Vollständig konservierte Aminosäuren haben häufig einen großen Einfluss auf die Stabilität oder Funktion einer Proteinfamilie. Für die TrpD2-Gruppe wurden alle zu 100 % konservierten Aminosäuren ermittelt (Abbildung 4.2). Dabei wurden unter anderem Lysin- und Argininreste gefunden, die sehr wahrscheinlich für die Nukleinsäurebindung wichtig sind (Abbildung 4.9). Die Aufgabe der anderen konservierten Residuen war dagegen bisher unklar. Deshalb sollte ihre Bedeutung bei der Nukleinsäure-Bindung und später in physiologischen Tests (4.4.4) genauer analysiert werden. Zu diesem Zweck wurden sie einzeln zu Alaninen mutiert und die Eigenschaften dieser Proteinvarianten überprüft. Verzichtet wurde dabei auf den Austausch von Glycinen und Prolinen, da diese Aminosäuren in der Regel funktionell nicht von großer Relevanz sind. Nach diesen Einschränkungen blieben 11 konservierte
4.2 Analyse der Nukleinsäurebindung an TrpD2-Proteine 81
Positionen übrig, von denen, im Zeitrahmen dieser Arbeit, sechs gegen Alanine ausgetauscht und die betreffenden Proteine analysiert wurden. Zusätzlich wurde auch das Tyrosin an der Position 207 mutiert, obwohl es sich dabei nicht um eine vollständig konservierte Position handelte. Allerdings befindet sich bei allen TrpD2-Proteinen an dieser Stelle ein aromatischer Rest. Diese Aminosäure liegt im putativen aktiven Zentrum, nahe der Nukleinsäurebindestelle von YbiB und ist somit wahrscheinlich funktionell von Bedeutung (Abbildung 4.9).
Die Lage aller mutierten Residuen ist in Abbildung 4.15 gezeigt.
Abbildung 4.15: Bändermodell von YbiB mit Markierung der gegen Alanin ausgetauschten Aminosäuren. Die beiden Untereinheiten von YbiB sind in verschiedenen Grautönen dargestellt. Die fraglichen Aminosäuren sind mit Seitenketten gezeigt und im einen Protomer rot, im anderen blau hervorgehoben. Für ein Protomer wurden die Aminosäuren beschriftet.
Die einzelnen ybiB-Varianten wurden nach ihrer Herstellung mittels OE-PCR (3.2.6), in den pQE60-Vektor kloniert und in E. coli rekombinant exprimiert (3.3.3). Die betreffenden Proteine wurden gereinigt (3.3.4) und anschließend ihre Bindungseigenschaften an ein 12 Basen langes dT-DNA-Stück mittels Fluoreszenzspektroskopie analysiert (3.4.12). Der Fit der Titrationskurven mit Formel 5 (3.4.12) ergab, dass alle YbiB-Varianten, ebenso wie das Wildtyp-Protein, jeweils ein ssDNA-Molekül pro Proteindimer binden (vgl. Tabelle 4.2). Die für jede Variante ermittelten KD-Werte sind in Tabelle 4.3 gezeigt.
82 4 Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 4.3: Ergebnis der Fluoreszenztitration von YbiB-Varianten mit einem 12 b dT- Oligonukleotid.
Protein KD-WertFluoreszenztitration [nM]
YbiB wt 49
YbiB E54A 28
YbiB E58A 39
YbiB H204A 98
YbiB Y207A 28
YbiB L224A 150
YbiB E229A 60
YbiB E231A 20
Die Dissoziationskonstanten aller Proteine sind dabei sehr ähnlich. Dementsprechend beeinflussen die einzelnen Aminosäureaustausche die Bindung der Proteine an das untersuchte Oligonukleotid nicht oder nur unwesentlich.
Zusätzlich wurde mit einer weiteren Methode, der Oberflächenplasmonresonanz (SPR), die Interaktion zwischen den YbiB-Varianten und ssDNA analysiert (3.4.12). Hierfür wurde wiederum ein 12 b dT-Oligonukleotid verwendet, das über eine 5‘-Biotinylierung auf einem mit Streptavidin beschichteten Chip immobilisiert wurde (3.4.12). Die einzelnen Proteinvarianten wurden anschließend in mehreren Konzentrationen über die so modifizierte Oberfläche gepumpt und die Interaktion zwischen ssDNA und Protein gemessen. Exemplarisch sind die Sensogramme für zwei YbiB-Varianten in Abbildung 4.16 gezeigt. Die Bindungskurven der anderen Proteine finden sich im Anhang (Abbildung 7.1).
Abbildung 4.16: Analyse der Bindungseigenschaften von YbiB wt (A) und YbiB Y207A (B) an ein 12 b dT-Oligonukleotid mit SPR. Die gemessene Signaländerung (Ri) ist gegen die Zeit aufgetragen.
Die Bindung an das immobilisierte Oligonukleotid wurde jeweils mit den angegebenen Proteinkonzentrationen getestet. Die Assoziationsphase wurde jeweils 180 s verfolgt. Die, durch Zugabe von Puffer induzierte, Dissoziation wurde anschließend 600 s gemessen.
4.2 Analyse der Nukleinsäurebindung an TrpD2-Proteine 83
Es zeigten alle Proteine ein deutliches, in seiner Stärke und seinem Verlauf konzentrationsabhängiges, Bindungssignal. Somit konnte für alle YbiB-Varianten auch mit der Methode der SPR eine Bindung an das 12 b dT-Oligonukleotid beobachtet werden. Die beiden Varianten YbiB-E229A und -E231A zeigten allerdings unter den gewählten experimentellen Bedingungen, vermutlich aufgrund der langen Inkubationszeit bei Raumtemperatur im autosampler des Geräts, deutliche Aggregationstendenzen. Dementsprechend unterscheiden sich hier die Sensogramme in ihrem Verlauf von denen der anderen Proteine (Abbildung 7.1) und wurden deshalb nicht für weitere Auswertungen herangezogen.
Als generell problematisch für die quantitative Auswertung erwiesen sich die negativen Ausschläge der Bindungskurven zu Beginn der Assoziationsphase (Abbildung 4.16 A).
Diese wurden durch unspezifische Bindung von YbiB an die nicht funktionalisierte Oberfläche der Referenzzelle hervorgerufen. Dieses Phänomen wurde jedoch im Verlauf der Messungen immer schwächer, vermutlich weil die unspezifischen Bindungsstellen der Referenzzelle zunehmend mit Protein abgesättigt wurden (Abbildung 4.16 B). Die Bestimmung der Geschwindigkeitskonstante der Assoziation (ka) war allerdings trotzdem nicht möglich. Grund dafür war die Immobilisierung einer zu großen Menge Oligonukleotid auf dem Chip (Anja Drescher, GE HEALTHCARE, persönliche Mitteilung). Dadurch kommt es bei der Assoziation zu einer signifikanten Änderung der Proteinkonzentration in der Nähe der Oberfläche. Da die Proteinkonzentration zum Auswerten der Daten allerdings bekannt und konstant sein muss, liefert die Auswertung solcher Bindungsdaten fehlerhafte Ergebnisse. Zusätzlich können im vorliegenden Fall die einzelnen Oligonukleotide, aufgrund ihrer hohen Dichte auf der Oberfläche, nicht mehr als unabhängige Bindestellen betrachtet werden.
Die Immobilisierung von lediglich ca. 5 – 10 % der hier aufgebrachten Oligonukleotidmenge wäre erfolgversprechender gewesen. Somit konnten für die jeweiligen Varianten nur die Dissoziationsphasen ausgewertet werden, da hier die tatsächliche Proteinkonzentration keine Rolle spielt. Daraus wurden jeweils die Geschwindigkeitskonstanten der Dissoziation kd ermittelt, die für alle getesteten YbiB-Varianten in einem ähnlichen Bereich liegen (Tabelle 4.4).
84 4 Ergebnisse und Diskussion
Tabelle 4.4: Geschwindigkeitskonstante kd für die Dissoziation verschiedener YbiB-Varianten von einem immobilisierten 12 b dT-Oligonukleotid.
Protein kd [s-1]
YbiB wt 0,0014
YbiB E54A 0,0012
YbiB E58A 0,0026
YbiB H204A 0,0041
YbiB Y207A 0,0027
YbiB L224A 0,0044
Die erzeugten YbiB-Mutanten mit einzelnen Alaninaustauschen von konservierten Aminosäuren zeigen also alle unveränderte Bindungeigenschaften für das getestete 12 b dT-Oligonukleotid, sowohl bezüglich Stöchiometrie, als auch in Hinsicht auf Affinität und Geschwindigkeitskonstante der Dissoziationskonstante kd. Die Aufgabe dieser Aminosäuren in der TrpD2-Proteinfamilie liegt demnach nicht in der Bindung einzelsträngiger Nukleinsäuren. Ihre mögliche Funktion wurde später mit anderen Experimenten weiter untersucht (4.4.4).