Regeneration des läsionierten Rückenmarks gemessen an der

Katecholaminerge Neurone findet man in Regionen des Nervensystems, die unter anderem an der Regulation der Bewegungen beteiligt sind. Alle katecholaminergen Neurone besitzen das Enzym Tyrosinhydroxylase (TH), das den ersten Schritt in der Katecholaminsynthese katalysiert und als spezifischer Marker dieses Neuronen-Typs verwendet wird. Um abschätzen zu können, ob die schlechtere Regeneration der CHST-14^-/- Mäuse auf eine verminderte monoaminerge Re-Innervierung caudal der Läsionsstelle zurückzuführen ist, wurden die katecholaminergen Axone im lumbalen Rückenmark gezählt, die durch eine 250 µm caudal zur Läsionsstelle willkürlich festgelegte Grenze projizierten.

Parasagittale Schnitte des Rückenmarks von CHST-14^-/- und Wildtyp-Mäusen wurden mit anti-Tyrosinhydroxylase-Antikörper gefärbt und unter dem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet.

IV. Ergebnisse

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Abb. 4.21: Monoaminerge Re-Innervierung in rückenmarksläsionierten CHST-14^-/- und CHST-14^+/+ Mäusen.

Die Werte für CHST-14^-/- (-/-) sind als schwarze, die Werte für CHST-14^+/+ (+/+) als weiße Balken in Form von Gruppenmittelwerten ± SEM dargestellt. n gibt die Anzahl der analysierten Tiere pro Genotyp an. (Wilcoxon-Mann-Whitney Test).

Sechs Wochen nach der Läsion konnten 250 µm caudal der Läsionsstelle für den Wildtyp durchschnittlich 7,5 und für CHST-14^-/- Tiere durchschnittlich 3,9 Tyrosinhydroxylase-positve Axone gemessen werden. Dies ließ zwar eine Tendenz erkennen, der Unterschied war jedoch nicht signifikant (vgl. Abb. 4.21).

2.2.4 Veränderung der Regenerationsfähigkeit rückenmarksläsionierter CHST-14 Mäuse nach Chondroitinase-Behandlung

Es ist bekannt, dass durch den Einsatz von Chondroitinase ABC nach Läsionen des ZNS, die funktionelle Regeneration verbessert wird (Moon et. al., 2001; Bradbury et. al., 2002;

Caggiano et al., 2005; Houle et al., 2006; Cafferty et. al., 2007). Daher sollte überprüft werden, wie sich die funktionelle Regeneration der CHST-14^-/- und wildtypischen Mäuse nach Chondroitinase-Behandlung verändert.

Es wurden fünf CHST-14^-/- und fünf wildtypische Tiere läsioniert und unmittelbar nach der Läsion ca. 2 mm distal der Läsionsstelle 1 µl Chondroitinase ABC (10 U/ml) injiziert. Alle Tiere wachten aus der Narkose auf, über Nacht starb jedoch eine CHST-14^-/- Maus und zwei Tage nach der Operation starb eine weitere CHST-14^-/- Maus. Drei Tage nach der ersten OP bekamen die Tiere erneut ca. 2 mm distal der Läsionsstelle Chondroitinase ABC injiziert.

Während alle Wildtypen diese zweite Injektion überlebten, starb in der ersten Nacht nach der zweiten Behandlung eine weitere CHST-14^-/- Maus, die beiden anderen CHST-14^-/- Tiere starben innerhalb der zwei folgenden Tage.

Da die CHST-14^-/- Tiere nach Chondroitinase-Behandlung eine 100%ige Sterberate aufwiesen, war eine funktionelle Analyse nicht möglich.

IV. Ergebnisse

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2.3 Differentielle Expression der HNK-1-Sulfotransferase-Familienmitglieder an der Läsionsstelle

Um zu überprüfen, ob der Verlust der CHST-14 durch ein anderes Mitglied der HNK-1-Sulfotransferase-Familie kompensiert wird, wurde die relative mRNA-Expression der einzelnen Mitglieder der HNK-1-Sulfotransferase-Familie im Rückenmark eine und sechs Wochen nach der Läsion mittels qRT-PCR untersucht. Zur genaueren Analyse der Verletzung wurden drei Bereiche des Rückenmarks unterschieden, nämlich die Läsionsstelle (L) selbst, sowie je 5 mm Gewebe rostral (R) und caudal (C) der Läsionsstelle. Pro Genotyp, Zeitpunkt und Rückenmarksregion wurden je vier läsionierte Tiere und als Kontrollgruppe pro Genotyp drei unläsionierte Tiere analysiert.

Die aus jeweils 1 μg extrahierter Gesamt-RNA resultierenden cDNAs wurden mittels qPCR vermessen. Um die erhaltenen Ct-Werte direkt miteinander vergleichen zu können, wurden die Messungen aller Gene anhand von Aliquots derselben cDNAs vorgenommen. Die Ct-Werte wurden anhand der Messwerte der Referenzgene Aktin, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) und Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HPRT) in unläsionierten Wildtypen normalisiert. Die normalisierten Ct-Werte wurden anschließend relativ zum entsprechenden unläsionierten Genotyp berechnet. Die erhaltenen Daten der qRT-PCR wurden three-way ANOVA Analysen für wiederholte Messungen unterzogen, wobei Genotyp und Zeitpunkt nach der Läsion als Faktoren zwischen den Gruppen und die drei untersuchten Bereiche des Rückenmarks (R, L, C) als Faktoren innerhalb einer Gruppe betrachtet wurden.

2.3.1 Differentielle Expression der Haushaltsgene nach Rückenmarksläsion

Für die Haushaltsgene Aktin, GAPDH und HPRT war eine und sechs Wochen nach der Läsion sowohl in CHST-14^-/- Tieren, als auch im Wildtyp, im Vergleich zu unläsioniertem Rückenmark, eine Dysregulation festzustellen.

Die Aktin-Expression war im Wildtyp eine Woche nach der Läsion an der Läsionsstelle 2,6-fach, in ChST-14^-/- Tieren 2,5-fach erhöht. Sechs Wochen nach der Läsion war Aktin an der Läsionsstelle sowohl im Wildtyp als auch in CHST-14^-/- Tieren nur noch 1,5-fach hochreguliert. Rostral der Läsionsstelle war die Aktin-Expression sowohl eine als auch sechs Wochen nach der Läsion, in beiden Genotypen, um den Faktor 1,3 schwach hochreguliert.

Caudal war die Expression eine Woche nach der Läsion im Wildtyp 1,3-fach, in CHST-14 -/-Tieren 1,6-fach erhöht. Sechs Wochen nach der Läsion war, im Vergleich zu den entsprechenden unläsionierten Genotypen, keine Dysregulation messbar (vgl. Abb. 4.22 A).

IV. Ergebnisse

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Für GAPDH konnte nur für den Zeitpunkt eine Woche nach der Läsion an der Läsionsstelle eine schwache negative Dysregulation um den Faktor 0,8 festgestellt werden, ein genotypischer Unterschied war nicht zu erkennen. Rostral und caudal der Läsionsstelle sowie sechs Wochen nach der Läsion, war keine Dysregulation erkennbar (vgl. Abb. 4.22 B).

Abb. 4.22: Relative Expression der Haushaltsgene Aktin (A), Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) (B) und Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HPRT) (C) in CHST-14^-/- und CHST-14^+/+ Tieren eine und sechs Wochen nach Rückenmarksläsion. Es wurden drei Regionen analysiert:

Läsionsstelle (L), rostral (R) und caudal (C) der Läsionsstelle. Die Ct-Werte wurden auf die Expression von Aktin, GAPDH und HPRT normalisiert, daraus die Mittelwerte gebildet und nach der standard curve Methode analysiert und relativ zu den entsprechenden unläsionierten Genotypen betrachtet. Die Gruppenmittelwerte ± SEM für CHST-14^-/- Tiere sind als schwarze, die für den Wildtyp als weiße Rauten dargestellt.

Die Expression von HPRT war im Vergleich zum unläsioniertem Rückenmark nach der Läsion in allen drei Regionen und zu beiden Zeitpunkten unterschiedlich stark runterreguliert.

Rostral der Läsionsstelle wurde in CHST-14^-/- Tieren und ihren wildtypischen Geschwistern eine Woche nach der Läsion eine negative Dysregulation um den Faktor 0,3 und direkt an der Läsionsstelle um den Faktor 0,5 festgestellt. Caudal der Läsionstelle war die HPRT-Expression im Wildtyp 0,2-fach und in CHST-14^-/- Tieren 0,3-fach herunterreguliert (vgl. Abb.

4.22 C). Sechs Wochen nach der Läsion war die Expression rostral der Läsionsstelle in

(A) (B)

(C)

IV. Ergebnisse

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beiden Genotypen um den Faktor 0,2 dysreguliert, direkt an der Läsionsstelle um den Faktor 0,3. Caudal der Läsion war die HPRT-Expression in CHST-14^-/- Tieren nicht dysreguliert, in den wildtypischen Geschwistern wurde eine geringe Runterregulation um den Faktor 0,2 gemessen.

Weder eine noch sechs Wochen nach der Läsion konnte für eines der drei analysierten Haushaltsgene in den drei untersuchten Regionen des Rückenmarks genotypische Expressionsunterschiede festgestellt werden. Jedoch zeigten alle Haushaltsgene nach Rückenmarksläsionen positionsabhängige Expressionsunterschiede.