Charakterisierung von cDNA-Klonen

1. Gekoppelte In-Vitro-Transkription/ Translation in Weizenkeimlingen

Die In-Vitro-Translation in Weizenkeimlingen wurde nach dem Protokoll von Promega (Mannheim) mit L-[³⁵S]-Methionine durchgeführt.

Zur gekoppelten In-Vitro-Transkription/Translation wurde 1 µg DNA des entsprechenden Plasmids, das die zu transkribierende cDNA-Sequenz enthielt, eingesetzt. Die Transkription erfolgte mit Hilfe der T3-RNA-Polymerase entsprechend der Anweisung von Promega.

Zur Identifizierung der radioaktiv markierten Translationsprodukte wurden die Proben auf einem 12,5% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Dann wurden die Gele bei 80°C in einem Vakuum-Geltrockner getrocknet und radioautographiert.

2. Überexpression in E. coli Stratagene mit dem Vektor pCal-kc und dem E. coli Stamm E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL

Nach Erprobung beider Systeme wurde für die Protein-Überexpression das „Affinity protein expression and purification“-System der Firma Stratagene benutzt. Dieses eröffnet die Möglichkeit, das überexprimierte Protein als Fusionsprotein mit Hilfe des Calmodulin-Bindungs-Peptid-Sektors (CBP) aus einem E. coli-Extrakt zu gewinnen. Durch eine Thrombin-Schnittstelle kann der CBP-Tag anschließend vom Zielprotein entfernt werden.

+ +

Donor Vektor pDonor201 PCR Produkt

für Rekombination

attB Gen attB attP ccdb attP attL Gen attL attR ccdB attR

PCR Produkt in dem Vektor BP Clonase

25^oC

2.2.4.2 Funktionsanalyse von Genen durch Post-transcriptional gene silencing (PTGS) Die Herstellung der PTGS-Konstrukte

Die Herstellung der PTGS-Konstrukte (bzw. RNAi-Konstrukte) erfolgte mit Hilfe des Vektors pHannibal. Dieser Vektor verfügt über eine Sequenz, die dem Intron der Pyruvat-Orthophosphat-Dikinase aus Flaveria trinervia (Rosche et al. 1990, 1994) entspricht und die sich in der multiplen Klonierungsstelle befindet. Der Vektor hat außerdem die geeigneten Schnittstellen, um eine anschließende Klonierung in den binären Vektor pArt 27 zu ermöglichen.

Mit der entsprechenden Primerkombination (siehe unten) wurde ein Konstrukt, das die codierende Sequenz in Sense- und Antisense-Orientierung enthielt, durch PCR hergestellt.

Forward Primer 5’-C TCTAGA CTCGAG -3’

Reverse Primer 5’-CC ATCGAT GGTACC-3’

PCR Produkt nach dieser Primerkombination

Abb. 4: Primerkombination für die Klonierung in pHannibal

Zuerst wurde mit Hilfe der Schnittstellen (Xhol und KpnI) die erste Klonierung (Sense-Teil) durchgeführt. Nach Bestätigung durch eine Kontrolle konnte dann der Antisense-Teil mit den externen Schnittstellen kloniert werden. Abb. 5 zeigt eine Grafik dieser Klonierung.

XbaI, XhoI KpnI, ClaI

Abb. 5: Klonierungsschema von RNAi-Konstrukten mit dem pHannibal-Vektor (Wesley et al.

2001)

Der Vektor pHannibal mit der cDNA in Sense-Antisense-Orientierung wurde geschnitten und in den Vektor pArt27 kloniert. Dieser besitzt den notwendigen restlichen Teil für die T-DNA und ist folgendermaßen aufgebaut:

Abb. 6: Schematische Darstellung des T-DNA-Teils des Sense-Antisense-Konstrukts.

Dieses Konstrukt wurde in Agrobakterien des Stammes LBA4404 transferiert, die später für die Transformation der Zellkultur dienen sollten.

2.2.4.3 Transformation der Chenopodium rubrum-Zellen

Transformation mittels Agrobakterien (LBA4404) in Zellkulturen

Für die Tranformation der Zellkultur von Chenopodium rubrum wurde zuerst eine Agrobakteriumkultur (LBA4404) unter Einfluss der Antibiotika Spectinomycin und Streptomycin bei 30^o wachsengelassen. Diese Kultur enthielt das kointegrative Plasmid pArt27+T-DNA für die RNAi aus pHannibal. Danach wurden die Agrobakterien 10 Minuten lang bei 4000 rpm abzentrifugiert, in MS-Medium aufgenommen und die OD600 auf 1,0

T-DNA Teil aus pHannibal

ANTISENSE SENSE

eingestellt. Mit 4 ml dieser Suspension wurde die Zellkultur mit Hilfe von Acetosyringon (100 mM) infiziert.

Transformiert wurden verschieden alte Zellkulturen (autotrophe Zellkultur: 7, 14 und 21 Tage alt, heterotrophe Zellkultur: 7d alt). Um die Agrobakterien abzutöten, wurde nach 4 bis 5 Tagen Cefotaxim zugegeben. Nach weiteren 4 Tagen wurde Kanamycin in das MS-Medium gegeben, um die transformierten Zellen zu selektieren. Alternativ wurde ein Teil des Ansatzes auf Agarplatten mit Glucose und Kanamycin übertragen.

Transformation mittels Partikelbeschuss von Chenopodium rubrum-Kalli.

Mikrokallus von Chenopodium rubrum wurde auf eine MS-Agarplatte mit Glucose übertragen und eine Woche lang wachsengelassen. Dann wurde mittels Partikelbeschusses transformiert (Klein et al. 1987).

Beschichten der Goldsuspension

Der Hersteller der Beschusskanone (Biorad, Modell PDS-1000/He) empfiehlt in seiner Gebrauchsanweisung folgendes Vorgehen:

Zur Herstellung der Goldlösung wiegt man 60 mg Gold (BioRAD; München) ab und wäscht das Material 10 Minuten lang in 70%igem Ethanol. Anschließend zentrifugiert man die Partikel in der Eppendorfzentrifuge kurz ab und wäscht diese dreimal mit sterilem, bidestilliertem Wasser, bevor man sie schließlich in 1 ml einer 50%igen Glycerinlösung (625 µl Glycerin und 375 µl Wasser) aufnimmt.

12,5 µl der Goldsuspension „1,0“ (1 µm Durchmesser) werden in einem Eppendorfgefäß gut durchgemischt, bevor 1 µg der zu transformierenden DNA am Rand des Gefäßes zugegeben werden. Den Ansatz mischt man eine Minute lang gründlich, wobei die DNA an das Goldmaterial bindet. Nach der getrennten Zugabe von 5 µl Spermidin und 12,5 µl 2,5 M CaCl2 wird wiederum 3 Minuten lang gemischt und kurz in der Eppendorf-Zentrifuge sedimentiert. Den Überstand entfernt man, während der Niederschlag zweimal mit je 250 µl 70%igem Ethanol gewaschen wird. Abschließend wurde das Sediment in 72µl 98%igem Ethanol aufgenommen.

12 µl der Suspension wurden auf einen bereits sterilisierten Makro-Träger mittig aufgebracht. Nachdem der Alkohol verdunstet ist, kann der Träger für den Beschuss eingesetzt werden.

Beschuss

Zur Vorbereitung werden die benötigten Stopping-Screen-Gitter und Rupture-Disk-Plättchen in 70%igem Ethanol mindestens 15 Minuten lang gewaschen und anschließend an der Luft getrocknet. Die Vakuumpumpe wird eingeschaltet, und ein Heliumdruck von mindestens 1300 psi eingestellt. Man legt ein Rupture-Disk in das obere Drehteil der Beschusskanone ein und schraubt dieses mit dem Drehmomentschlüssel fest. In die Metallhalterung des Schubteils wird ein Stopping-Screen eingelegt, bevor darauf der Makro-Träger-Halter mit dem mit Gold-DNA versehenen Makro-Träger geschraubt wird. Das komplette Schubteil wird in die erste Leiste eingeführt, eine geöffnete MS-haltige Petrischale mit Kallus in die dritte. So ergibt sich eine Flugstrecke der Goldpartikel von etwa 6 Zentimetern.

Nach dem Schließen der Plexiglastür wird durch die Pumpe evakuiert. Sobald der Luftdruck innerhalb der Kanone auf unter 27 mm Hg gesunken ist, wird der Druck konstant gehalten, und der Schuss durch Heliumgas eingeleitet: erreicht der Heliumdruck innerhalb der Kammer einen Wert von mehr als 1300 psi, so wird die Rupture-Disk durchbrochen, und die DNA-behafteten Goldpartikel fliegen auf das zu beschießende Material (Fettig 1998).

Selektion transformierter Chenopodium rubrum-Zellen

Die Selektion der Kallus-Kulturen auf Agar geschieht durch Überimpfen der noch vitalen Kalli auf eine Kanamycin-haltige MS-Platte (25 µg Kanamycin/ml Medium). Da auf diesem Selektionsmedium nur erfolgreich transformierte Zellen wachsen, steigt der Anteil an Transformanten nach jeder Subkultur bis zur vollständigen Selektion an.

Danach werden die Kalli in eine Suspensions-Batchkultur gegeben, so wie auch die Anzucht bei Vorhandensein einer Kanamycinkonzentration von 7,5 µg/ml erfolgt (siehe 2.2.1.1).