Berechnung der Struktur am Beispiel des Hexasaccharids .1 Strukturberechnung basierend auf CH-/CH-Restraints

Um eine genauere Vorstellung von der 3-dimensionalen Struktur der höheren Oligo-mere zu erhalten, wurden die, aus der Integration der ROESY Kreuzsignale, erhaltenen Protonenabstände für das Hexasaccharid in D2O bei 300 K als Restraints in HyperChem© gesetzt.

Tab. 7. Für die MD Simulation des Hexasaccharids gesetzte Abstände.

Die beiden letztgenannten Restraints wurden als intraglykosidische Restraints ge-setzt, um die Stabilität der Sesselstruktur des c-Rings zu gewährleisten. Dieser hatte bei einer der ersten Energieminimierungen gezeigt, dass – aufgrund der an ihm an-greifenden Restraints – die Sesselstruktur nicht beibehalten wird, sondern ein Um-klappen in die Wannenkonformation erfolgt. Dieser Umstand ist entweder darauf zu-rückzuführen, dass zuviele Restraints an denselben Protonen des c-Ringes angrei-fen oder dass sich die erhaltenen ROEs aus der Mittelung mehrerer Strukturen erge-ben und somit nicht innerhalb einer Struktur gefittet werden können.

Soweit die ³JHH Kopplungen aus dem Lorentz-Gauss-transformierten ¹H Spektrum ablesbar sind, ergeben sich keine Hinweise auf eine veränderte Ringkonformation für Ring c.

Nach einer Energieminimierung der Struktur (inkl. Restraints) wurde eine Moleküldy-namik Simulation mit 10 x 10 ps gerechnet. Nach jeweils 10 ps MD Simulation bei 300 K wurde ein Snapshot gespeichert. Diese insgesamt 10 Snapshots wurden an-schliessend überlagert und die daraus erhaltene, gemittelte Struktur nochmals ener-gieminimiert.

Aus jener ergaben sich folgende Protonenabstände:

ROE Gesetzter Abstand

Tab. 8. Gesetzte und berechnete ROE Abstände für Hexa. * Struktur aus 10x10 ps MD Simulation mit anschliessender Energieminimierung

Bestimmung der Φ- und Ψ-Winkel der O-glykosidischen Bindungen des Hexasac-charids:

Tab. 9. Aus der gemittelten Struktur des Hexasaccharids ermittelte Φ- und Ψ-Winkel. Diese sind über die Schweratome definiert (siehe 2.1).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass nicht nur mehrere charakteristische ROEs in der erhaltenen Struktur schlecht gefittet sind (fett gedruckt in Tab.8), sondern dass auch die Varianz im Ψ-Winkel innerhalb des Oligomers beträchtlich ist. Da der Fehler in der Integration der ROE Signale relativ gering ist und es sich bei den abweichenden ROEs nicht um schlecht zu integrierende Signale handelt, müssen andere Gründe für die Abweichungen vorliegen. Auffallend ist, dass die schlecht

gefitteten ROEs alle c- und b-Ring betreffen; zuvor hatte sich ja schon gezeigt, dass die Sesselkonformation des c-Rings nicht stabil ist. Da alle restlichen gesetzten Restraints sehr gut zu der gerechneten Struktur passen, könnte eine grössere Flexibilität des einen Endes des Oligomers – nämlich der Bereich mit der Fructoseeinheit – ein Grund für die Abweichungen sein. Eine erhöhte Flexibilität führt zu gemittelten ROEs aus zwei oder mehreren Konformationen, welche dann nicht zu einer definierten, gerechneten Struktur passen können.

Dennoch sei nachfolgend die für das Hexasaccharid berechnete Struktur gezeigt:

Abb. 27. Struktur des Hexasaccharids – gemittelte Struktur aus MD Simulation (10 x 10 ps bei 300 K).

Î Helikale Struktur mit einer Ganghöhe von 4 Glucoseeinheiten

Um die helikale Struktur besser erkennen zu können, ist in der nächsten Abbildung die Fructofuranoseeinheit entfernt.

Abb. 28. Struktur des Hexasaccharids ohne Fructoseeinheit. Deutlich zu erkennen sind die Ganghöhe von 4 Glc-Einheiten und die enge helikale Windung in der Draufsicht (rechts) sowie in der Seitenan-sicht (links).

2.4.2 Berechnung der Struktur unter Berücksichtigung zusätzlicher OH-/CH-Restraints

Da, wie in 2.3.2 beschrieben, das ROE Muster und die Grösse der Abstände für HZ34 in D2O und DMSOd6 identisch sind, können die aus den Messungen von HZ34 in DMSOd6 erhaltenen OH-/CH-ROEs als Restraints mit in die Berechnung der Struktur des Hexasaccharids zusätzlich zu den CH-/CH-Restraints eingebracht wer-den.

Es wurde wiederum eine MD Simulation mit 10 x 10 ps bei 300 K gerechnet und die sich hieraus ergebende, gemittelte Struktur energieminimiert.

ROE Gesetzter Abstand

H3c – 1aOH 3.0 2.9

H1b – H4a 3.1 2.95

Tab. 10. Zur Berechnung der Struktur des Hexasaccharids gesetzte und aus der gemittelten Struktur erhaltene Protonenabstände. Abstände mit Abweichungen von mehr als 0.4 Å sind fett gedruckt.

* Struktur aus 10x10 ps MD Simulation mit anschliessender Energieminimierung

Hier zeigt sich, dass dieselben ROEs wie in 2.4.1 schlecht gefittet werden, wobei der c-Ring allerdings bei dieser MD Simulation in seiner Sesselkonformation stabil war, sodass keine zusätzlichen intraglykosidischen Restraints gesetzt werden mussten.

Die OH-/CH- Restraints sind alle zufriedenstellend gut erreicht in der gerechneten Struktur, wobei es sich bei diesen vorrangig um ROEs zu Hydroxygruppen des a-Ringes, also der Furanose, handelt. Der letzte, in der Tabelle aufgeführte CH-/CH-ROE (1b – 4a) stammt ebenfalls aus der Messung des Tetrasaccharids HZ34 in DMSOd6 und ist bei der Messung des Hexa in D2O nur sehr schwach zu erkennen.

Einen Vergleich der beiden gerechneten Strukturen des Hexasaccharids zeigt die nachfolgende Abbildung.

Abb.29. Vergleich der beiden gerechneten Strukturen für das Hexasaccharid. In grün Struktur ohne Berücksichtigung der OH-/CH-Restraints, in schwarz/rot mit Berücksichtigung der OH-/CH-Restraints.

Die rechte Abbildung zeigt lediglich den b-Ring mit der Fructofuranoseeinheit, deren Ausrichtung relativ zum b-Ring von den gesetzten OH-/CH-Restraints abhängt.

Ein Vergleich der Φ/Ψ-Winkel für die Fructoseeinheit der Strukturen mit und ohne Berücksichtigung von OH-Restraints und literaturbekannter Daten aus Kristallstruktur und Lösung (für Saccharose) ergibt folgendes Bild:

Winkel Saccharose Kristallstruktur¹⁶

Saccharose in Lösung¹⁷

MD Simulation Hexa ohne

OH-Restraints

MD Simulation Hexa mit

OH-Restraints

Φ +107.9° +99.7° +106° +92°

Ψ -44.8° -159.3° -48° -31°

Definition der Winkel:

Φ: O5b – C1b – O1b – C2a Ψ: C1b – O1b – C2a – O5a

Tab. 11. Vergleich der Φ/Ψ-Winkel von Saccharose mit der berechneten Struktur der „Kopfgruppe“

des Hexasaccharids (Fructose a und erste Glucoseeinheit b).

Werden keine zusätzlichen Restraints, die über die OH-Gruppen die Orientierung der Fructoseeinheit beeinflussen, gesetzt, so ist die Ausrichtung der Fructose ähnlich jener im Saccharosekristall. Mit OH-Restraints erhält man eine Fructose, die mehr zur Mitte der Helix hereingedreht ist, aber immer noch Φ-/Ψ-Winkel vergleichbar mit jenen der Saccharosekristallstruktur aufweist.

Abb. 30. Orientierung der Fructoseeinheit in Saccharose bzw. im Hexasaccharid.

2.4.3 Vergleich der Struktur mit einer gerechneten Modellhelix

Die Struktur als auch die gesetzten und berechneten ROEs des Hexasaccharids (ohne OH-/CH-Restraints) werden mit zwei verschiedenen, gerechneten Modellhe-lices verglichen. Diese sind, analog zu den hier untersuchten Oligosacchariden, aus Glc-Einheiten, mit α-(1Æ2)-glykosidischen Bindungen, aufgebaut. Als einzige Re-straints werden die Φ- und Ψ-Winkel dieser Modellhelices bei ihrer Strukturbe-rechnung gesetzt:

Rechtsgängige Modellhelix: Φ = +60° Ψ = +120°

Linksgängige Modellhelix: Φ = +60° Ψ = +60°

(Definition der Φ- und Ψ-Winkel über die Schweratome)

Æ daraus ergeben sich eine rechts- und eine linksgängige Helix mit Ganghöhe 4 Wichtig: die in der nachfolgenden Tabelle verwendete Nomenklatur ist nicht iden-tisch mit der ansonsten verwendeten Nomenklatur für die Oligosaccharide. Nachfol-gend bezeichnet der a-Ring die erste Glucoseeinheit in der Kette.

ROE Modellhelix

Tab. 12. Vergleich der Daten für das Hexasaccharid mit zwei verschiedenen Modellhelices. Die Ab-stände für das Hexasaccharid stammen aus der Integration der ROESY Daten bzw. aus der gerech-neten Struktur. Für den letzteren Fall ist dies angegeben (aus MD). Die long-range ROEs (fett

Bemerkung: Die Abstände H1a – H1b und H1c – H3b liessen sich im Rahmen der Strukturberechnung nur schlecht fitten, wie dies bereits ohne Einbeziehung von OH-Restraints in die Rechnung der Fall gewesen war.

Übersicht über die, für die Orientierung der O-glykosidischen Bindung, wichtigen ROEs:

Tab. 13. Zusammenfassung der wichtigsten ROE Abstände. In Klammern stärker abweichende Ab-stände, die von endständigen Glucoseeinheiten stammen.

Modellhelix

Tab. 14. Vergleich der Φ- und Ψ-Winkel (Def. über Schweratome) der Modellhelices mit dem gerech-neten Hexasaccharid. In Klammern die Winkel bei Definition über die Protonen (Φ = H1 – C1 – O1 – C2‘, Ψ = C1 – O1 – C2‘ – H2‘).

Über GlycoMaps¹⁸ (Datenbank mit Φ/Ψ Plots für Saccharide, DKFZ Heidelberg) er-hält man für α-(1Æ2)-O-glykosidisch verknüpfte Glucoseeinheiten auf Basis einer MD Simulation eine Auftragung der Energie des entsprechenden Disaccharids in Ab-hängigkeit vom Φ- und Ψ-Winkel der O-glykosidischen Bindung. Es zeigt sich, dass es zwei Minima gibt, die durch eine Barriere von etwa 2 Kcal/mol voneinander ge-trennt sind. Trägt man nun die Φ-/Ψ-Werte für beide Modellhelices und die des be-rechneten Hexasaccharids ein, so erkennt man, dass letzteres gemeinsam mit der rechtsgängigen Modellhelix mehr zu dem einen Minimum tendiert, wohingegen die linksgängige Modellhelix eindeutig im Bereich des zweiten Minimums liegt.

Abb. 31. Auftragung der Energie des Disaccharids α-D-Glcp-(1Æ2)-α-D-Glcp aus der Datenbank GlycoMaps©¹⁸ mit Bereichen der hier erhaltenen Φ-/Ψ-Winkelkombinationen (Winkel über Protonen definiert).

Î Die Struktur für das Hexasaccharid stimmt in guter Näherung mit der Modellhelix einer rechtsgängigen Helix mit Ganghöhe 4 überein. Alle signifi-kanten ROEs und auch die Werte für den Φ-Winkel stimmen sehr gut überein, einzig die Werte des Ψ-Winkels weichen erheblich vom Modell ab. Dies liegt daran, dass durch die Fructoseeinheit der Anfangsbereich der Helix vom Modell abweicht. Dennoch ist ein deutlicher Unterschied zur linksgängigen Modellhelix zu erkennen.

Abb. 32. Rechtsgängige Modellhelix (links) und Hexasaccharid (rechts). Die stärksten Abweichungen von der Modellhelix zeigen sich für das fructosylierte Ende.

3. Einfluss der Fructofuranose auf die Sekundärstruktur der