3. Ergebnisse und Diskussion
3.1. Auswahl eines experimentellen Systems zur Seneszenzinduktion mit Hilfe
3.1.2. Behandlungsbedingte Veränderungen der Ultrastruktur der Chloroplasten
Neben dem Chlorophyllverlust zeigen die Plastiden spezielle, seneszenzbedingte Veränderungen in ihrer Ultrastruktur. Vor allem das Auftreten und die Veränderungen in der Größe so genannter Plastoglobuli, die sich im Elektronen-mikroskop als osmiophile globuläre Strukturen innerhalb der Plastiden darstellen, ist ein augenfälliges seneszenzabhängiges Merkmal (LICHTENTHALER und SPREY, 1966; LICHTENTHALER und PEVELING 1967; LICHTENTHALER, 1969; THOMAS und STODDART, 1980; PARTHIER, 1988; GOSH et al. 2001). Gleichzeitig kommt
es zu einem Abbau der Thylakoide (NOODEN, 1988; KOŁODZIEJEK et al., 2003;
KESKITALO et al., 2005). Daher sollten die verbleibenden Behandlungsmethoden auf ihr Vermögen, solche seneszenzbedingten Veränderungen der Ultrastruktur der Plastiden zu erzeugen, hin überprüft werden. Verwendet wurden dazu Ultradünnschnitte von in Epoxydharz (gemäß SPURR, siehe Material und Methoden) eingebetteten Gerstenprimärblättern.
Abb. 4A zeigt die Ultrastruktur eines Chloroplasten aus einem insgesamt 16 Tage alten Gerstenprimärblatt ohne jegliche Behandlung (Kontrolle). Gut zu erkennen ist das interne Membransystem der Thylakoide, die in gestapelter (Granathylakoide) und ungestapelter Form (Stromathylakoide) vorliegen. Darüber hinaus zu erkennen sind Plastoglobuli als gut sichtbare, kontrastreiche osmiophile globuläre Strukturen.
Abb. 4a zeigt einen stark vergrößerten Bereich mit geordneten Grana- und Stromathylakoiden und einigen Plastoglobuli.
In Abb. 4B ist die Ultrastruktur eines Chloroplasten aus einem insgesamt 16 Tage alten Gerstenprimärblatt (nach 7-tägigem Methyljasmonateinfluss) zu sehen. Das Thylakoidsystem des Chloroplasten ist zwar noch deutlich in Grana- und Stromathylakoide gegliedert, aber es zeigen sich bereits Bereiche der Desintegration der Thylakoidstrukturen. Sehr auffällig sind v. a. kontrastreiche osmiophile globuläre Strukturen (Plastoglobuli), die im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 4A) wesentlich größer sind. Noch deutlicher ist dies in stärkerer Vergrößerung (Abb. 4b) zu erkennen.
Offensichtlich ist eine Inkubation von Gerstenprimärblättern mit Methyljasmonat in der Lage, den wichtigsten ultrastrukturellen Marker für Seneszenz, nämlich eine Vergrößerung der Plastoglobuli (BACHMANN et al., 2002) in den Chloroplasten im Vergleich zu gleich alten unbehandelten Blättern zu verursachen. Solche Veränderungen sind eigentlich typisch für Chloroplasten aus wesentlich älteren, bereits seneszenten Blättern (THOMAS und STODDART, 1980; PARTHIER, 1988;
GOSH et al. 2001).
Nach Dunkelinkubation (Abb. 4C) ist in den Chloroplasten eine beginnende Desintegration des Thylakoidsystems zu erkennen, wobei hauptsächlich die Granathylakoide betroffen sind (Abb. 4c). Auch ŠPUNDOVÁ et al. (2003) beobachtete eine solche Desintegration des Thylakoidsystems bei Chloroplasten aus Gerstenblättern (Hordeum vulgare L. cv. Akcent) ab dem vierten Tag der Dunkelinkubation. Daneben wird von einem gleichzeitigen Auftreten von unterschiedlich elektronentransparenten Plastoglobuli, so genannten „translucent
plastoglobuli“, berichtet und daraus gefolgert, dass eine Veränderung der Lipidzusammensetzung während der Seneszenz der Verursacher dieses Phänomens ist. Es könnte sich allerdings auch um eine ungenügende Kontrastierung der Proben mit OsOBB4BB handeln, zumal das Blattgewebe nur 2 Stunden lang mit 2 % iger OsOBB4BB-Lösung inkubiert wurde (zum Vergleich: die hier verwendeten Proben wurden mit 2 % iger OsOBB4BB-Lösung mindestens 12 Stunden lang inkubiert).
Die wenigen sichtbaren Plastoglobuli in den hier analysierten Proben unterscheiden sich weder hinsichtlich ihrer Größe noch hinsichtlich ihrer Elektronendurchlässigkeit von denen aus der Kontrolle (Abb. 4A).
UV-Bestrahlung (Abb. 4D) bewirkt offensichtlich eine umfassende Schädigung des ganzen Chloroplasten und dessen interner Membranstrukturen. Zu erkennen sind auch zahlreiche große Stärkekörner, die in dieser Form bei den anderen Behandlungen nicht auftreten. Plastoglobuli oder ähnliche Strukturen scheinen ganz zu fehlen. Bei stärkerer Vergrößerung (Abb. 4d) ergibt sich der gleiche Befund.
Was schon bei der Untersuchung der Chlorophyll-Daten (Chlorophyll a/b Verhältnis und Gesamtchlorophyllgehalt) zu vermuten war, nämlich das Auftreten von dramatischen ultrastrukturellen Veränderungen des Chloroplasten in Folge hoher UV-Strahlungsintensitäten, wird durch die in Abb. 4D zweifelsfrei erkennbaren nachhaltigen Schädigungen sowohl der internen Membranstrukturen, als auch der Chloroplastenmembranen bestätigt. Dafür verantwortlich ist sicherlich auch die hohe Dosis an Gesamt-UV-Strahlung. Die auffällige Anhäufung und starke Vergrößerung der Stärkekörner im Chloroplasten ist dagegen in erster Linie dem UV-A-Anteil des Spektrums zuzuschreiben (KIVIMÄENPÄÄ et al., 2001; VALKAMA et al., 2003;
SANTOS et al., 2004).
Abb. 4: Behandlungsbedingte Veränderungen der Ultrastruktur der Chloroplasten:
A: Chloroplast aus einem 16 Tage alten Gerstenprimärblatt (Kontrolle), mit gut entwickelten internen Membranstrukturen und einigen kleinen Plastoglobuli (PG).
a: Stark Vergrößerter Ausschnitt eines Chloroplasten mit gut entwickelten Grana– und Stroma-thylakoiden (GT bzw. ST) und kleinen PG
B: Ein Chloroplast aus einem insgesamt 16 Tage alten Gerstenprimärblatt nach 7-tägiger Methyljasmonat Behandlung mit beginnender Desintegration der internen Membranstrukturen und großen Plastoglobuli.
b: Stark vergrößerter Ausschnitt eines Chloroplasten mit immer noch gut entwickelten Grana– und Stromathylakoiden und einigen großen PG
C: Ultrastruktur von Chloroplasten (aus einem insgesamt 16 Tage alten Gerstenprimärblatt) nach 7 Tagen Verdunkelung: Beginnende Desintegration hauptsächlich der Granathylakoide; keine auffällige Veränderung der Plastoglobuli.
c: Stark vergrößerter Ausschnitt eines Chloroplasten mit gut entwickelten, aber bereits desintegrierenden Grana – und Stromathylakoiden. Nur vereinzelt kleine PG zu erkennen.
D: Chloroplast aus einem 16 Tage alten Gerstenprimärblatt nach 5-tägiger UV-Bestrahlung: Starke Schädigung der internen Membransysteme des Chloroplasten; Bildung größer Stärkekörner (STK), jedoch keine Plastoglobuli.
d: Stark vergrößerter Ausschnitt eines Chloroplasten mit kaum mehr zu erkennenden internen Membranstrukturen, keine PG, jedoch großem Stärkekorn.
Abkürzungen: GT: Granathylakoide, M: Mitochondrium, PG: Plastoglobuli, ST: Stromathylakoide, STK: Stärkekorn, T: Thylakoide
Resümee:
Sowohl unter Verdunkelung als auch unter UV Bestrahlung zeigten die jeweiligen Chloroplasten z. T. erhebliche Veränderungen ihrer Ultrastruktur; dabei waren v. a.
die internen Membransysteme - die Thylakoide - betroffen. Jedoch war eine zahlenmäßige Anhäufung oder Vergrößerung von Plastoglobuli nicht zu beobachten.
Lediglich unter Einfluss von Methyljasmonat war vor allem eine sehr deutliche Vergrößerung der Plastoglobuli zu erkennen. Somit zeigte nur die Behandlung mit Methyljasmonat beide der geforderten seneszenzspezifischen Veränderungen -einen Chlorophyllverlust und gleichzeitige, starke Vergrößerung der Plastoglobuli.