3 M ATERIAL UND M ETHODEN
3.7 Chemische Analysenmethoden
3.7.1 Weender-Rohnährstoffe, ADF, NDF
Die Bestimmung der Trockensubstanz und der Rohnährstoffe (Rohprotein, Rohfett, Rohfaser, Rohasche) sowie von ADF und NDF in den Futtermitteln erfolgte im Institut für Tierernährung der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft in Braunschweig nach dem METHODENBUCH III der LUFA Vorschriften 3.1, 4.1.1, 5.1.2, 6.1.4, 6.5.1., 6.5.2. und 8.1 (1997). Die Abweichungen in der Analysenpräzision beliefen sich für ADF auf 0,6%-Punkte und für NDF auf 0,8%-Punkte.
3.7.2 Mengen- und Spurenelemente in den Futtermitteln
Zur Bestimmung der Mengen- und Spurenelemente wurde 1 g des Probenmaterials in einem Quarztiegel bei 550° C im Muffelofen verascht, die Asche mit 10 ml 25%iger Salzsäure (Fa.
Merck 100316) aufgenommen und im Sandbad eingedampft. Die erneut aufgenommenen Rückstände wurden mit 10 ml verdünnter Salpertersäure (1 Teil HNO3 und 2 Teile H2O) im Sandbad innerhalb von 5 Minuten zum Sieden gebracht, anschließend mit heißem Wasser in einen 100 ml Messkolben überspült und mit 2 ml konzentrierter Salpetersäure (Fa. Merck, 100456) konserviert. Nach dem Abkühlen wurde auf 100 ml aufgefüllt.
Die Messung der Mengen- und Spurenelement-Gehalte in den Proben erfolgte mit Hilfe der ICP-Analytik (ICP-MS : VGL Plasmaquad3; ICP-OES : Fa. Spectro) im Institut für Pflanzenernährung und Bodenkunde der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft in Braunschweig.
In Tabelle 16 sind die Variationskoeffizienten für die Bestimmung der einzelnen Elemente aufgeführt.
Tabelle 16: Variationskoeffizienten (VK) in der Analysenpräzision der Mengen- und Spurenelemente
Ca P K Na Mg S Fe Mn Zn Cu Co Mo
VK (%) 1,78 1,87 3,11 3,59 1,58 2,41 7,15 0,83 4,45 3,48 2,73 5,84
3.7.3 Chrom
Zur Messung der Chrom-Konzentration wurde 1g des gefriergetrockneten und gemahlenen Darmsaftes in einen 45 ml Aschetiegel eingewogen und bei 105°C über Nacht getrocknet.
Nach Bestimmung des Trockensubstanzgehaltes erfolgte die Veraschung bei 550°C im Muffelofen und die Rückwaage des Aschegehaltes.
Zu der veraschten Probe wurden 3 ml Phosphorsäure-Mangansulfatlösung und 4 ml 4,5 %ige Kalium-Bromatlösung zugegeben und zum Sieden gebracht. Nach Abkühlung in Eiswasser wurde die Lösung vollständig in einen 250 ml-Kolben überspült und nach Zugabe von 25 ml Kalziumchloridlösung mit bidestilliertem Wasser auf 250 ml aufgefüllt. Nach Filtration (Filter: Fa. Schleicher & Schuell, Faltenfilter 595 ½, ∅ 270mm, No. 10311652) erfolgte die Chrom-Messung in dieser Lösung mittels Atomabsorptionsspektrometer (GBC 908AA) mit Hilfe einer vorher angefertigten Standardkurve. Auf gleiche Weise fand die Bestimmung des Blindwertes im chromfreien Darmsaft statt.
Zur Bestimmung des Chrom-Gehaltes in der eingesetzten Markermischung (Chromkuchen) wurde 1 g chromfreier Darmsaft mit 10 mg feingemörsertem Chromkuchen eingewogen. Der weitere Analysengang erfolgte wie beschrieben.
Die Zusammensetzungen der einzelnen Reagenzien ist im Anhang 4 dargestellt.
Der Variationskoeffizient der Analysenpräzision belief sich auf 4,76 %.
3.7.4 Flüchtige Fettsäuren im Pansensaft
Die flüchtigen Fettsäuren im aufgetauten Pansensaft wurden in Anlehnung an GEISSLER et al. (1976) mittels Gaschromatographie (Hewlett Packard, 5880 A, FID) bestimmt. Die Trennung der Säuren erfolgte auf einer 200 cm langen Glassäule (15% Dioctylsebacinat und Sebacinsäure als stationäre Phase auf 60-100 mesh Kieselgur).
Tabelle 17: Variationskoeffizienten (VK) der Analysenpräzision der flüchtigen Fettsäuren
3.7.5 Ammoniak-Stickstoff im Pansensaft
Die Bestimmung des Gehalts an Ammoniak-Stickstoff im Pansensaft erfolgte nach einer modifizierten Conway-Methode (VOIGT und STEGER, 1967) mit Hilfe einer Mikrodiffusionsapparatur, wobei der Variationskoeffizient 9,98 % betrug.
Nach Ermittlung des pH-Wertes wurde der Pansensaft 5 Minuten bei 3000 U/min zentrifugiert (Varifuge 3.OR), 1 ml des Überstands in die Becher des Mikrodiffusionsgefäßes pipettiert und im Anschluss mit 1 ml gesättigter Kaliumkarbonat-Lösung vorsichtig unterschichtet. Der Kolben wurde mit 4 ml Borsäure (Zusammensetzung siehe Anhang 3) beschickt. Während der Ansatz bei Raumtemperatur über 24 Stunden im Dunkeln stand, konnte der in der Pansensaftprobe enthaltene Ammoniak-Stickstoff durch die Kaliumkarbonatlösung ausgetrieben und in der Borsäure eingefangen werden. Die anschließende Titration der Borsäurevorlage erfolgte mit 0,01 n HCl.
Die Berechnung des Ammoniak-N-Gehalts im Pansensaft erfolgte nach folgender Formel:
mg NH3-N / 100 ml = ( ml 0,01 n HCl (titriert) – Blindwert ) * 14
Die Ermittlung des Blindwertes wurde in einem Ansatz ohne Probe durchgeführt.
3.7.6 Mikrobielles Rohprotein
Die Bestimmung des mikrobiellen Rohproteins in den gefriergetrockneten Darmsaftproben erfolgte mittels NIRS nach der von LEBZIEN und PAUL (1997) beschriebenen Methode (VK = 4,83%). Dazu wurden Aliquote der einzelnen Tagessammelproben von jedem Tier pro Versuchsperiode anhand des täglichen Trockensubstanz-Flusses zu einer Wochensammelprobe zusammengefasst.
In Anlehnung an SCHAFFT (1983) erfolgte die Berechnung der fermentierbaren organischen Substanz nach folgender Formel:
FOS = OS-Aufnahme – (OS am Duodenum – Mikroben-OS)
Dabei gilt: Mikroben-OS = 11,8 * Mikroben-N.
Die Effizienz der mikrobiellen Proteinsynthese (g Mikrobenprotein / kg FOS) errechnete sich ebenfalls in Anlehnung an SCHAFFT (1983).
3.7.7 Kobalt-Gehalt im Darmsaft
Zur Bestimmung von Kobalt im Darmsaft siehe Kapitel 3.7.2. Der Variationskoeffizient betrug hierbei 4,64 %.
3.7.8 Vitamin B12 im Darmsaft
Der Vitamin B12-Gehalt im Darmsaft wurde sowohl in der Frischsubstanz als auch im getrockneten Darmsaft ermittelt.
Die Analyse in der Frischsubstanz erfolgte im VetMed-Labor in Ludwigsburg mit Hilfe eines Radioimmuno-Assays (SimulTRAC-SNB Radioassay Kit Vitamin B12). Bei diesem Testverfahren handelt es sich um einen kompetitiven Proteinbindungsassay, wobei nicht markiertes Vitamin B12 aus der zu untersuchenden Probe mit radioaktiv markiertem Vitamin B12 um eine begrenzte Anzahl von Bindungsstellen an Vitamin B12-Antikörpern konkurriert.
Die Antikörper sind kovalent an einen festen Träger gebunden und das markierte Vitamin B12
enthält radioaktives 57Co. Die im Präzipitat gemessene Radioaktivität ist umgekehrt proportional zur Konzentration an Vitamin B12 in der Probe.
Die Bestimmung des Vitamin B12-Gehalts im getrockneten Darmsaft wurde mittels Enzymimmunoassay (Firma r-biopharm, RIDASCREEN® Vitamin B12, No. R2101) im Institut für Tierernährung und im Institut für Pflanzenbau und Grünlandwirtschaft der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft durchgeführt. Dieser ursprünglich für Lebens- und Futtermittel entwickelte Test konnte für die Vitamin B12-Messung im gefriergetrockneten Darmsaft modifiziert werden. Das Testprinzip beruht ebenfalls auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion. Im Gegensatz zu der vorhergehend beschriebenen Methode konkurriert hier enzymmarkiertes Vitamin B12 mit dem in der Probe vorhandenen Vitamin B12. Nach Zugabe von Substrat, Chromogen und Stopp-Reagenz entsteht aus dem farblosen Chromogen eine gelbe Lösung, in der anschließend bei 450 nm Wellenlänge die Extinktion bestimmt wird. Die Extinktion der Lösung ist umgekehrt proportional zur Vitamin B12-Konzentration der Probe.
Bei Verwendung des Radioimmuno-Assays betrug der Variationskoeffizient 8,21 %, beim Enzymimmuno-Assay 3,56 %.
3.7.9 Blutparameter
Die Blutparameter wurden alle im Klinischen Labor der Klinik für Rinderkrankheiten der Tierärztlichen Hochschule Hannover bestimmt.
3.7.9.1 Vitamin B12 und Folsäure
Für die quantitative Bestimmung von Vitamin B12 im Serum wurde das automatische Chemilumineszenzsystem ACS 180® der Firma Bayer verwendet. Es handelt sich hierbei um einen kompetitiven Assay. Dabei konkurriert das in der Serumprobe befindliche Vitamin B12
mit markiertem Vitamin B12 um eine begrenzte Menge an Intrinsic Factor, der an eine feste Phase gebunden ist. Damit auch an Bindungsproteine im Serum gebundenes Vitamin B12
erfasst werden kann, wird bei dem Test das gebundene Vitamin freigesetzt und eine erneute Bindung an Proteine verhindert. Zwischen dem in der Probe enthaltenen Vitamin B12 und den vom System gemessenen relativen Lichteinheiten (RLU) besteht ein umgekehrt proportionales Verhältnis. Der Variationskoeffizient für die Vitamin B12-Bestimmung betrug 4,45 %.
Die Folsäure-Konzentrationen im Serum wurden nach dem gleichen Prinzip am gleichen Gerät gemessen. Der Variationskoeffizient betrug hierbei 5,05 %.
3.7.9.2 Glukose, Gesamtbilirubin, Harnstoff, ß-Hydroxy-Buttersäure, AST, GLDH und γ-GT
Für die Bestimmung dieser Parameter wurden kommerzielle Test-Kits angewandt, wobei es sich in allen Fällen um enzymatische bzw. kinetische UV-Tests handelte (Tabelle 18 ). Die genaue Testbezeichnung und das jeweilige Testprinzip sind Anhang 5 zu entnehmen.
Tabelle 18: Übersicht über die verwendeten Testverfahren mit Variationskoeffizienten der Präzision
Parameter Test-Prinzip Einheit VK (%)
Glukose enzymatisch mmol/l 3,27
Harnstoff enzymatischer mmol/l 2,83
ß-Hydroxybuttersäure kinetisch-enzymatisch mmol/l 8,65 Gesamtbilirubin kinetisch-enzymatisch µmol/l 4,22
AST kinetisch U/l 2,07
GLDH kinetisch U/l 3,51
γ-GT kinetisch U/l 3,95
3.7.9.3 Eisen
Die Bestimmung des Eisengehaltes in den Blutproben erfolgte mittels Atomabsorptionsspektrometrie, wobei der Variationskoeffizient 9,74% betrug.
3.7.10 Milchinhaltsstoffe
In den in beiden Versuchen gewonnenen Milchproben wurden im Milchlabor des Instituts für Tierernährung der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Milchfett, Milcheiweiß sowie Laktose bestimmt.
Die Messungen erfolgten mit Hilfe eines MILCOSCAN®-4000 der Firma Foss Electric. Dabei wurde durch die Milchprobe ein Infrarot-Strahl mit einer Wellenlänge von λ=573 µm geleitet.
Durch Absorption des Lichtes an den Milchinhaltsstoffen wird der Lichtstrahl abgeschwächt und dieses im Vergleich zu einem Referenzstrahl gleicher Wellenlänge in einer Photozelle gemessen (KOTTERER und MÜNCH, 1985).
3.7.11 Vitamin B12 in der Milch
Die Bestimmung der Vitamin B12-Konzentrationen in der Milch und im Kolostrum erfolgte im Veterinärmedizinischen Labor (VetMed®) in Ludwigsburg. Hierzu wurde der gleiche Radioimmunoassay verwendet, wie bei der Bestimmung von Vitamin B12 im Darmsaft (Kap.
3.7.8). Der Variationskoeffizient betrug hierbei 7,94%.
3.7.12 Kobalt im Lebergewebe
Das bei der Leberbiopsie gewonnene Lebergewebe wurde nach dem Einwiegen einem Vollaufschluss mit 2 ml 65 %iger Salpetersäure (Fa. Merck, 100441) und 1 ml 30%igem Wasserstoffperoxid (Fa. Merck, 107298) in einem Mikrowellengerät (Typ 1200 Mega der Firma MLS) unterzogen. Die so entstandene Lösung wurde mit Reinstwasser auf ein definiertes Volumen (10 ml) aufgefüllt.
Die Messung von Kobalt in der Lösung erfolgte anschließend mit einem ICP-OES-Spektrometer der Firma Spectro Analytical Instruments bei einer Wellenlänge von 228,6 nm, wobei sich der Variationskoeffizient auf 3,55% belief.
3.7.12.1 Vitamin B12 im Lebergewebe
Aus der mittels ICP-Analytik bestimmten Kobalt-Konzentration im Lebergewebe lässt sich nach folgender Formel die Vitamin B12-Konzentration im Lebergewebe berechnen (MITSIOULIS et al., 1995). Die Grundlage der Formel stellen Untersuchungen an über 9000
Lebern von Schlachtrindern dar, wobei ein hochsignifikanter Zusammenhang zwischen Kobalt und Vitamin B12 im Lebergewebe festgestellt wurde (r2=0,42; p<0,001).
Leber B12 in FS (nmol/kg) = 163 * Leber-Co (µmol/kg T) –109 oder
Leber B12 in FS (ng/kg) = [163 * Leber-Co (µmol/kg T) -109] * 1355
Da bei der angewendeten Methode die Kobalt-Konzentration nicht in der Trockensubstanz bestimmt wird, muss zur Umrechnung bei einem mittleren Trockensubstanzgehalt der Rinderleber von 30 % (MITSIOULIS et al., 1995) die Formel wie folgt verändert werden:
Leber B12 in FS (ng/kg) = [163 * Leber-Co (µmol/kg FS) * 3,33 –109] * 1355