Auswirkungen einer miRNA auf die CFPS

Es wurden CFPS Reaktionen im Batch-Verfahren (siehe 3.5.5) unter Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen der miRNA (siehe 3.5.9) durchgeführt und die Auswirkungen auf die Synthese des Testproteins CAT, ausgehend vom Plasmid pK7-CAT, bestimmt (siehe 3.5.10). Dabei konnte gezeigt werden, dass die Synthese der CAT in Anwesenheit der miRNA in der optimalen Konzentration von 200 nM um durchschnittlich 13% gesteigert wurde (Abb. 4.32). Auch betrachtete man im Batch-Verfahren die Synthese der CAT, mit und ohne zugesetzter miRNA, über die Zeit, wobei festzustellen war, dass gerade zu Beginn der Reaktion die CAT Synthese durch die miRNA beschleunigt wird.

Später im Reaktionsverlauf hat die miRNA kaum noch Einfluss auf die Proteinsynthese (Abb.

4.33).

144

Als nächstes testete man, ob der Effekt der miRNA auf andere E. coli CFPS Systeme übertragbar ist, was beispielsweise bei der Verwendung des tac Promotors (siehe 4.5.2) nicht der Fall war. Aus diesem Grund synthetisierte man die CAT, ausgehend vom Plasmid pK7-CAT, jeweils in An- und Abwesenheit der miRNA (200 nM) im S30 T7 High-Yield Protein Expression System (Promega; siehe 3.5.7) bei 37° C. Im selben System unter den gleichen Bedingungen synthetisierte man auch die DHFR, ausgehend vom Plasmid pET20b(+) DHFR, um auszuschließen, dass der beobachtete Einfluss der miRNA spezifisch für die Synthese der

0

Abb. 4.32: Auswirkungen der miRNA auf die Synthese der CAT

Links: Bestimmung der optimalen Konzentration der miRNA anhand der Synthese der CAT bei 37 °C im Batch-Verfahren. Nach 1 h Reaktionszeit wurde die Menge an synthetisiertem Protein durch die miRNA in der optimalen Konzentration von 200 nM um 15% gesteigert.

Rechts: Mehrmalige Wiederholungen des Versuchs unter gleichen Bedingungen (1 h bei 37° C) ergaben eine durchschnittliche Steigerung der CAT Synthese durch die miRNA um 13%. In beiden Abbildungen ist die synthetisierte CAT als relativer Wert dargestellt, wobei die Kontrolle ohne miRNA 1 gesetzt wurde.

Abb. 4.33: Vergleich der CAT Synthese, mit und ohne miRNA, über die Zeit Die Reaktionen fanden im Batch-Verfahren statt, wobei zu den angegebenen Zeitpunkten eine Probe entnommen und die synthetisierte CAT quantifiziert wurde.

145

CAT ist (Abb. 4.34). Dabei wurde festgestellt, dass die miRNA auch im anderen E. coli System und mit anderen Proteinen funktioniert.

Um nun zu bestimmen, ob die Effekte der miRNA eventuell größer ausfallen, wenn ein in CFPS Systemen schlecht exprimierbares Protein synthetisiert wird, testete man auch die Expression der PDZ2-Domäne (pET-20b(+) PDZ2) und des AI-BP (pET-14b AI-BP) im S30 T7 High-Yield Protein Expression System (Promega; siehe 3.5.7) bei 37° C. Das AI-BP konnte dabei, wie schon in den Vorversuchen, nicht nachgewiesen werden, egal ob die Expression in An- oder Abwesenheit der miRNA stattfand. Selbst nach 4 h Expression und dem Auftragen großer Mengen der Reaktionsansätze war kein Nachweis im Western Blot möglich. Die Synthese des AI-BP konnte also nicht durch die miRNA induziert werden. Der Nachweis der PDZ2-Domäne war dagegen, wie in den Versuchen zuvor, im Western Blot möglich (Abb. 4.35). Dabei konnte jedoch nicht geklärt werden, ob die Synthese dieser Domäne durch die Anwesenheit miRNA verbessert wird. Auf jeden Fall blieb der erhoffte große Effekt auf die Expression aus.

Abb. 4.34: Effekt der miRNA auf die Synthese der CAT und der DHFR im S30 T7 High-Yield Protein Expression System bei 37° C

Links: In diesem System konnten ähnliche Effekte der miRNA auf die Synthese der CAT festgestellt werden, wie in dem selbst hergestellten, das zuvor verwendet wurde. Zu den angegebene Zeitpunkten wurden Proben aus den Batch-Ansätzen entnommen und die CAT quantifiziert. Zu jedem Zeitpunkt war mehr des Testproteins detektierbar, wenn die miRNA anwesend war (15% nach 0,5 h; 8,5% nach 1 h; 9,7% nach 4 h).

Rechts: Auch wenn die DHFR in diesem System synthetisiert wurde, konnte zu jedem Zeitpunkt bei der Quantifizierung (siehe 3.5.11) mehr der DHFR nachgewiesen werden, wenn sie in Anwesenheit der miRNA synthetisiert wurde (13,2% nach 0,5 h; 13,1% nach 1 h; 10,2% nach 2 h; 5,7% nach 4 h). Hier beziehen sich die Fehlerindikatoren nicht auf die Mittelabweichung, wie in allen anderen Abbildungen, sondern spiegeln den Messfehler wieder.

146

Der Einfluss der miRNA auf jeweils ein gut (CAT; pK7-CAT) und ein schlecht (PDZ2-Domäne; pET-20b(+) PDZ2) exprimierbares Protein wurde auch noch mit dem PURExpress^® In Vitro Protein Synthesis Kit (New England Biolabs; siehe 3.5.8) bei einer Expressionstemperatur von 37° C bestimmt. In diesem System konnte weder bei der Expression der CAT, noch bei der Expression der PDZ2-Domäne ein Effekt der miRNA festgestellt werden (Abb. 4.36).

Abb. 4.35: Effekt der miRNA auf die Synthese der PDZ2-Domäne im S30 T7 High-Yield Protein Expression System bei 37° C

Western Blot nach 16% SDS-PAGE. Aufgetragen wurden jeweils 2 µl der Reaktionsansätze zu verschiedenen Zeitpunkten der PDZ2 Expression. Die Detektion des C-terminalen His6-tags der PDZ2-Domäne erfolgte mit dem Universal His Western Blot Kit 2.0 (Clontech; siehe 3.4.3.3). Es wurden Reaktionen in Ab- (-) und Anwesenheit (+) von 200 nM der miRNA durchgeführt. Die Menge an synthetisierter PDZ2-Domäne schien dabei unabhängig von der miRNA zu sein. Dabei muss jedoch festgehalten werden, dass kleine Unterschiede im Wester Blot nicht detektierbar sind. Lediglich bei einer Expressionszeit von 1 h schien ohne miRNA etwas mehr Protein synthetisiert worden zu sein. Die Kontrolle (0) enthielt keine template DNA.

Abb. 4.36: Einfluss der miRNA auf die Expression der CAT und der PDZ2-Domäne bei Verwendung des PURExpress^® In Vitro Protein Synthesis Kit bei 37° C

Links: Die in An- und Abwesenheit von 200 nM der miRNA synthetisierte CAT wurde zu verschiedenen Zeitpunkten der Expression quantifiziert, wobei kein Effekt der miRNA festgestellt werden konnte.

Rechts: 16% SDS-PAGE nach Coomassie-Färbung. Aufgetragen sind jeweils verschiedene Mengen der Reaktionsansätze einer 4 stündigen Expression der PDZ2-Domäne ohne (-) und mit (+) 200 nM der miRNA. Es sind keine Unterschiede erkennbar. Die Reaktionsansätze wurden nach der Expression von Ribosomen gereinigt (siehe 3.5.8), die Proteine mit Aceton gefällt (siehe 3.4.10) und in das Ausgangsvolumen Probenpuffer wieder aufgenommen. Mit dem PURExpress^® In Vitro Protein Synthesis Kit exprimierte die PDZ2-Domäne so gut, dass kein Nachweis im Western Blot erforderlich war. Die Kontrolle (0) enthielt keine template DNA.

147

Eine weitere Fragestellung war, wie lange die eingesetzte miRNA in den Reaktionsansätzen stabil ist, da S30 Extrakte bekanntlich auch RNasen enthalten. Dazu wurde ein großer Ansatz ohne template DNA mit dem S30 T7 High-Yield Protein Expression System (Promega) hergestellt, der die miRNA in einer Konzentration von 200 nM enthielt, bei 37° C inkubiert und zu unterschiedlichen Zeitpunkten Proben entnommen aus denen die gesamt RNA, inklusive der miRNAs, isoliert und in cDNA umgeschrieben wurde. Der Nachweis erfolgte dann mit speziellen Primern durch PCR. Das genaue Vorgehen bei diesem Versuch ist in Punkt 3.5.12 beschrieben. Die optimale, für die PCR eingesetzte Menge cDNA wurde dann auf 100 ng pro Reaktion bestimmt und die PCR entsprechend mit allen entnommenen Proben durchgeführt (Abb. 4.37). Ein hier nicht gezeigter Kontrollversuch, bei dem 200 ng der miRNA in cDNA umgeschrieben und davon 1 ng in einer identischen PCR eingesetzt wurden, bestätigte, dass es sich bei der Bande auf einer Höhe von 100 bp in Abbildung 4.37 tatsächlich um das cDNA Transkript der miRNA handelte.

Abb. 4.37: Stabilität der miRNA in den Reaktionsansätzen

1% Agarose-Gel. Aufgetragen wurden jeweils die PCR Reaktionen zum Nachweis der in cDNA umgeschriebenen miRNA (Pfeil). Die Zeitpunkte, zu denen die Proben entnommen wurden, sind angegeben. Die miRNA konnte bis zu 2 h nach Reaktionsbeginn nachgewiesen werden. Neben der nachgewiesenen miRNA sind auf dem Gel auch viele Banden zu erkennen, die unspezifisch in der PCR amplifiziert wurden. Die Entstehung dieser unspezifischen Amplifikationsprodukte konnte nicht durch eine Erhöhung der Annealingtemperatur, oder den Einsatz von weniger cDNA template in der PCR verhindert werden. Zum Zeitpunkt 0 sind keine unspezifischen Banden erkennbar. Hier konnte jedoch auch die miRNA schlechter nachgewiesen werden als zu späteren Zeitpunkten.

148