3 ERGEBNISSE
3.3 Trunkationsexperimente und Membranbindungsstudien
3.3.3 Der Austausch von oberflächenexponierten, hydrophoben zu geladenen Aminosäuren führt zu
Wie bereits erwähnt, besteht eine strukturelle Ähnlichkeit der N-terminalen Domäne der LOX mit der C-terminalen Domäne der humanen Lipoprotein Lipase. Insbesondere die bei diesem Enzym identifizierten Membranbindungsdeterminanten finden eine Entsprechung bei der LOX in zwei oberflächenexponierten hydrophoben Aminosäuren, Phe70 und Leu71. Um den Einfluss dieser beiden Aminosäuren auf die Membranbindung zu überprü-fen, wurden ortsgerichtete Mutagenesen zu geladenen Aminosäuren mit ähnlichen sterischen Eigenschaften durchgeführt (Phe70His, Leu71Lys und Phe,Leu70,71His,Lys).
Die entsprechenden Enzymspezies wurden als His-tag Proteine in E. coli exprimiert und gereinigt und anschließend in Aktivitätsassays sowie dem Membranbindungsassay eingesetzt.
Aus Tab. 14 ist ersichtlich, dass die Mutanten eine geringere Membranbindungsfähigkeit besitzen als der Wildtyp. Dieser Effekt ist jedoch nicht additiv, da sich die Doppelmutante kaum anders verhält als die Einzelmutanten. Die Arachidonsäureoxygenaseaktivität ist vergleichbar mit der des Wildtyps.
Tab. 14: Vergleich der Aktivitäten und Membranbindungseigenschaften der WT-LOX mit verschiedenen Mutanten lokalisiert in der N-terminalen Domäne. Für die Membranbindungs-eigenschaften sind die Mittelwerte dreier Experimente +/- Standardabweichung angegeben.
LOX-Spezies
Arachidonsäu-
reoxygenase-aktivität (s-1)
rel. Membran- oxygenase-aktivität (%)
membrangebun-dener Anteil (%) ungebundener Anteil (%)
Wildtyp 11.4 100 80 ± 8 20 ± 8
F70H 12.7 98.0 55 ± 3 45 ± 3
L71K 8.9 63.4 48 ± 7 52 ± 7
F70H+L71K 10.2 72.7 45 ± 10 55 ± 10
Es konnte also gezeigt werden, dass zwei oberflächenexponierte, hydrophobe Aminosäu-ren der N-terminalen Domäne an der Membranbindung der LOX beteiligt sind. Da in vorhergehenden Experimenten gefunden wurde, dass es in der C-terminalen Domäne
ebenfalls Membranbindungsdeterminanten geben sollte, liegt der Schluss nahe, dass es sich auch hier um oberflächenexponierte, hydrophobe Aminosäuren handelt. Um dies zu überprüfen, wurde zunächst die Kristallstruktur der LOX untersucht. Leider ist die Struktur unvollständig, unter anderem fehlt ein wichtiger Bereich in der Nähe des Eingangs zum aktiven Zentrum (Aminosäuren 177-188). Aus diesem Grund wurde ein Modell erstellt, in welches die fehlenden Aminosäuren als Helix hineinmodelliert sind. In diesem Modell wurde nach hydrophoben Aminosäuren gesucht, deren lösungsmittelexponierter Anteil größer als 35% ist. Es wurden 21 entsprechende Aminosäuren gefunden, darunter Phe70 und Leu71 in der N-terminalen Domäne (Abb. 37).
Phe70,Leu71
Trp181
Phe70,Leu71
Trp181
Abb. 37: Oberflächenexponierte, hydrophobe Aminosäuren der Kaninchen-Retikulozyten 15-LOX (gelb). Blau: N-terminale Domäne, grau: C-terminale Domäne, orange: in die Bindungstasche modellierte Arachidonsäure.
Da davon auszugehen ist, dass eine Membranbindung der LOX so erfolgt, dass Substrate Zugang zum aktiven Zentrum haben, sollten Membranbindungsdeterminanten in etwa auf der gleichen Seite des Enzyms liegen, wie der Eingang zum aktiven Zentrum. Dies ist für 12 der 21 Aminosäuren der Fall, darunter wiederum die bereits als Bindungsdeterminanten identifizierten Phe70 und Leu71. Von diesen 12 verbleibenden Aminosäuren wurde Trp181 zunächst untersucht. Es liegt direkt neben dem Eingang zur Substratbindungsta-sche, wobei es Bestandteil der modellierten Helix ist. Die genaue Lage der Seitenkette ist daher unbekannt.
Trp181 wurde gegen eine Reihe von Aminosäuren ausgetauscht. So erfolgten Mutationen zu Alanin, Glutamat und Lysin. Von diesen Mutanten sollte das geladene Glutamat den größten Effekt zeigen. Alanin ist zwar im Protein ebenfalls hydrophob, besitzt aber keine exponierte Seitenkette und die Lysin-Mutante erfolgte aus einem Sequenzvergleich, aus dem hervorgeht, dass an Stelle des Trp181 in vielen LOXn, u. a. dem menschlichen Homo-log, ein Lysin zu finden ist. In Tab. 15 ist die Membranbindungsfähigkeit der einzelnen Trp181-Mutanten dargestellt.
Tab. 15: Membranbindungsfähigkeit von Trp181-Mutanten im Vergleich zum Wildtyp (Mittelwer-te dreier Experimen(Mittelwer-te +/- Standardabweichung)
LOX-Spezies membrangebundener Anteil (% im Pellet)
ungebundener Anteil (% im Überstand)
Wildtyp 80 ± 8 20 ±8
W181A 60 ± 2 40 ± 2
W181E 21 ± 6 79 ± 6
W181K 57 ± 3 43 ± 3
Diese Ergebnisse belegen, dass Trp181 ebenfalls einen großen Einfluss auf die Membran-bindungsfähigkeit der 15-LOX hat. Damit wurde also auch in der C-terminalen Domäne eine Membranbindungsdeterminante identifiziert. Wie erwartet, hat der Austausch des hydrophoben Trp181 zu einem geladenen Glutamat den größten Effekt, der membrange-bundene Enzymanteil verringert sich von 80% für den Wildtyp auf 21% für die Trp181Glu-Mutante.
Vergleicht man die Oxygenaseaktivitäten des Wildtyps mit denen der Trp181Ala- und Trp181Glu-Mutanten, so fällt auf, dass die Membranoxygenaseaktivität mit der schlechte-ren Membranbindung der Mutanten stark abnimmt (Tab. 16). Darüber hinaus ist jedoch auch der Umsatz freier Fettsäuren gestört, was vermutlich auf die Nähe des Trp181 zum Eingang der Substratbindungstasche zurückzuführen ist. Das Vorhandensein eines gelade-nen Glutamats könnte die Substratbindung negativ beeinflussen.
Tab. 16: Vergleich der Arachidonsäure- und Membranoxygenaseaktivitäten der Trp181-Mutanten mit dem Wildtyp
LOX-Spezies Arachidonsäureoxy-genaseaktivität (s-1)
Membranoxy-genaseaktivität (s-1)
Wildtyp 11.6 0.066
W181A 8.4 0.034
W181E 0.72 0.010
Die Untersuchung der Doppelmutante Phe,Leu70,71His,Lys in der N-terminalen Domäne ergab keinen additiven Effekt der beiden Mutationen, die Membranbindung der Doppel-mutante war kaum geringer als die der beiden EinzelDoppel-mutanten. Um zu überprüfen, ob es einen solchen Effekt bei gleichzeitigem Austausch von Aminosäuren in der N- und der C-terminalen Domäne gibt, wurde die Doppelmutante Phe70His,Trp181Ala eingeführt.
Die Ala-Mutante wurde gewählt, da bei Trp181Glu die Membranbindung bereits so schlecht war, dass ein zusätzlicher Effekt durch eine weitere Mutation möglicherweise nicht detektierbar gewesen wäre. Wie sich zeigte, sank der membrangebundene Enzyman-teil von 55% bzw. 60% der Einzelmutanten auf 36% bei der Doppelmutante (Tab. 17). Es ist also davon auszugehen, dass sowohl der N-Terminus als auch die C-terminale Domäne in einer konzertierten Aktion an der Membranbindung der LOX beteiligt sind.
Tab. 17: Einfluss einer Doppelmutante in der N- und C-terminalen Domäne auf die Membranbin-dung
LOX-Spezies membrangebundener Anteil (% im Pellet)
ungebundener Anteil (% im Überstand)
Wildtyp 80 ± 8 20 ± 8
F70H 55 ± 3 45 ± 3
W181A 60 ± 2 40 ± 2
F70H+W181A 36 ± 13 64 ± 13
Um weitere Membranbindungsdeterminanten zu identifizieren, wurden eine Reihe der oberflächenexponierten, hydrophoben Aminosäuren in ein Glutamat ausgetauscht. Im Einzelnen waren dies Tyr15 in der N-terminalen Domäne und Leu195, Tyr292 und Phe412 im C-Terminus. Die Membranbindungsfähigkeit dieser Mutanten wurde im Membranbin-dungsassay überprüft und ist in Abb. 38 dargestellt.
Ü P Ü P Ü P Ü P
Y15E L195E Y292E F412E
LOX
Ü P Ü P Ü P Ü P
Y15E L195E Y292E F412E
LOX
Abb. 38: Membranbindungsfähigkeit verschiedener Mutationen von oberflächenexponierten, hydrophoben Aminosäuren in ein Glutamat. Dargestellt ist der Röntgenfilm nach Western Blot.
Ü: Überstand (ungebundener LOX-Anteil), P: Pellet (membrangebundener LOX-Anteil).
In Tab. 18 ist die Quantifizierung verschiedener Bindungs-Experimente zusammengefasst.
Tab. 18: Untersuchung des Einflusses weiterer oberflächenexponierter, hydrophober Aminosäuren auf die Membranbindung durch Mutation in ein Glutamat
LOX-Spezies membrangebundener Anteil (% im Pellet)
ungebundener Anteil (% im Überstand)
Wildtyp 80 ± 8 20 ± 8
Y15E 47 ± 6 53 ± 6
L195E 32 ± 5 68 ± 5
Y292E 69 ± 2 31 ± 2
F412E 69 ± 3 31 ± 3
Von diesen vier Mutanten haben also nur zwei, Tyr15Glu und Leu195Glu, einen deutli-chen Einfluss auf die Membranbindung. Die beiden anderen Aminosäuren, Tyr292 und Phe412, spielen bei der Membranbindung höchstens eine geringe Rolle. In Abb. 39 ist die Lage der identifizierten Bindungsdeterminanten dargestellt.
Phe412
Tyr292
Phe412
Tyr292
Phe70,Leu71
Tyr15
Trp181 Leu195
Phe70,Leu71
Tyr15
Trp181 Leu195
Abb. 39: Struktur der LOX mit den identifizierten Determinanten für die Membranbindungsfähig-keit in rot, untersuchte Aminosäuren ohne Einfluss in violett, weitere oberflächenexponierte, hydrophobe Aminosäuren in gelb (nicht untersucht). Blau: N-terminale Domäne, grau: C-terminale Domäne, orange: in die Bindungstasche modellierte Arachidonsäure.
Zur weiteren Verringerung der Membranbindungsfähigkeit der LOX wurden nun Mehr-fachmutanten eingeführt. Es wurde die N-terminale dreifach Mutante Tyr15Glu,Phe70His, Leu71Lys, die C-terminale Doppelmutante Trp181Glu,Leu195Glu sowie die vierfach Mutante Tyr15Glu,Phe70His,Leu71Lys,Leu195Glu exprimiert und deren Membranbin-dungsfähigkeit untersucht (Abb. 40, Tab. 19)
Ü P Ü P Ü P WT Y15E,F70H,
L71K
Y15E,F70H, L71K,L195E
LOX
W181E, L195E
Ü P
Ü P Ü P Ü P
WT Y15E,F70H, L71K
Y15E,F70H, L71K,L195E
LOX
W181E, L195E
Ü P
Abb. 40: Membranbindungsfähigkeit verschiedener Mehrfachmutanten von oberflächenexponier-ten, hydrophoben Aminosäuren. Dargestellt ist der Röntgenfilm nach Western Blot analog dem Membranbindungsassay. Ü: Überstand (ungebundener LOX-Anteil), P: Pellet (membrangebunde-ner LOX-Anteil).
Tab. 19: Vergleich der Membranbindungsfähigkeit von Mehrfachmutanten
LOX-Spezies membrangebundener Anteil (% im Pellet)
ungebundener Anteil (% im Überstand)
Wildtyp 80 ± 8 20 ± 8
Y15E,F70H,L71K 22 ± 4 78 ± 4
W181E,L195E 13 ± 5 87 ± 5
Y15E,F70H,L71K,L195E 14 ± 2 86 ± 2
Der Austausch von hydrophoben, oberflächenexponierten Aminosäuren vor allem zu einem geladenen Glutamat führt also zu einer drastischen Verringerung der Membranbin-dungsfähigkeit der 15-LOX. Daraus lässt sich schließen, dass die 15-LOX durch hydro-phobe Wechselwirkungen an Membranen bindet. Dies geschieht unter Beteiligung ober-flächenexponierter, hydrophober Aminosäuren, die sowohl in der N-terminalen als auch in der C-terminalen, katalytischen Domäne lokalisiert sind.
3.3.4 LOX-Mutanten mit verringerter Membranbindungsfähigkeit sind weniger in der