Analyse der Genexpressionsmuster von chloroplastidären Proteinen Wie im vorangegangenen Abschnitt gezeigt werden konnte, nahm die Menge der

chloroplastenspezifischen Proteine Rbcs und LHCII mit zunehmender Dauer der Jasmonatbehandlung ab. Diese Abnahme kann, wie bereits erörtert, neben einer Verringerung der Importraten auch eine Abnahme der Synthese bzw. einen verstärkten Abbau als Ursache haben. Um Aussagen über die Synthese bzw. die Transkription der kernkodierten chloroplastenspezifischen Proteine Rbcs und LHCII treffen zu können, wurden abgeschnittene Gerstenprimärblätter auf Wasser oder Methyljasmonat für unterschiedliche Zeiten flotiert. Nach Extraktion der Gesamt-RNAs wurde eine Abnahme der Menge der korrespondierenden mGesamt-RNAs nach 24-stündiger Flotation beobachtet. Auch für die Transkripte von Komponenten des PS I (psaL, psaF und psaN, siehe Abb. 17) konnte eine solche Abnahme nachgewiesen werden. Bei der Abnahme schien es sich nicht um einen generellen RNA-Abbau zu handeln, da die Menge ribosomaler RNAs (s. UV-induzierte Fluoreszenz ribosomaler RNAs nach Ethidiumbromideinlagerung in Abb. 17) nahezu unverändert blieb.

Auch während der natürlichen Seneszenz konnte in Gerstenprimärblättern eine Abnahme der rbcs- und cab-Transkriptmengen boebachtet werden. Bereits in einem Alter von 2 Wochen wiesen die Blätter eine wesentlich geringere Menge an rbcs-und cab-Transkripten als 1-wöchige Blätter auf (Abb. 18). Wie auch nach Methyljasmonat-Behandlung schien es sich bei der Abnahme der Transkriptmengen um ein Phänomen zu handeln, von dem photosynthetisch wichtige Proteine betroffen waren. Im Unterschied zur Methyljasmonat-induzierten Seneszenz war jedoch während der natürlichen Seneszenz eine generelle Abnahme des RNA-Gehaltes pro Blattflächeneinheit zu beobachten. Dies geht aus der Menge der ribosomalen RNAs hervor, die bereits in 14 Tage alten Blättern um ein Vielfaches geringer war als 1-wöchigen (siehe UV-induzierte Fluoreszenz ribosomaler RNAs nach Ethidium-bromideinlagerung in Abb. 18)

Abb. 17: Transkriptmengen der kleinen Untereinheit der Rubisco (rbcs), des Light-Harvesting Chlorophyll a/b-binding proteins von Photosystem II (cab) sowie der Untereinheit L, F und N von Photosystem I (psaL, psaF and psaN), während der Methyljasmonat-induzierten Seneszenz.

Sieben Tage alte Gerstenprimärblätter wurden auf entweder Leitungswasser oder Methyljasmonat-haltiger Lösung für die angegeben Zeiträume flotiert. Blattscheibchen aus der Blattmitte von 5 verschiedenen Blättern, die zu einer Behandlung korrespondieren, wurden ausgestochen und die Gesamt-RNA wurde extrahiert. RNA-Volumina, die gleichen Blattflächen entsprachen, wurden auf ein

Formaldehyd-Agarosegel aufgetragen und geblotted. Die unterste Reihe zeigt die UV-induzierte Fluoreszenz Etidiumbromid-markierter ribosomaler RNA (Beladungskontrolle).

Abb. 18: Transkriptmengen der kleinen Untereinheit der Rubisco (rbcs), des Light-Harvesting Chlorophyll a/b-binding proteins von Photosystem II (cab) sowie der Untereinheit L, F und N von Photosystem I (psaL, psaF and psaN), während der natürlichen Seneszenz.

Gerstenprimärblätter wurden zu den angegebenen Zeitpunkten geerntet. Blattscheibchen wurden aus der Blattmitte von 5 verschiedenen Blättern, die zu einer Behandlung korrespondieren, ausgestochen und die Gesamt-RNA wurde extrahiert. RNA-Volumina, die gleichen Blattflächen entsprachen, wurden auf ein Formaldehyd-Agarosegel aufgetragen und geblotted.

Die unterste Reihe zeigt die UV-induzierte Fluoreszenz Etidiumbromid-markierter ribosomaler RNA (Beladungskontrolle).

Wie die Analyse der rbcs- und cab-Transkriptmengen zeigte, war die im Verlauf der Methyljasmonat-Behandlung registrierte Abnahme der intraplastidären Protein-konzentration sicher zumindest partiell durch eine Abnahme der Synthese infolge geringer mRNA-Mengen bedingt. Diese Beobachtung legte die Frage nahe, ob es während der (natürlichen oder Methyljasmonat-induzierten) Seneszenz möglicher-weise zu einer koordinierten Abschaltung der Transkription, Synthese und des Proteinimportes in die Plastiden kommen könnte. Vielleicht, so könnte man spekulieren, ist während der Seneszenz ein plastidärer Proteinimport ab einem bestimmten Stadium gar nicht mehr notwendig. Dieses träfe sicherlich für photosynthetisch wichtige Proteine zu. Andererseits sollte es jedoch Proteine geben (z.B. Proteasen, Nucleasen oder am Chlorophyllabbau beteiligte Enzyme), die während der natürlichen oder Methyljasmonat-induzierten Seneszenz in größerer Menge synthetisiert und dann importiert werden, da sie für den koordinierten Ablauf

des Entwicklungsprogrammes Seneszenz notwendig sind. Ein solches in Chloroplasten vorkommendes Enzym könnte z.B. die Pheophorbide a Oxygenase sein (synonym zu LLS1 in Mais oder ACD1 in A. thaliana), deren Expression zumindest in Mais seneszenzspezifisch erfolgt. Dieses Protein ist z. B. am Chlorophyllabbau beteiligt (GRAY, 2004).

Es sollte zunächst geprüft werden, ob die Expression des lls1-Gens aus Gerste nach Methyljasmonat-Behandlung bzw. während der natürlichen Seneszenz induziert wird.

Dazu wurden 7 Tage alte Gerstenprimärblätter, wie oben beschrieben, auf Leitungswasser bzw. Methyljasmonat-haltiger Lösung flotiert. Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde Gesamt-RNA isoliert und nach Northern-Blotting mit der radioaktiv-markierten lls1-Sequenz aus Mais hybridisiert und autoradiographisch nachgewiesen (Abb. 19A, obere Zeile). Außerdem wurden Proteine aus den Blättern extrahiert und nach SDS-PAGE und Western-Blot mit einem monoklonalen Antikörper inkubiert, der gegen das Mais LLS1-Protein gerichtet ist (Abb. 19A, untere Zeile).

Abb. 19: Transkript- und Proteinmengen des Lethal leaf spot Proteins (Lls1).

Transkriptmengen (obere Zeile) und Proteinmengen (untere Zeile) des Lls1 während Methyljasmonat-induzierter (A) und natürlich auftretender Seneszenz (B). Blattscheibchen wurden aus dem mittleren

Teil von 5 verschiedenen Blättern entnommen, die entweder einen Zeitpunk t(B) oder eine Behandlung mit entweder Leitungswasser oder Methyljasmonat repräsentierten (A) und Gesamt-RNAs oder Proteine wurden extrahiert. RNA- and Proteinmengen, die zu gleichen Blattflächen korrespondieren, wurden analysiert.

Die unterste Reihe zeigt die UV-induzierte Fluoreszenz Etidiumbromid-markierter ribosomaler RNA (Beladungskontrolle).

Darstellung eines Ergebnisses von drei unabhängigen Wiederholungen (n = 3).

Nach Inkubation der Blätter auf Leitungswasser oder Methyljasmonat-haltiger Lösung konnte eine Zunahme der lls1-Transkriptmenge beobachtet werden, zu der steigende Proteinmengen korrelierten. Auf Methyljasmonat erfolgte die Zunahme von Transkript- und Proteinmenge früher als nach Inkubation auf Leitungswasser.

Interessanterweise waren im Verlauf der natürlichen Seneszenz von Gerstenprimärblättern abnehmende lls1-Transkriptmengen zu beobachten, die jedoch zumindest von einer konstanten, wenn nicht sogar leicht ansteigenden Menge des korrespondierenden Proteins begleitet wurden (Abb. 19B).

Die deutlich zunehmende Proteinmenge an LLS1 (Pheophorbide a Oxygenase) in abgeschnittenen Gerstenprimärblättern nach Flotation auf Wasser und insbesondere auf Methyljasmonat-haltiger Lösung legte die Schlussfolgerung nahe, dass dieses Protein in die Chloroplasten importiert worden sein muss, da es nur in diesem Organell stabil und in prozessierter (reifer) Form akkumuliert. Demzufolge müssen Chloroplasten aus Blättern während der Methyljasmonat-induzierten Seneszenz einen funktionierenden Proteinimportapparat besitzen, bei dem es sich theoretisch um die noch vorhandene TIC-TOC-Maschinerie, deren Reste, mögliche Modifizierungen derselben oder sogar um einen Seneszenz-spezifischen Importapparat handeln könnte. Neben diesen spezifischen Änderungen der Importmaschinerie sind auch unspezifische Änderungen der Plastidenhüllmembran denkbar (Änderungen in der Lipidzusammensetzung), die den Proteinimport indirekt beeinflussen könnten. Da beispielsweise die TIC-TOC -Maschinerie aus zwei Multiproteinkomplexen besteht, bei deren Komponenten es sich zumindest zum Teil um periphere oder integrale Membranproteine handelt (KEEGSTRA und CLINE;

1999), sollte eine Änderung der Lipidzusammensetzung einen Einfluss auf die Lokalisierung solcher Proteine in der Plastidenhülle haben.

Resümee:

Die Analyse der Genexpressionsmuster der chloroplastidären Proteine RBCS und LHC II ergaben, das unter Methyljasmonateinfluss die jeweiligen korrespondierenden mRNA-Mengen dieser Proteine abnahmen. Da gleichzeitig keinerlei Veränderung der rRNA-Mengen zu verzeichnen war, handelte es sich offensichtlich nicht um einen generellen RNA-Abbau. Die Abnahme der Konzentration der interplastidären, photosynthetischen Proteine RBCS und LHC II war zumindest zum Teil durch eine Abnahme ihrer Synthese bedingt. Bei einem nicht photosynthetisch relevanten Protein – LLS1 (Phaeophorbide a Oxygenase) – wurde demgegenüber bei Methyljasmonat-inkubation ein Ansteigen der Proteinmenge im Plastiden beobachtet, was zu der Annahme führt, dass es auch während der Methyljasmonat-induzierten Seneszenz wenigstens einen funktionierenden Proteinimportapparat geben muss, bei dem es sich theoretisch um Reste der noch vorhandenen TIC-TOC-Maschinerie, mögliche Modifizierungen desselben oder sogar um einen Seneszenz-spezifischen Importapparat handeln könnte. Neben diesen spezifischen Änderungen der Importmaschinerie sind auch unspezifische Änderungen der Plastiden-hüllmembran denkbar, die den Proteinimport beeinflussen könnten.

3.3.5. Seneszenzbedingte Veränderungen in der Proteinzusammensetzung der