Diese physikalisch-chemischen Methoden zur Stofftrennung benötigen hohen apparativen Aufwand und hochqualifiziertes Personal. Ein hoher zeitlicher Aufwand bei der Probenaufarbeitung verhindert einen hohen Probendurchsatz. Im Vergleich zur GC zeigt sich die HPLC eher Matrix-anfällig, so dass möglicherweise aufwändigere Aufreinigungen notwendig sind.
6.3.1 HPLC
Die Chromatographie erfolgt wegen des ionischen Charakters der PSP-Toxine meist als Ionenchromatographie. Die Methode wird unten näher erläutert. Zur Detektion wird meist FLD oder Massenspektrometrie eingesetzt. Pietsch et al. (26) veröffentlichten 2001 eine Methode zum gleichzeitigen Nachweis von Hepatotoxinen (Microcystin, Nodularin, Cylindrospermopsin) und Neurotoxinen (PSP, Anatoxin-a) in Wasserproben, indem sie nach der Trennung über einer RP-Säule sowohl mit UV (235nm) als auch mit ESI-MS-MS detektierten. Die Wiederfindrate für Saxitoxin lag im Gegensatz zu den anderen getesteten Toxinen nur bei 4%, was die Autoren auf die geringe UV-Absorption, die hohe Polarität und damit auf die schlechte Anreicherung mittels normaler SPE und schlechte Trennung in der RP-Säule zurückführten.
6.3.1.1 Auftrennung
• Ionenchromatographie:
1. Ionenpaarchromatographie:
Die meisten HPLC-Methoden für PSP-Toxine beruhen auf der Ionenpaarchromatographie, wobei fast immer Alkylsulfonsäuren als Ionenpaarbildner der kationischen PSP-Toxine eingesetzt werden (6). Der mobilen Phase wird ein ionogener Stoff zugegeben, der mit der entgegengesetzt geladenen Probenkomponente ein Ionenpaar ergeben. Diese Ionenpaare verhalten sich chromatographisch wie nicht-ionogene organische Moleküle, so dass sie mit Hilfe einer RP-Säule getrennt werden können (6).
Ionenpaarreagenz:
- Für Decarbamoyl-/Carbamoyltoxine: Heptansulfonsäure(6), Oktansulfonsäure(6)
- Für C-Toxine (anionisch): Tetrabutylammoniumsulfat(6), Oktansulfonsäure(6)
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2. Ionenaustauschchromatographie:
Bei der Ionenaustauschchromatographie wird als stationäre Phase eine polymere Matrix aus Harz oder Kieselgel eingesetzt, an deren Oberfläche sich saure oder basische Gruppen befinden. Die zu analysierenden Ionen werden von den funktionellen Gruppen des Austauscherharzes unterschiedlich stark gebunden und dann von der mobilen Phase eluiert (6). Die Ionenaustauschchromatographie wird vor allem zur Probenaufarbeitung verwendet(6).
6.3.1.2 Detektion
Die Identifizierung der Toxine erfolgt anhand eines Vergleichs der Retentionszeit mit der von Standardlösungen, während für die Quantifizierung die Peakfläche berechnet wird.
• HPLC-FLD:
Da die Toxine von sich aus keine Fluoreszenz zeigen, müssen sie im alkalischen Bereich durch Vor- oder Nachsäulenbehandlung zu fluoreszierenden Verbindungen oxidiert werden.
Die Vorsäulen-Derivatisierung ist einfacher und benötigt weniger Reagenzien. Allerdings können einige PSP-Toxine auch zu mehreren Verbindungen oxidiert werden. Mit den Oxidationsbedingungen lässt sich zwar beeinflussen, dass nur ein Reaktionsprodukt entsteht. Aber nicht jedes Oxidationsmittel eignet sich für jedes Toxin. Beispielsweise mit H2O2 als Oxidationsmittel bilden GTX2 und GTX3 dasselbe Produkt und können deshalb so nicht getrennt werden (52). Bei der Messplanung ist zu beachten, dass die Fluoreszenzprodukte nur wenige Stunden stabil sind.
Die AOAC-Methode mit Vorsäulen-Derivatisierung (AOAC 2005.02) stellt eine sehr robuste Methode dar, ist aber zeitaufwändig. Mehrere GTXs, dcGTXs, dcSTXs und dcNeo ergeben zwei Fluoreszenzprodukte (24).
Die Nachsäulen-Derivatisierung ist mit der entsprechenden Ausstattung automatisierbar und erzielt reproduzierbarere Ergebnisse. Allerdings reagiert die Methode empfindlich auf Änderungen von Flussrate, Temperatur und Alter der Reagenzien (24). Nach der chromatographische Trennung werden die Oxidationsprodukte des jeweiligen Toxins zusammengerechnet.
Als Oxidationsmittel eignen sich: H2O2(6; 52), Perjodsäure(6), Perchlorsäure (52).
Lawton/ Edwards (24) empfehlen für alle Methoden das Mitlaufen einer underivatisierten Probe um störende Kontaminanten auszuschließen.
Im Folgenden sind einige Verfahren näher dargestellt. Weitere Beispiele sind in Anlage 5 gelistet.
- HPLC-FLD mit Vorsäulen-Derivatisierung nach Lawrence 1991 (52):
Extraktion: 25g Probe + 25ml 0,1M HCL 2min Ultraturrax zentrifugieren Überstand pH 3-4 einstellen
2ml über C-18-Kartusche mit 2ml Wasser waschen Oxidation: 1ml Extrakt mit NaOH auf pH 8 einstellen
100µl + 275µl Perjodatlösung 2min Reaktionszeit 20µl konz. Essigsäure zugeben
Chromatographie: RP-Säule 20µl injizieren
Eluent: A = 0,1M Ammoniumformiat, B = Eluent A + 5% Acetonitril Detektion: Ex 335nm, Em 400nm
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- HPLC-FLD mit Vorsäulen-Derivatisierung; Ringversuch 2004 nach Lawrence/Walther (52):
Extraktion: Essigsäure Oxidation: H2O2
Säule: RP
Detektion: Ex 330nm, Em 390nm
Nachweisgrenze: 5-50µg/kg (abhängig vom Detektor)
Probleme: Die fluoreszierenden Derivate sind schon bei Raumtemperatur thermolabil.
Die Zeit zwischen Derivatisierung und Detektion sollte konstant sein.
- DIN EN 14526: Bestimmung von Saxitoxin und dcSaxitoxin in Muscheln; HPLC Verfahren mit Vorsäulenderivatisierung mit Perjodatoxidation; Deutsche Fassung, 2004 (50)
Anwendung: Muscheln
Extraktion: Essigsäure oder Salzsäure Zentrifugation Überstand SPE (C18-Kartusche)
Oxidation: H2O2 (ggf. Perjodat)
Säule: C18-ODS-Hypersil, 5µm (200mmx3mm) oder Ähnliches
Eluenten: Ammoniumformiat-Lösung, Acetonitril-Ammoniumformiat-Mischung
Fluss: 750µl/min
Injektion: 20µl
Detektion: Ex 340nm, Em 400nm
Nachweisgrenze: 6µg/kg (STX), 20µg/kg (dcSTX)
Probleme: H2O2: GTX2/3 werden mit in dasselbe Reaktionsprodukt überführt. GTX1/4 können nicht nachgewiesen werden
Perjodat: GTX1-4 führt zu den gleichen Reaktionsprodukten. Neo kann nur mit Perjodat nachgewiesen werden.
- DIN EN 14194: Bestimmung von Saxitoxin und dcSaxitoxin in Muscheln; HPLC-Verfahren mit Nachsäulenderivatisierung; Deutsche Fassung ENV 14194:2002
Anwendung: Muscheln; quantitative Bestimmung von Saxitoxin (STX) und DC-Saxitoxin (DC-STX) und qualitative Bestimmung von Neo-Saxitoxin und den Gonyau-Toxinen GTX-2 und GTX-3
Extraktion: Essigsäure Zentrifugation Überstand SPE (C18-Kartusche)
Säule: Für die Saxitoxingruppe: z.B. C18 ODS Hypersil 5µm (100mm×3mm) Für die GTX-Toxingruppe: z.B. C18 ODS Hypersil 5µm (200mm×3mm) Eluenten: Oktansulfonsäure-/Phosphorsäurelösung (unterschiedliche Mischung für
STX- und GTX-Gruppe
Fluss: Für die Saxitoxingruppe: 800µl/min Für die GTX-Toxingruppe: 600µl/min Injektion: 20µl
Oxidation: Perjodsäure-/Ammoniakmischung, 30°C, 300µl/min Detektion: Ex 333nm, Em 390nm
Nachweisgrenze: 40µg/kg (STX), 30µg/kg (dcSTX)
Probleme: Die Hydrolyse wandelt die Toxine wie folgt um:
C-1 in GTX-2; C-2 in GTX-3; GTX-6 in Neo-Saxitoxin; GTX-5 in Saxitoxin
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- HPLC-FLD mit Nachsäulenderivatisierung nach Thielert 1991, Oshima 1989, Franco 1993 (52):
Extraktion: 25g Probe + 25ml 0,1M HCL 2min Ultraturrax zentrifugieren Überstand filtrieren
2ml über C-18-Kartusche mit 2ml Wasser waschen Chromatographie: RP-Säule 20µl injizieren
Binärer Gradient: Ammoniumphosphat + Na-Octansulfonat + Acetonitril Derivatisierung: online mit: Ammoniak, Perjodsäure, Schwefelsäure
10 m Reaktionsschleife, 47°C Detektion: Ex 335nm, Em 400nm
LC-MS bzw. LC-MS/MS:
Aufgrund seiner Empfindlichkeit und der Möglichkeit zur Multitoxinanalytik sind MS bzw. LC-MS/MS auf dem Vormarsch. Wegen der thermischen Instabilität der PSP-Toxine haben sich schonende Ionisierungstechniken wie FAB (Fast Atom Bombardement) und API (Atmospheric Pressure Ionisation) als geeignet erwiesen (6). Allerdings existieren bisher keine validierten Methoden.
Tabelle 6-1: Molare Massen der PSP-Addukte im MS Pos-Modus
Toxin [M+H]+ [M-SO3+H]+ [M-H2O+H]+
STX 300 282
dcSTX 257
Neo 316
GTX1 332
GTX2 316
GTX3 396
GTX4 412
dcGTX2 352 dcGTX3 352
C1 396
C2 396
C3 492
C4 492
Nachteile der HPLC:
- Unzureichende Trennung der einzelnen PSP-Toxine
- Ionenpaarbildner sind teuer und verhindern LC-MS-Kopplung
- Validierung von LC-MS/MS- Methoden sind generell schwierig (Matrixeffekte…)
6.3.2 Immunochromatographie
Jellet Rapid PSP Test (JRPT - Jellet Rapid Testing Ltd., NS, Kanada):
(früher MIST Alert)
2004 wurde in Kalifornien eine Studie zum Vergleich von JRPT und Maus-Bioassay durchgeführt.
Von 910 Untersuchungen waren 478 negativ, 147 positiv, 259 falsch positiv, 20 zweifelhaft und 6 ungültig (48).
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6.3.3 DC/HPTLC
Als eine der ersten Möglichkeiten zur chromatographischen Detektion von Toxinen wurde die Dünnschichtchromatographie (Thin-layer-chromatography/TLC) eingesetzt. Sie hat die Toxinanalytik über Jahre geprägt und gilt auch heute noch als einfache und relativ billige Methode.
Es lassen sich mehrere Proben gleichzeitig untersuchen. Da stationäre und mobile Phase nur einmal verwendet werden, können weniger aufbereitete Extrakte verwendet werden. Mit Hilfe neuester Technik (Scanner) und verbesserter stationärer Phase (HPTLC, UTLC) wurden Selektivität und Sensitivität erheblich gesteigert, so dass sich die Methode sowohl zum Screening als auch zur Quantifizierung von Toxinen eignet. Anlage 6 zeigt Beispiele für DC-Parameter.
Die qualitative Auswertung erfolgt über die ermittelten Rf-Werte, die die Lage einer Substanz im Chromatogramm beschreiben:
Spezif. Laufhöhe Rf = 𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸 𝑆𝑆𝐸𝐸𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸−𝑆𝑆𝐸𝐸𝑆𝑆𝑆𝑆𝐸𝐸𝑆𝑆𝐸𝐸𝑆𝑆𝐸𝐸𝑆𝑆𝐸𝐸𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸
𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸 𝑆𝑆𝐸𝐸𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸−𝐿𝐿𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸𝑆𝑆𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝐸𝑆𝑆𝐸𝐸𝐸𝐸𝐿𝐿𝐸𝐸𝐸𝐸 = ≤1
Die quantitative Auswertung erfolgt bei Bedarf mittels Scanner und Software.
Präparative Chromatographie:
Die DC eignet sich auch zur Isolierung der gesuchten Substanz. Nach der Trennung und Identifizierung kann sie von der Glasplatte abgekratzt werden bzw. aus der Kunststoff- oder Aluminiumfolie ausgeschnitten werden.
TLC-MS:
Mittels TLC-MS-Interface kann die DC-Platte an ein Massenspektrometer gekoppelt werden.
Dadurch ist es möglich, den in der DC erhaltenen Spot qualitativ und quantitativ zu überprüfen.