich zu GP1341 mit Wildtyp-cdaS nur einen geringen Wachstumsdefekt (Generationszeit 76,4 min für GP1342 und 47,7 min für GP1341). Jedoch zeigte der Stamm GP1344, der die Expression von hyperaktivem cdaSL44F

mit der Abwesenheit von gdpP vereint, ein drastisches Wachstumsdefizit (Generationszeit 89,1 min). Zusammenfassend sprechen diese Ergebnisse für eine Beeinträchtigung des Wachstums aufgrund zu hoher c-di-AMP-Konzentrationen.

Abbildung 3.2: Einfluss von c-di-AMP auf das Wachstumsverhalten. Die Stämme GP1341, G1342, GP1343 und GP1344 wurden in CSE-Medium mit 0,5% Glucose in An- oder Abwesenheit von Xylose (1%) kultiviert. Die optische Zelldichte wurde bei 600 nm gemessen (OD600). Für jeden Stamm wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt, die ein ähnliches Wachstumsverhalten zeigten. Daraus ist jeweils eine repräsentative Wachstumskurve gezeigt.

Zur genaueren Untersuchung des Wachstumsdefizits durch gesteigerte c-di-AMP-Mengen sollte der Effekt auf die Zellmorphologie geklärt werden. Dafür wurde der Wildtypstamm GP1173 (keine c-di-AMP-Akkumulation) sowie GP1344 (isogene Konstruktion mit 3-fach gesteigerter c-di-AMP-Konzentration) in SP Medium mit oder ohne Xylose (1%) angezogen.

Nach 6 h in der exponentiellen Phase und nach 23 h in der stationären Phase wurden Proben genommen und per Phasenkontrastmikroskopie analysiert (Abbildung 3.3). Die Zellmorphologie war ohne den Induktor Xylose für beide Stämme vergleichbar. Exponentiell wachsende Zellen des Stamms GP1344 waren vom Wildtyp GP1173 nicht zu unterscheiden.

Genauso verhielten sich Zellen in der stationären Phase (23 h), hier waren bereits einige Sporen sichtbar. Wurden die Stämme in Anwesenheit von Xylose kultiviert, zeigte sich für den Wildtyp GP1173 ebenfalls kein Unterschied zum Wachstum ohne Xylose. Zellen des Stamms GP1344 wiesen in der exponentiellen Phase (6 h) jedoch eine stark veränderte Zellmorphologie auf. Es waren lange, nicht separierte Zellfilamente zu beobachten, die sich in stark verdrillten „Locken“ anlagerten. Interessanterweise konnte dieser Phänotyp in der stationären Phase (23 h) nicht mehr beobachtet werden. Hier waren die Zellen kurz und mit

denen des Wildtyps vergleichbar, einige Sporen waren außerdem vorhanden. Diese Aufhebung des Phänotyps sporulierender Zellen könnte einerseits durch das Auftreten einer Suppressormutation, die die Akkumulation von c-di-AMP verhindert, erklärbar sein.

Andererseits ist es möglich, dass sporulierende Zellen unempfindlich gegenüber erhöhten c-di-AMP-Konzentrationen sind. Um zwischen diesen beiden Möglichkeiten zu unterscheiden wurden Zellen des Stamms GP1344 nach 23 h auf SP-Platten ausplattiert. Nach einigen Tagen wurde von diesen Platten erneut eine SP-Kultur angeimpft, so dass GP1344-Zellen zu beobachten waren, die nach vorangegangener Sporulation einen neuen Zellzyklus durchliefen. Erneut zeigte sich in Anwesenheit von Xylose für exponentiell wachsende Zellen (6 h) der „lockige“ Phänotyp, wohingegen sich dieser in der stationären Phase (23 h) erneut aufhob. Daraus lässt sich schließen, dass die Auswirkung eines erhöhten c-di-AMP-Spiegels auf die Zellmorphogie abhängig von der Wachstumsphase ist. Offenbar wird durch c-di-AMP-Akkumulation ein Prozess der Zellteilung in exponentiell wachsenden Zellen gestört, während dies in der stationären Phase entweder keine Auswirkung mehr hat oder die Störung nicht mehr stattfindet. Des Weiteren fiel auf, dass der „lockige“ Phänotyp nur beobachtet werden konnte, wenn von SP-Platten angeimpft wurde, auf denen die Zellen schon sporuliert waren. Dies weist möglicherweise auf einen Prozess bei der Auskeimung hin.

Abbildung 3.3: Einfluss unterschiedlicher c-di-AMP-Spiegel auf die Zellmorphologie. Die Stämme GP1173 und GP1344 wurden in SP-Medium in An- oder Abwesenheit von Xylose (1%) kultiviert. Nach jeweils 6 h und 23 h Stunden wurden Proben genommen und mittels Phasenkontrastmikroskopie analysiert. Der Maßstabsbalken entspricht 10 µm.

Die Zellwand ist ein wichtiger, die Zellmorphologie bestimmender Bestandteil. Eine gestörte Zellmorphologie ist demnach ein möglicher Hinweis auf einen Defekt im Zellwand-Metabolismus. Es wurde bereits beschrieben, dass die Depletion von c-di-AMP einen Defekt in der Peptidoglycansynthese hervorruft, welcher durch die Zugabe von Magnesium wieder aufgehoben werden kann (Luo & Helmann, 2012). Um zu untersuchen, ob sich der Überschuss von c-di-AMP ebenfalls auf die Peptidoglycanmaschinerie auswirkt, wurde getestet, welchen Einfluss die Zugabe von Magnesium auf die Zellmorphologie hat. Die Stämme GP1173 und GP1344 wurden wie oben beschrieben in SP-Medium in Anwesenheit von Xylose (1%) angezogen und nach 7 h mikroskopisch analysiert. Diese Analyse ist in Abbildung 3.4 gezeigt. Die Erhöhung der Magnesiumkonzentration hatte keinen Einfluss auf den Wildtypstamm GP1173. Für den Stamm GP1344, der unter den Testbedingungen einen erhöhten c-di-AMP-Spiegel aufweist, zeigte sich jedoch, dass die Störung der Zellmorphologie bei hoher Magnesiumkonzentration nahezu aufgehoben ist. Dies spricht für einen Defekt der Peptidoglycanmaschinerie durch c-di-AMP-Akkumulation. Einige lange Zellketten deuteten darauf hin, dass sich diese Zellen nicht korrekt teilen konnten und Magnesium den Effekt der c-di-AMP-Akkumulation nicht komplett aufheben kann.

Abbildung 3.4: Einfluss von Mg²⁺ auf die Morphologie von Zellen mit unterschiedlichen c-di-AMP-Spiegeln.

Die Stämme GP1173 und GP1344 wurden in SP-Medium in Anwesenheit von Xylose (1%) kultiviert. MgSO4

wurde wie in den Konzentrationen 1 mM (Standard) und 25 mM (Überschuss) dazu gegeben. Nach 7 h Stunden wurden Proben genommen und mittels Phasenkontrastmikroskopie analysiert. Der Maßstabsbalken entspricht 10 µm.