3. Der Bindungsmodus von Inhibitoren der Pf GSK-3 79
3.3. Ergebnisse 1: Orientierendes Docking für Synthesevorschläge
3.3.1. Mögliche Bindungsmodi
Es wurden standardmäßig alle Aminosäuren im Bereich von 6.5 Å um den Liganden zur Minimierung freigegeben. Dabei wurde unterschieden zwischen der ausschließlichen Freigabe der Seitenketten und der Freigabe aller Atome in dem genannten Bereich. Der erstgenannte Ansatz erwies sich in Vorversuchen als überlegen und wurde angewandt.
3.3. Ergebnisse 1: Orientierendes Docking für
Tabelle 3.4. | Ergebnisse der Klasse 1 im ersten Docking. Aufgeführt sind die Scores der auf Position # gesetzten Lösung. Dabei ist der Score des angegebenen Programmes eine Abschätzung der freien Bindungs-enthalpie, zur Vergleichbarkeit angegeben in kcal/mol. Während bei FlexE die Anzahl n der Lösungen (wie viele unterschiedliche Posen gefunden wurden) eine Aussage über den Verlauf des Dockings macht, kann die Anzahl bei AutoDock festgelegt werden und ist daher nicht aufgeführt.
Docking mit AutoDock Docking mit FlexE
#1 in Protein #50 in Protein n #1 #100
31 -6.88 pfgsk_1j1b -5.81 pfgsk_1q3d 481 -8.46 -3.64 40 -10.10 pfgsk_1q41 -6.95 pfgsk_2ow3 532 -10.06 -6.39 69 -10.10 pfgsk_1j1b -6.96 pfgsk_1q3d 410 -10.10 -6.75
berechnet werden. Dies ist möglicherweise auf die größere Anzahl schwerer Atome und daraus resultierend die größere Anzahl an Interaktionsmöglichkeiten zurückzuführen (zur Problematik der Vergleichbarkeit siehe Abschnitt 3.1.2 auf S. 81 bzw. 3.3.2 auf S. 107).
Die Interpretation des Bindungsmodus von Klasse 1, insbesondere der Klasse 1a, geschieht vor dem Hintergrund der Röntgenstruktur des Komplexes von 31 in der HsGSK-3β. Die Ver-hältnisse in der humanen Bindetasche sind in Abbildung 3.8 schematisch dargestellt, die Be-grifflichkeit zur Orientierung wird bei der Beschreibung der verschiedenen Bindungsmodi wie dort aufgeführt verwendet. Aufgrund der Ähnlichkeit von PfGSK-3 und HsGSK-3β einerseits und der nicht vorhandenen Selektivität von Verbindungen der Klasse 1a andererseits ist der analoge Bindungsmodus allein durch die Kristallstruktur wahrscheinlich, er wird als Modus A bezeichnet.
Ein wichtiger Kontakt besteht in der Wasserstoffbrücke über das Amin des Liganden an C6 zum Carbonyl des Ile160. Die Nitrilgruppierung an C2 (bzw. das Carbonyl in Verbindungen der Klasse 1b) kann einen Kontakt zum Lys108 tief in der Bindetasche ausbilden. Der Chlor-bzw. Iodphenylrest an Position 4 zeigt in diesem Modus aus der Tasche hinaus, während zum Inneren der Tasche hin noch genügend Raum für ein Wassermolekül ist. Dieses bildet den wichtigen überbrückten Kontakt zur Hinge Region aus.
Posen der Verbindung 31 Der Modus A wird sowohl von FlexE als auch von AutoDock für 31 berechnet. AutoDock berechnet ihn beim Docking in pfgsk_2ow3 und pfgsk_1q3d, wobei die entsprechenden Lösungen im ersten Fall sowohl die häufigsten als auch die am besten bewerteten sind. Im Falle von pfgsk_1q3d hingegen wird der Modus A nur beim flexiblen Docking auch an Platz 1 gesetzt (Platz 33 bei rigidem Rezeptor). Die von FlexE am besten bewertete Lösung entspricht dem in Abbildung 3.11 auf Seite 105 dargestellten und als Modus C weiter unten beschriebenen Modus.
Bei den Dockings mit AutoDock werden häufig zwei Bindungsmodi erzeugt (Modus Xa/b, vgl. Abb. 3.9), die an dieser Stelle wegen ihrer Häufigkeit dargestellt werden sollen, auch wenn sie letztlich nicht bei den Hypothesen zum Bindungsmodus mit aufgenommen wurden. AutoDock generiert viele Varianten von Posen, bei denen die Liganden mit dem Schwefel S1 und dem
Glu158/
Asp133
Ile160/
Val135
Met157/
Leu132 h y d r o p h o b e
T a s c h e ( h i n t e r d e m G a t e k e e p e r )
H i n g e R e g i o n ( l i n k s )
Lys166/
Arg141
l ö s u n g s m i t t e l z u g e -w a n d t e R e g i o n ( v o r n e l i n k s )
Z u c k e r b i n d e n d e R e g i o n
( v o r n e r e c h t s)
P h o s p h a t -b i n d e n d eR e g i o n( r e c h t s, DFG)
Gln210/
Gln185
Asn211/
Asn186 G l y c i n e - r i c h L o o p
( o b e n ) HN
O N
H O
HN R Gly91/
Gly68
Phe90/
Phe67
Asp225/
Asp200
Lys108/Lys85 ( r e c h t s, t i e f i n n e n )
NH O
HN O
R
HN O
R HN
O H
N R
O N
H H H2N N
+H2N
HN R
NH O
O HN O
NH2
NH O H2N
H H O
N S
NH2 H2N
Cl N
N
31
Gln162/Glu137
NH O HN
O -O
Abbildung 3.8. | Modus A:31 in der Bindetasche der HsGSK-3β (Aminosäuren: PfGSK-3/HsGSK-3β).
Die wichtige Interaktion des C2-Substituenten zum Lys108/85 tief in der Tasche sowie die überbrückte Was-serstoffbrückenbindung kennzeichnen Modus A. Das am Tascheneingang befindliche Arg141 des humanen Enzyms bildet in der Kristallstruktur eine Salzbrücke zum Glu137 aus – an dieser Position ist in derPfGSK-3 Gln162, so dass zwar eine Wasserstoffbrückenbindung möglich ist, jedoch keine Salzbrücke.
Stickstoff N7 des Thienopyridins an der Hinge Region entlang parallel positioniert sind. Es kommen beide denkbaren Orientierungen vor, mit S1 in die Tasche hinein und aus der Tasche hinaus.
Dabei werden allerdings für die Wasserstoffbrückenbindungen der 6-Aminosubstitution in der Regel unrealistische Winkel erreicht. Optimalerweise sollten die Atome =O· · ·HN– in einer Li-nie liegen. Tatsächlich weichen die Winkel mit 110-120° deutlich von den erwarteten 180° ab.
Zudem verhindert der Schwefel S1 die Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen zur Hinge Region. Er liegt vor dem Carbonyl des Ile160 und müsste demnach als Donor fungieren, damit eine Wasserstoffbrücke zustande kommen kann. Da dies nicht möglich ist, wird eine der typi-schen Wasserstoffbrückenbindungen von Kinaseinhibitoren verhindert. Dieser Bindungsmodus wird auch beim Docking der Verbindungen der Klasse 2 als Lösung angeboten, er wird aus den oben genannten Gründen allerdings auch bei der Klasse 2 nicht in Betracht gezogen.
Interessanterweise wurde dieser Modus auch vonChiouaet al.für Inhibitoren derHsGSK-3β aufgrund einer Dockingstudie mit AutoDock postuliert [229]. Allerdings handelt es sich bei den
Abbildung 3.9.|Modus Xa. Die an der Bindung C3a-C7a ge-spiegelte Geometrie wird ebenfalls berechnet (Modus Xb). Al-lerdings ist für die Thienopyridine keine Interaktion des Schwe-fels an Position X1 mit der Hinge Region möglich (für die in [229] beschriebenen 1H-Pyrazolo[3,4-b]pyridine mit Stickstoff an X1 – und X2 – ist dies der Fall), außerdem sind die Win-kel der Wasserstoffbrückenbindung zwischen Aminogruppe und Glu158 ungünstig.
dort untersuchten Verbindungen um Grundkörper vom Typ der 1H-Pyrazolo[3,4-b]pyridine, die genau die oben beschriebenen Wasserstoffbrückenbindungen zur Hinge Region ausbilden können, wie es für die hier untersuchten Thienopyridine wegen des Schwefels an S1nicht möglich ist (vgl. Abb. 3.9). In der zitierten Studie wurden zwei Verbindungen gedockt, weiterführende Angaben über die Untersuchungen sind der Veröffentlichung nicht zu entnehmen. Die Ergebnisse sind daher nicht auf den vorliegenden Datensatz übertragbar und können nicht als Argument für die Modi Xa/b gelten.
Posen der Verbindung 40 Die Dockings des Klasse 1b Inhibitors 40 mit FlexE ergeben insgesamt weniger plausible Lösungen. Es befindet sich zwar auf Rang 44 eine Entsprechung zu Modus A, die höchstgelistete Pose und viele weitere liegen jedoch relativ weit außerhalb der Bindetasche. In einer häufig vertretenen Pose befindet sich der an Position 4 des Grundkörpers sitzende Arylkern an der Stelle, an der der Purinkörper im ATP verschiedener Kristallstrukturen der HsGSK-3β positioniert ist. Dies erscheint insofern weniger vorteilhaft, als dass das starre planare Thienopyridin dann weiter außerhalb positioniert ist und nicht mehr in der Lage ist, zwischen Taschengrund und Glycine-rich Loop lipophile Interaktionen auszubilden.
Eine überaus interessante Pose ist jedoch auf Platz 63 zu finden: Hier wird über das Carbonyl, das in den Verbindungen 40 und 69 anstelle des Nitrils von 31 sitzt, eine Wasserstoffbrücke zum Ile160 in der Hinge Region ausgebildet. Der 4-(2-Iodphenyl)körper nimmt etwa die Po-sition der Ribose des ATP ein und in der tieferen Tasche kann ein Kontakt des Nitril an C5 zum Lys108 ausgebildet werden. Die Aminosubstitution an C6 zeigt zwischen dem Gatekee-per Met157 und dem Lys108 in die Richtung der Back Pocket. Die Anordnung der Stickstoffe von Lys108, Nitril an C5 und Aminosubstituent an C6 ist damit ungewöhnlich: Sie liegen al-le mit 3.6 bis 3.9 Å in ähnlicher Distanz voneinander entfernt in Form eines Dreiecks. Auch wenn die Nähe der 6-Aminosubstitution zum Lys108 überrascht, scheint die Passgenauigkeit der Aminogruppe zwischen Met157 und Lys108 so gut, dass die Geometrie auch bei Dockings mit AutoDock mehrfach für 40 berechnet wird, insbesondere bei den Proteinen pfgsk_1j1b und pfgsk_1q41. Hinter dem Aromaten ist in Richtung der Hinge Region genug Platz für ein
Wassermolekül, das ähnlich wie in Modus A eine indirekte Wasserstoffbrücke des Liganden zum Protein vermitteln könnte. Allerdings steht mit dem Schwefel des Thienopyridins an dieser Po-sition nur ein schwacher Wasserstoffbrückenakzeptor zur Verfügung. Der Bindungsmodus, der im Folgenden als Modus Bbezeichnet wird, ist in Abbildung 3.10 dargestellt und erläutert.
Abbildung 3.10. | Modus B am Beispiel von 40.
Die entscheidende Interaktion besteht zum Ile160 in der Hinge Region. Die Geometrie des Kontaktes zu Lys108 ist nicht optimal und auch die Entfernung ist zu groß für eine klassische Wasserstoffbrücken-bindung, allerdings ist es vorstellbar, dass die flexible Seitenkette des Lys108 sich in eine vorteilhaftere Po-sition bewegen kann. Die Aminosubstitution an C6 liegt genau zwischen Met157 und Lys108 und zeigt in Richtung der Back Pocket.
Posen der Verbindung 69 Die Verbindung 69 ist bis auf die Substitution am Benzoylrest mit 40 identisch. Erwartungsgemäß finden sich starke Übereinstimmungen zu den Dockinger-gebnissen von 40: Der Modus A wird, wenn auch erst auf Rang 92, im FlexE-Docking ebenso vorgefunden wie der zuletzt diskutierte Modus B. Zusätzlich wurde ein weiterer Modus vorge-funden, bei dem der Ligand besonders tief in der Tasche sitzt. Er wird im Folgenden alsModus Cbezeichnet und in schematisch in Abbildung 3.11 dargestellt. In dieser Positionierung liegt der Stickstoff des 5-Cyanosubstituenten dort, wo in der Kristallstruktur von31 mit derHsGSK-3β Wasser kokristallisiert ist (vgl. Abb. 3.8 auf S. 102). Ein Verdrängen dieses Wassers würde durch die Stärkung des entropischen Anteils der Bindungsenthalpie zu höherer Affinität beitragen. Die Pose wird sowohl für 40 (FlexE) als auch für 69 (AutoDock in pfgsk_1q41) berechnet.
Nahe verwandt mit dem Modus C ist die gespiegelte FassungModus D, bei der das Molekül weiter außerhalb der Tasche liegt, aber nach wie vor den Kontakt zur Hinge Region ausbildet, der möglicherweise das Wasser verdrängen könnte. Auch wenn diese Lösungen relativ weit außerhalb der Tasche liegen, wurde der Modus D dennoch als Hypothese mit aufgenommen, da er sich in guter Übereinstimmung bei Dockings mit FlexE und AutoDock wiederfindet.
Verbindungen der Klasse 2
Erwartungsgemäß unterscheiden sich die Dockingergebnisse der Verbindungen der Klasse 2 wegen der unterschiedlichen Substitution am Grundkörper deutlich. Das zeigt sich bereits in der tabellarischen Übersicht der Ergebnisse (siehe Tab. 3.5). Insgesamt werden im Vergleich zum Docking der Verbindungen der Klasse 1 weniger Lösungen von FlexE mit schlechteren Scores gefunden. In AutoDock liegen die Werte für die berechneten Bindungsenergien der Vertreter der
Abbildung 3.11. | Modus C und D am Beispiel von 69. Die entscheidende Interaktion findet direkt zum Stickstoff des Ile160 in der Hinge Region statt. Es könnte das in der Kristallstruktur vorhandene Wasser (hellblauer Kreis) verdrängt werden, das sich etwa im Bereich der Cyanogruppe befindet. Es werden von 69 im abgebildeten Modus C teilweise Interaktionen der Carbonylgruppe an C2 mit Backbone-Stickstoffen im Glycine-rich Loops ausgebildet. Wird das Molekül an der gestrichelten Achse gespiegelt, ergibt sich Modus D (nicht abgebildet), der sich ebenfalls den gleichen Kontakt der Cyanogruppe auszeichnet, während die 5-Aminogruppe nun mit dem Carbonyl des Ile160 eine Wasserstoffbrückenbindung ausbilden kann. Die Verbindung kann mit ihrem Carbonyl-Sauerstoff eine Bindung zum Glycine-rich Loop (Modus C) bzw. zur zuckerbindenden Region (Modus D) ausbilden.
Klasse 2 hingegen in einem ähnlichen Bereich wie für Klasse 1. Hinsichtlich der beobachteten Bindungsmodi sind die im Folgenden beschriebenen Unterschiede zum Docking der Klasse 1 festzustellen.
Es findet sich bei allen vier Verbindungen zwar ein Bindungsmodus, der durch die Was-serstoffbrückenbindung des Carbonyls zum Lys108 gewisse Ähnlichkeit zu Modus A hat, das Thienopyridingerüst ist jedoch tiefer in die Tasche hinein verschoben, so dass der lipophile Ring diese praktisch ausfüllt. Die Geometrie wird alsModus E bezeichnet und ist in Abbildung 3.12 am Beispiel von 125 dargestellt.
Posen der Verbindung 125 Neben Modus E werden beim Docking von 125 mit FlexE ins-besondere Lösungen produziert, die relativ weit außerhalb der Tasche liegen. Wie in Tabelle
Tabelle 3.5. | Übersicht der Ergebnisse für Klasse 2 in Analogie zu Tabelle 3.4 (Scores [kcal/mol]).
Docking mit AutoDock Docking mit FlexE
#1 in Protein #50 in Protein n #1 #100
125 -9,48 pfgsk_1q41 -7,08 pfgsk_2ow3 284 -5,42 -4,12 132 -9,09 pfgsk_1j1b -6,68 pfgsk_2ow3 384 -6,46 -4,67 140 -9,22 pfgsk_1j1b -6,94 pfgsk_1q3d 195 -5,31 -3,82 141 -9,21 pfgsk_1j1b -7,00 pfgsk_1q3d 495 -7,45 -5,34
Abbildung 3.12. | Modus E der Klasse 2 am Bei-spiel von125. In dieser Variante des Modus A ist der lipophile Ring auf die Hinge Region ausgerichtet, der entscheidende Kontakt wird zum Lys108 ausgebil-det. Im Unterschied zum Modus A sind die Verbin-dungen so weit in die Tasche hinein verschoben, dass keine über Wasser vermittelte Wasserstoffbrücken-bindung mehr möglich ist.
3.5 dargestellt, fallen die FlexE Scores als Folge der dadurch weniger vorhandenen Kontakte insgesamt für die Klasse 2 im Vergleich zu den Werten der Klasse 1 und im Vergleich zu den durch AutoDock berechneten schlechter aus.
Posen der Verbindungen 132,140 und 141 Die Verbindungen 132, 140 und 141 haben gegenüber den bislang betrachteten Verbindungen eine grundsätzliche strukturelle Abwand-lung: Sie besitzen statt des Arylcarbonylkörpers an C2 ein Amid. Die Veränderung von Nitril (z. B. 31) zu Arylcarbonyl (z. B. 40) erbrachte im vorliegenden Datensatz die Selektivität der Verbindungen für die PfGSK-3, die Veränderung zum Amid hingegen scheint keine einheitliche Konsequenz zu haben – während 132 und 141 nicht selektiv sind, ist dies bei 140 der Fall (vgl. Tab. 3.1 auf S. 88). Der Unterschied scheint demnach bei diesen Verbindungen über die
Abbildung 3.13. |Modus F und G der Verbindungen 132,140 und 141. Im abgebildeten Modus F wird befindet ist der 4-Arylrest in Richtung der lösungsmittelzugewandten Region ausgerichtet, während der lipophile Ring im Bereich der zuckerbindenden Region liegt. Die an der hellblauen Linie gespiegelte Version wird als Modus G bezeichnet, hier können ebenfalls die drei eingezeichneten Wasserstoffbrückenbindungen ausgebildet werden, der anellierte lipophile Ring zeigt tief in die Tasche hinein in Richtung des Lys108. In beiden Fällen würde wieder das in der HsGSK-3β beobachtete Wasser verdrängt werden.
Arylsubstitution am C4 zustande zu kommen. Die Dockings sollten helfen, diese Unterschiede zu erklären.
Vorherrschend waren für die drei genannten Verbindungen zwei Posen, die mit der Hinge Regi-on die klassischen drei Wasserstoffbrückenbindungen nach dem Muster DRegi-onor-Akzeptor-DRegi-onor ausbilden, wie sie typischerweise in Kristallstrukturen von Proteinkinasen mit ATP vorliegen.
Dabei wurden beide möglichen Orientierungen des Grundkörpers beobachtet, in Abbildung 3.13 ist schematisch die als Modus F bezeichnete Version mit aus der Tasche hinauszeigen-dem 4-Arylrest gezeigt – Modus G ist die gespiegelte Form, bei der der 4-Arylrest in die Tasche hineinzeigt. Daneben wurden wieder häufig die bereits bei Klasse 1 als Modus Xa/b diskutierten und verworfenen Hypothesen beobachtet. Insgesamt konnte aus den Ergebnissen dieses Dockings keine Erklärung für die drastischen Unterschiede hinsichtlich der Selektivität bei Veränderung des 4-Arylrestes (140 ⇒ 141) abgeleitet werden.