Charakterisierung des Infektionsphänotyps von transgenen pSAG12:IPT A

Neben den pharmakologischen Applikationen mit BAP (Kapitel 3.2.5) und INCYDE (Kapitel 3.2.6) wurde ergänzend ein transgener Ansatz gewählt, um den Effekt der Stabilisierung der Cytokinin-Homöostase auf den Infektionsphänotyp von Vl43-infizierten A. thaliana Pflanzen zu testen.

Abb. 20: Quantitative RT-PCR von Vl43-infizierten und Kontroll- A.

thaliana Col-0 Pflanzen des Senescence Associated Genes 12 (SAG12).

Im Zeitverlauf von 14, 21, 28 und 35 dpi wurden die Pflanzen geerntet.

Aufgetragen sind die ΔΔCT-Werte. Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung der Mittelwerte von n = 9 Pflanzen (3*3 vereinte Proben) aus drei biologischen Wiederholungen.

Dafür wurden stabil transformierte A. thaliana Col-0 Wildtyp-Pflanzen erstellt, die die Isopentenyltransferase (IPT) von Agrobacterium tumefaciens unter Kontrolle des Senescence Associated Genes 12 (SAG12)-Promotors exprimierten (Gan et al., 1995).

Genexpressionsanalysen zeigten, dass Vl43 ab dem Zeitpunkt 14 dpi die Expression von SAG12 induziert (Abb. 20). In diesem Experiment sollte der Vl43-induzierten

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25

Induktion über Referenz

Kontrolle infiziert mit Vl43

Col-0 / SAG12

n.d. n.d. n.d.

Cytokininreduktion mit pathogen aktivierter Cytokininproduktion entgegengewirkt werden, so dass die Cytokinin-Homöostase aufrechterhalten wird (Swartzberg et al., 2008).

Abb. 21: Phänotypen der transgenen pSAG12:IPT Pflanzen im A. thaliana Col-0 Hintergrund zu den Zeitpunkten 39 und 56 dpi unter Langtagbedingungen. (A, E) Phänotyp von Col-0, (B, F) Phänotyp der pSAG12:IPT 3-1 Linie, (C, G) Phänotyp der pSAG12:IPT 16-2 Linie, (D, H) Phänotyp der pSAG12:IPT X-4 Linie. (I) sqRT-PCR des IPT-Gens von A. tumefaciens der transgenen Linien und Col-0 39 d. Ubiquitin5 diente als Referenz. (J) Bestimmung der Konzentration von Chlorophyll^a+b der transgenen Linien im Vergleich zu Col-0 39 d.

Es wurden drei unabhängige, stabil transformierte pSAG12:IPT Linien unter Langtagbedingungen im Zeitraum von 56 Tagen (d) charakterisiert. Dabei sollte vor Beginn der Infektionsexperimente der Effekt der seneszenzinduzierten IPT-Expression auf die Seneszenzausprägung in Arabidopsis bestimmt werden. Die Phänotypen der pSAG12:IPT Linien sind zu zwei verschiedenen Zeitpunkten im Vergleich zu Col-0 gezeigt (Abb. 21 A-H).

Im Allgemeinen sind die pSAG12:IPT Linien optisch etwas größer und grüner als Col-0 zum Zeitpunkt 39 d (Abb. 21 A-D). Es zeigte sich, dass der Chlorophyll^a+b-Gehalt in pSAG12:IPT Linien jeweils höher war als in Col-0 (Abb. 21 J). In der semiquantitativen RT-PCR ist die Expression von IPT (A. tumefaciens) der transgenen Linien zum Zeitpunkt 39 d im Verhältnis zur Referenz Ubiquitin5 gezeigt (Abb. 21 I). Das Transkript konnte in den ausgewählten

transgenen Linien nachgewiesen werden. Der Abreifungsprozess dauerte in pSAG12:IPT Linien etwa eine Woche länger als in Col-0 (Abb. 21 E-H). Des Weiteren produzierten pSAG12:IPT Pflanzen mehr Seitentriebe. Dies war besonders deutlich in der Linie 16-2 zu erkennen (Abb. 21 G). Diese drei charakterisierten Linien wurden im nächsten Schritt mit Vl43 infiziert und der Symptomverlauf dokumentiert sowie die pilzliche DNA Menge bestimmt.

Abb. 22: Phänotypen von Kontroll- und Vl43-infizierten A. thaliana Col-0 WT-Pflanzen und pSAG12:IPT transgene Linien im Zeitverlauf 7, 14, 21, 28 und 35 dpi unter Kurztagbedingungen. (A, E) Phänotyp von Col-0 Kontrolle und Vl43-infiziert 35 dpi, (B, F) Phänotyp der pSAG12:IPT 3-1 Linie Kontrolle und Vl43-infiziert 35 dpi, (C, G) Phänotyp der pSAG12:IPT 16-2 Linie Kontrolle und Vl43-infiziert 35 dpi, (D, H) Phänotyp der pSAG12:IPT X-4 Linie Kontrolle und Vl43-infiziert 35 dpi. (I) Vermessung der Blattfläche, (J) Bestimmung der pilzlichen DNA-Menge, (K) Bestimmung der chlorotischen und (L) der nekrotischen Blätter in Col-0 und pSAG12:IPT 16-2, jeweils Kontrolle und Vl43-infiziert. Die Fehlerbalken repräsentieren die Standardabweichung der Mittelwerte, mit allgemein n = 18 und (J) n = 9 (3*3 vereinte Proben) biologische Wiederholungen. Statistisch signifikante Unterschiede zwischen Kontroll- und infizierten Pflanzen sind durch zwei (P ≤ 0,01) oder drei (P ≤ 0,001) Sterne gekennzeichnet. Maßstab = 3 cm.

0,00

Der Phänotyp der infizierten transgenen Linien entsprach ungefähr dem Phänotyp der pharmakologisch behandelten, infizierten Pflanzen (Kapitel 3.2.5, Kapitel 3.2.6).

Die uninfizierten pSAG12:IPT Pflanzen zeigten im Vergleich zu Col-0 keine Unterschiede im Phänotyp sowie in der Blattfläche im Zeitverlaufsexperiment 7 - 35 dpi unter Kurztagbedingungen (Abb. 22 A-D, I). In den Graphen sind aus Gründen der Übersichtlichkeit nur die Daten von Col-0 und pSAG12:IPT 16-2 gezeigt (Abb. 22 I-L) und im Anhang die der Linien 3-1 und X-4 (Abb. 51). Die weiteren Linien wiesen die gleiche Tendenz wie die Linie 16-2 auf.

Der Phänotyp der stabil-transformierten pSAG12:IPT Linien zeigte nach Vl43-Infektion im Vergleich zu einer normalen Col-0 Infektion 35 dpi auch stunting und gerollte Blätter (Abb.

22 E-H). Die Seneszenz war jedoch deutlich reduziert. Des Weiteren waren die pSAG12:IPT Pflanzen optisch grüner als infizierte Col-0 Pflanzen (Abb. 22 E-H). Ab 21 dpi war der Blattflächenzuwachs in L16-2 signifikant höher als in Col-0 Pflanzen (Abb. 22 I). Die Blattflächenreduktion in L16-2 infizierten Pflanzen war mit ca. 58 % geringer als in der Kontrollinfektion mit ca. 90 % zum Zeitpunkt 35 dpi. Die Proliferation von Vl43 war auch deutlich beeinträchtigt (Abb. 22 J).

Zur Quantifizierung der Seneszenz wurde die Anzahl der chlorotischen und nekrotischen Blätter im Zeitverlauf 7 - 35 dpi bestimmt (Abb. 22 K/L). Im Allgemeinen konnten 35 dpi die ersten chlorotischen und nekrotischen Blätter in den Kontrollen und ab 21 dpi in den infizierten Pflanzen gezählt werden. Die Anzahl von chlorotischen Blättern nahm in infizierten Col-0 Pflanzen von 21 - 35 dpi zu. Eine Zunahme gab es auch in der Linie 16-2, aber signifikant geringer als in 0 Pflanzen. Die ersten nekrotischen Blätter traten bei Col-0 infizierten Pflanzen nach 21 dpi auf und wurden mit zunehmender Infektion drastisch mehr.

Die Anzahl der nekrotischen Blätter in pSAG12:IPT 16-2 nahm hingegen signifikant geringer zu als in Col-0.

Die Charakterisierung der Vl43-infizierten pSAG12:IPT Linien ergab, dass Pathogen-induzierte Synthese von Cytokinin (beginnend ab 14 - 21 dpi (Anhang: Abb. 50) zu einer Reduktion der Vl43-induzierten Seneszenz führte. pSAG12:IPT Linien zeigten geringere Blattflächenreduktion, eingeschränkte Vl43-Proliferation und eine verminderte Bildung von chlorotischen sowie nekrotischen Blättern.

3.3 Charakterisierung der durch V. longisporum 43-induzierten