Charakterisierung der Überexpressionsmutanten im Wildtyp 8/1 und ΔGpmk1

94 3.4.1.2 Charakterisierung der Überexpressionsmutanten im Wildtyp 8/1 und ΔGpmk1

95 Es konnten demnach erfolgreich jeweils zwei Überexpressionsmutanten des Gens FGSG_00006 im Wildtyp 8/1 und der ΔGpmk1 identifiziert werden, welche in der folgenden Analyse als OEWT FGSG_00006 und OEΔG FGSG_00006 bezeichnet werden. Bei individueller Betrachtung der getesteten Mutanten M1 und M2 wird diese Benennung weiterhin angewendet.

Abb. 45: Transkriptionsprofil des Gens FGSG_00006 in verschiedenen Mutanten in Relation zum Wildtyp 8/1. Die relative Transkription des FGSG_00006 in der ΔGpmk1 und jeweils zweier unabhängiger Überexpressionsmutanten (M1 und M2) OEWT FGSG_00006 und OEΔG FGSG_00006 im Vergleich zum Myzel des Wildtyps 8/1 (WT MY). Das Transkriptionsniveau des Wildtyps 8/1 wurde auf 1 gesetzt (gestrichelte Linie).

Zur Analyse mittels qRT-PCR wurde cDNA aus dem jeweiligen Myzel verwendet (3 dpi). Statistische Auswertung mittels einfaktorieller Varianzanalyse mit anschließendem Post-Hoc t-Test und Bonferroni-Korrektur. p*=0,00083.

3.4.1.2.2 Infektionsstudie mit der OEWT FGSG_00006 und OEΔG FGSG_00006 auf Weizen

Die Pathogenität der Überexpressionsmutanten des Gens FGSG_00006 im Wildtyp 8/1 und der ΔGpmk1 wurde mittels einer Infektionsstudie auf Weizen untersucht. Hierfür wurde das F. graminearum-anfällige Weizenkultivar ‘Nandu’ mit Konidien der jeweiligen Mutante und den Referenzstämmen inokuliert und nach 21 Tagen ausgewertet (2.2.17.1).

Die Infektion des Weizens durch die Mutante OEWT FGSG_00006 war im Vergleich zum Wildtyp 8/1 stark reduziert. Im Gegensatz zum Wildtyp 8/1, der die gesamte Ähre infizieren konnte, war die Infektion der Mutante OEWT FGSG_00006 auf das inokulierte Ährchen beschränkt. Dies entspricht einer anteiligen Infektion der Weizenähre von etwa 9 % (Abb. 46, Abb. 47). Die Überexpression des Gens in der Mutante OEΔG FGSG_00006 führte zu einem mit dem Hintergrund ΔGpmk1 identischen Infektionsverlauf. Ausschließlich Palea und Lemma des inokulierten Ährchens zeigte leichte Nekrosen (Abb. 48).

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Abb. 46: Infektionsstudie auf Weizen mit der Überexpressionsmutante OEWT FGSG_00006. Infektion von Weizenähren (21 dpi) (Kultivar ‘Nandu’) durch den Wildtyp 8/1, die ΔGpmk1 und durch zwei unabhängige Mutanten der OEWT FGSG_00006 (M1 und M2) jeweils in Frontalansicht (linke Ähre) und Seitenansicht (rechte Ähre). Die Inokulation wurde an den mit schwarzen Punkten und Pfeilen gekennzeichneten Ährchen durchgeführt. Die mit H2O gekennzeichnete Ähre wurde mit sterilem Wasser scheininokuliert. Es wurden jeweils 14 unabhängige Replikate ausgewertet.

Abb. 47: Infektionsstudie auf dem Weizenkultivar ‘Nandu’ mit der Überexpressionsmutante OEWT FGSG_00006. Relative Infektion einer Ähre (21 dpi) durch den Wildtyp 8/1 und die OEWT FGSG_00006. Es wurden jeweils 14 unabhängige Replikate ausgewertet. Die Fehlerindikatoren zeigen die Standardabweichung.

Statistische Auswertung mittels einfaktorieller Varianzanalyse mit anschließendem Post-Hoc t-Test und Bonferroni-Korrektur. p*≤0,0025.

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Abb. 48: Infektionsstudie auf Weizen mit der Überexpressionsmutante OEΔG FGSG_00006. Infektion von Weizenähren (21 dpi) (Kultivar ‘Nandu’) durch den Wildtyp 8/1, die ΔGpmk1 und durch zwei unabhängige Mutanten der OEΔG FGSG_00006 (M1 und M2) jeweils in Frontalansicht (linke Ähre) und Seitenansicht (rechte Ähre). Die Inokulation wurde an den mit schwarzen Punkten und Pfeilen gekennzeichneten Ährchen durchgeführt. Die mit H2O gekennzeichnete Ähre wurde mit sterilem Wasser scheininokuliert. Es wurden jeweils 14 unabhängige Replikate ausgewertet.

3.4.1.2.3 Asexuelle Reproduktion der OEWT FGSG_00006 und OEΔG FGSG_00006 Um potentielle Unterschiede in der asexuellen Reproduktion der Mutanten OEWT FGSG_00006 und OEΔG FGSG_00006 zu erkennen, wurde durch Inkubation in flüssigem Medium aus Weizenblättern die Bildung von Konidien induziert und nach sechs Tagen im Vergleich zum Wildtyp 8/1 und der ΔGpmk1 betrachtet (2.2.13).

Der Wildtyp 8/1 hat in diesem Zeitraum etwa 64 Konidien pro µl produziert. Die OEWT FGSG_00006 hat im Vergleich dazu mit etwa 33 Konidien pro µl nur die Hälfte des Wildtyps 8/1 gebildet. Die ΔGpmk1 hat etwa 122 Konidien pro µl produziert. Die OEΔG FGSG_00006 hat demnach mit etwa 116 Konidien pro µl eine mit dem Ursprungsstamm ΔGpmk1 vergleichbare Anzahl an Konidien erstellt (Abb. 49).

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Abb. 49: Asexuelle Reproduktion der Überexpressionsmutanten OEWT FGSG_00006 und OEΔG FGSG_00006 in flüssigem Weizenmedium. Die Produktion von Konidien des Wildtyps 8/1, der ΔGpmk1, der OEWT FGSG_00006 und der OEΔG FGSG_00006 wurde durch Zählung der gebildeten Konidien (6 dpi) untersucht. Es wurden drei biologische Replikate von zwei unabhängigen Überexpressionsmutanten ausgewertet.

Die Fehlerindikatoren zeigen die Standardabweichung. Statistische Auswertung mittels einfaktorieller Varianzanalyse mit anschließendem Post-Hoc t-Test und Bonferroni-Korrektur. a: Signifikanz ggb. Wildtyp 8/1, b: Signifikanz ggb. ΔGpmk1. p^a,b ≤0,000025.

3.4.1.2.4 Die OEWT FGSG_00006 und OEΔG FGSG_00006 unter osmotischem und oxidativem Stress

Um den Einfluss der konstitutiven Expression des Gens FGSG_00006 im Wildtyp 8/1 und der ΔGpmk1 unter osmotischem und oxidativem Stress zu untersuchen, wurde eine Wachstumsstudie auf CM-Festmedium mit einem Zusatz von Natriumchlorid (NaCl) und Wasserstoffperoxid (H2O2) in verschiedenen Konzentrationen durchgeführt (2.2.18).

Die Überexpression des Gens führte in der Mutante OEWT FGSG_00006 zu einem um etwa 4 % tendenziell leicht gesteigerten Wachstum im Vergleich zum unmodifizierten Wildtyp 8/1 auf CM-Festmedium ohne einen speziellen Zusatz (Abb. 50, Abb. 52).

Eine Zugabe von 0,8 M NaCl führte bei der Mutante OEWT FGSG_00006 zu einem mit dem Wildtyp 8/1 vergleichbaren Anstieg des Wachstums. Auch die Mutante OEΔG FGSG_00006 zeigte eine Steigerung des Wachstums um etwa 2 %. Somit wird die Wachstumsreduktion des ΔGpmk1-Hintergrunds durch die Überexpression des FGSG_00006 kompensiert und führt zu einem um etwa 8 % gesteigerten Koloniedurchmesser im Vergleich zur ΔGpmk1 (Abb. 50, Abb. 51, Abb. 52).

Die Zugabe von 1,2 M NaCl verursachte bei allen getesteten Stämmen eine Reduktion des Wachstums. Mit einer Verringerung des Wachstums um etwa 12 % ist die Mutante OEWT FGSG_00006 allerdings weniger anfällig gegenüber osmotischem Stress und zeigt im Vergleich zum Wildtyp 8/1 ein etwa 6 % erhöhtes Wachstum unter 1,2 M NaCl.

99 Die Reaktion der Mutante OEΔG FGSG_00006 war vergleichbar mit der des Transformationshintergrunds ΔGpmk1 (Abb. 50, Abb. 51, Abb. 52).

Unter oxidativem Stress durch die Zugabe von H2O2 wurde das Wachstum beider Überexpressionsmutanten sowie des Wildtyps 8/1 und der ΔGpmk1 mit steigender Konzentration reduziert. Im Vergleich zum Wildtyp 8/1 wurde die Mutante OEWT FGSG_00006 durch 20 mM H2O2 etwa 6 % weniger im Wachstum reduziert und zeigte damit eine höhere Toleranz gegenüber hohen Konzentrationen von H2O2. Im Gegensatz dazu führte die Supplementation des Mediums mit H2O2 bei der Mutante OEΔG FGSG_00006 zu einer wesentlich stärkeren Reduktion des Wachstums. Im Vergleich zu den beiden Referenzstämmen Wildtyp 8/1 und ΔGpmk1 war der Koloniedurchmesser der Mutante OEΔG FGSG_00006 durchschnittlich um 7 % bei 10 mM H2O2, 6 % bei 15 mM H2O2 und 14 % bei 20 mM H2O2 stärker verringert (Abb. 53, Abb. 54, Abb. 55).

Abb. 50: Wachstum der OEWT FGSG_00006 unter hyperosmotischen Bedingungen. Das Wachstum wurde auf CM-Festmedium ohne und mit einem Zusatz von 0,8 M NaCl bzw. 1,2 M NaCl untersucht (3 dpi). Es wurden der Wildtyp 8/1, die ΔGpmk1 und zwei unabhängige Mutanten der OEWT FGSG_00006 (M1 und M2) verwendet.

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Abb. 51: Wachstum der OEΔG FGSG_00006 unter hyperosmotischen Bedingungen. Das Wachstum wurde auf CM-Festmedium ohne und mit einem Zusatz von 0,8 M NaCl bzw. 1,2 M NaCl untersucht (3 dpi). Es wurden der Wildtyp 8/1, die ΔGpmk1 und zwei unabhängige Mutanten der OEΔG FGSG_00006 (M1 und M2) verwendet.

Abb. 52: Wachstum der Mutanten OEWT FGSG_00006 und OEΔG FGSG_00006 unter hyperosmotischen Bedingungen. Der Koloniedurchmesser [mm] wurde auf CM-Festmedium ohne und mit einem Zusatz von 0,8 M NaCl bzw. 1,2 M NaCl gemessen (3 dpi). Es wurden jeweils 16 Replikate des Wildtyps 8/1, der ΔGpmk1 und zwei unabhängiger Mutanten der OEWT FGSG_00006 und der OEΔG FGSG_00006 verwendet. Die Fehlerindikatoren zeigen die Standardabweichung. Statistische Auswertung mittels einfaktorieller Varianzanalyse mit anschließendem Post-Hoc t-Test und Bonferroni-Korrektur. a: Signifikanz ggb. Wildtyp 8/1, b: Signifikanz ggb.

ΔGpmk1. p^a,b≤0,00833.

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Abb. 53: Wachstum der OEWT FGSG_00006 unter oxidativem Stress durch Wasserstoffperoxid. Das Wachstum wurde auf CM-Festmedium ohne und mit einem Zusatz von 10 mM H2O2 bzw. 15 mM und 20 mM H2O2 untersucht (3 dpi). Es wurden der Wildtyp 8/1, die ΔGpmk1 und zwei unabhängige Mutanten der OEWT FGSG_00006 (M1 und M2) verwendet.

Abb. 54: Wachstum der OEΔG FGSG_00006 unter oxidativem Stress durch Wasserstoffperoxid. Das Wachstum wurde auf CM-Festmedium ohne und mit einem Zusatz von 10 mM H2O2 bzw. 15 mM und 20 mM H2O2 untersucht (3 dpi). Es wurden der Wildtyp 8/1, die ΔGpmk1 und zwei unabhängige Mutanten der OEΔG FGSG_00006 (M1 und M2) verwendet.

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Abb. 55: Wachstum der Mutanten OEWT FGSG_00006 und OEΔG FGSG_00006 unter oxidativem Stress durch Wasserstoffperoxid. Der Koloniedurchmesser [mm] wurde auf CM-Festmedium ohne und mit einem Zusatz von 10 mM H2O2 bzw. 15 mM und 20 mM H2O2 untersucht (3 dpi). Es wurden jeweils 16 Replikate des Wildtyps 8/1, der ΔGpmk1 und zwei unabhängiger Mutanten der OEWT FGSG_00006 und der OEΔG FGSG_00006 verwendet. Die Fehlerindikatoren zeigen die Standardabweichung. Statistische Auswertung mittels einfaktorieller Varianzanalyse mit anschließendem Post-Hoc t-Test und Bonferroni-Korrektur. a: Signifikanz ggb. Wildtyp 8/1, b: Signifikanz ggb. ΔGpmk1. p^a,b≤0,00833.

3.4.1.2.5 Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies während des Wachstums der OEWT FGSG_00006 und OEΔG FGSG_00006

Zur Untersuchung des allgemeinen Oxidationszustands der Überexpressionsmutanten des Gens FGSG_00006 im Wildtyp 8/1 und der ΔGpmk1 während des Wachstums auf CM-Festmedium wurde eine Detektion von ROS mittels Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) durchgeführt. Durch das NBT wird Superoxid (O2-) konzentrationsabhängig blau angefärbt (2.2.19).

Sowohl der Wildtyp 8/1 als auch die ΔGpmk1 zeigten beide einen dunklen, blau gefärbten Ring am Rand der gewachsenen Kolonie. Das Myzel war generell leicht blau angefärbt.

Diese Färbung war im Zentrum der Kolonie der ΔGpmk1 stärker. Die rote Färbung war der natürliche durch F. graminearum synthetisierte Farbstoff Aurofusarin und stand nicht in Verbindung mit ROS oder der NBT-Färbung (Abb. 56).

Bei den Kolonien der Überexpressionsmutante im Wildtyp 8/1 OEWT FGSG_00006 konnte kein stark angefärbter äußerer Ring beobachtet werden. Der Oxidationszustand in dem neu gebildeten Myzel war demnach geringer als beim Wildtyp 8/1 und der ΔGpmk1. Das restliche Erscheinungsbild glich dem des Transformationshintergrunds Wildtyp 8/1 (Abb. 56).

Die Überexpression des Gens mit der ΔGpmk1 als Hintergrund der Mutante OEΔG FGSG_00006 zeigte keinen Unterschied in der Färbung mit NBT in Relation zur ΔGpmk1. Die Mutation hat also keinen Einfluss auf den Oxidationsgrad der OEΔG FGSG_00006 (Abb. 56).

103

Abb. 56: Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) beim Wachstum der OEWT FGSG_00006 und OEΔG FGSG_00006 mittels Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT). Der Oxidationszustand des Pilzes wurde nach Wachstum auf CM-Festmedium (3 dpi) durch Färbung mit NBT untersucht. Es wurden jeweils drei biologische Replikate des Wildtyps 8/1, der ΔGpmk1 und jeweils zwei unabhängiger Mutanten der OEWT FGSG_00006 (A) und der OEΔG FGSG_00006 (B) verwendet. CM: Unbehandelte Kolonie, NBT: Gefärbte Kolonie (dunkelblaue Färbung).

A

B

104 3.4.1.2.6 Fluoreszenzmikroskopische Betrachtung der Infektion von Weizenpaleae

durch die OEWT FGSG_00006

Für eine erfolgreiche Infektion von Weizen durch F. graminearum ist die Bildung von spezialisierten Strukturen auf der Oberfläche der Pflanze unabdingbar. Da die Überexpressionsmutante des Gens FGSG_00006 im Wildtyp 8/1 bereits auf dem Weizenkultivar ‘Nandu’ stark in der Pathogenität eingeschränkt war (3.4.1.2.2), wurde untersucht, ob die Mutante noch die Fähigkeit zur Formierung von Infektionsstrukturen besitzt. Hierfür wurden Weizenpaleae des Kultivars ‘Nandu’ mit dem Wildtyp 8/1 und der OEWT FGSG_00006 inokuliert, nach sieben Tagen mit dem Farbstoff WGA-CF™488A angefärbt und mittels CLSM fluoreszenzmikroskopisch untersucht (2.2.21).

Der Wildtyp 8/1 formte auf der Oberfläche der Palea ein weitreichendes Netzwerk aus Laufhyphen, in welchem vereinzelt Infektionskissen und Ansammlungen verschiedener Infektionsstrukturen gebildet wurden (Abb. 57). Die Infektionskissen hatten einen Durchmesser von etwa 20 µm und waren Ursprung mehrerer in das Pflanzengewebe wachsender Hyphen (Abb. 57C-F). Die vereinzelt auftretenden Aggregationen aus verschiedenen Infektionsstrukturen, wie gelappten Appressorien und Infektionskissen, hatten etwa eine Breite von 100 bis 200 µm (Abb. 57A-B).

Die Überexpressionsmutante OEWT FGSG_00006 bildete hingegen ausschließlich ein teils stark verzweigtes Netzwerk aus Laufhyphen. Obwohl sich die Hyphen an einigen Stellen mehrfach überkreuzten, wurden keine Infektionsstrukturen gebildet (Abb. 58).

105

Abb. 57: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Infektion von Weizenpaleae durch den Wildtyp 8/1 (7 dpi). Konfokale Laser Scanning Mikroskopie Aufnahmen der Oberfläche von Weizenpaleae des Kultivars

‘Nandu’. A+B: Übersichtaufnahme des Laufhyphennetzwerks und gebildeter Infektionsstrukturen. C-F:

Infektionskissen von F. graminearum. Autofluoreszenz der Pflanze (grau), Fluoreszenz des mit WGA-CF™488A gefärbten Chitins (grün), Fluoreszenz eines konstitutiv und zytoplasmatisch exprimierten DsRed (rot). Maßstab:

200 µm bzw. 40 µm.

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Abb. 58: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Infektion von Weizenpaleae durch die OEWT FGSG_00006 (7 dpi). Konfokale Laser Scanning Mikroskopie Aufnahmen der Oberfläche von Weizenpaleae des Kultivars ‘Nandu’. A-E: Dichtes Laufhyphennetzwerk der OEWT FGSG_00006 ohne erkennbare Infektionsstrukturen. F: Fokus auf mehrfach überkreuzt gewachsene Laufhyphen ohne Induktion der Entwicklung eines Infektionskissens. Autofluoreszenz der Pflanze (grau), Fluoreszenz des mit WGA-CF™488A gefärbten Chitins (grün). Maßstab: 200 µm bzw. 50 µm.

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