Analytische Methoden

2.4.1 Messung der Lipoxygenaseaktivität 2.4.1.1 Photometrischer Aktivitätsassay

Photometrische Messungen wurden an dem Spektrophotometer UV-160 A der Firma Shimadzu durchgeführt. Dabei wurde die zeitabhängige Absorptionszunahme bei dem Absorptionsmaximum des Reaktionsproduktes, 235 nm für konjugierte Diene, und einer

Temperatur von 20°C verfolgt. Der Standardassay bestand aus 950 µl Phosphatpuffer pH 7,4, dem Enzym und 50 µl Substratlösung (Endkonzentrationen Substrat 260 µM, Cholat 0,2%). Die Reaktion wurde durch Zugabe des Substrats gestartet und der Absorpti-onsverlauf nach kurzem Rühren gemessen. Für viele Messungen wurde auch eine Sub-stratkonzentration von 100 µM ohne Cholat-Zusatz verwendet.

2.4.1.2 HPLC Aktivitätsassay

Die Umsetzung des Substrats (100 µM) mit LOX im Standardassay erfolgte in 0,1 M Phosphatpuffer pH 7,4 in einem Volumen von 500 µl für 15 min bei Raumtemperatur.

Anschließend wurden die gebildeten Hydroperoxyverbindungen mit Natriumborhydrid reduziert, der pH-Wert mit konzentrierter Essigsäure auf 3-4 eingestellt und 500 µl Methanol zugegeben. Nach Vortexen und Zentrifugation (10 min 20000 g) wurde der Überstand direkt für die Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC) verwendet.

Für Umsätze mit der 5-LOX bzw. deren Mutanten wurde als Puffer PBS mit den Zusätzen 0,1 mM ATP, 0,1 mM EDTA und 12,5 µg/ml Dipalmitoylphosphatidylcholin verwendet.

Für die Aktivitätsuntersuchung einzelner Bakterienklone wurde das Pellet einer 5 ml Kultur (2.3.2) in 500 µl des entsprechenden Puffers resuspendiert und Bakterien nach Substratzugabe (100 µM) mit Ultraschall aufgeschlossen (50 W, 2 mal 15 Impulse, 0°C).

Anschließend wurde wie für den Standardassay beschrieben weiterverfahren.

RP-HPLC wurde an einer HP-Chemstation mit einem HP 1040A Diodenarraydetektor durchgeführt. Als Trennsäule diente eine Nucleosil C-18 Säule (250 x 4 mm, Machery-Nagel, Düren) mit einer entsprechenden Vorsäule (30 x 4 mm). Das Laufmittel bestand aus Methanol/Wasser in unterschiedlichen Verhältnissen, meist 80/20, und 0,1% Essigsäure, die Flussrate betrug 1 ml/min. Die Detektion erfolgte im Extinktionsmaximum der zu untersuchenden Verbindung:

235 nm konjugierte Diene (Hydro(pero)xyfettsäuren) 242 nm doppelt-konjugierte Diene (DiH(P)ETE) 270 nm konjugierte Triene (DiH(P)ETE)

300 nm konjugierte Tetraene (Lipoxine) 210 nm Fettsäuren

2.4.2 Produktanalyse

LOX-Produkte konnten häufig bereits in der RP-HPLC über den Vergleich der Retentions-zeiten und der Absorptionsspektren mit denen von authentischen Standardsubstanzen iden-tifiziert werden. Über Eichkurven erstellt mit Standardsubstanzen konnten die entspre-chenden Verbindungen über die Flächen der detektierten Peaks quantifiziert werden.

Zur weiteren Analyse wurden einzelne Produkte aufgefangen und, nachdem das Laufmittel unter Vakuum verdampft wurde, der Normalphasen-HPLC (SP-HPLC), Chiralphasen-HPLC (CP-Chiralphasen-HPLC) oder der Massenspektrometrie (MS) zugeführt.

2.4.2.1 Normalphasen-HPLC

Neben der Identifizierung der Produkte über Retentionszeit und Spektrum in der RP-HPLC ist es zum Teil notwendig, eine weitere Untersuchung von Produkten durchzuführen, die in der RP-HPLC nur unzureichend getrennt wurden. Dazu werden die zur Trockne eingeeng-ten Fraktionen aus der RP-HPLC in n-Hexan/0,1% Essigsäure aufgenommen und über die SP-HPLC weiter untersucht. Dies erfolgte über eine Nucleosil 100-7 Säule (250x4 mm, Machery-Nagel, Düren) mit einem SPD-M6A-Detektor (Shimadzu). Die Detektion erfolgte wie bei der RP-HPLC bei dem Extinktionsmaximum des untersuchten Produktes, in der Regel also bei 235 nm für konjugierte Diene (HETE, HODE). Als Laufmittel diente ein n-Hexan/Isopropanol Gemisch (unterschiedliche Verhältnisse, meist 2% Isopropanol) mit 0,1% Essigsäure und einer Flussrate von 1 ml/min.

2.4.2.2 Chiralphasen-HPLC

Produkte aus nicht-enzymatischen Reaktionen, z. B. aus Autoxidation, sind racemisch, während die LOX-Reaktion stereospezifisch abläuft unter Bildung von Produkten in der S-Konfiguration (Ausnahme R-LOXn). Zur Überprüfung, ob tatsächlich ein LOX-Produkt vorliegt, musste also die Enantiomeren-Zusammensetzung bestimmt werden. Hierzu wurde das entsprechende aufgefangene und zur Trockne eingeengte Produkt aus RP- oder SP-HPLC in n-Hexan/0,1% Essigsäure aufgenommen und der Chiralphasen-SP-HPLC (CP-HPLC) zugeführt. Hier erfolgte eine Trennung der Enantiomeren über chirale Säulen (Chiralcel OD bzw. OB, 250x4,6 mm, Diacel Chem. Industries, USA) mit dem Laufmittel n-Hexan/2-Propanol (wechselnde Zusammensetzung) und 0,1% Essigsäure. Die Flussrate

betrug 1 ml/min, die Detektion erfolgte bei der entsprechenden Wellenlänge (235 nm für konjugierte Diene) mit dem SPD-M6A Detektor (Shimadzu). Aufgrund gleicher Absorpti-onseigenschaften der beiden Enantiomere konnte deren Verhältnis aus den Peakflächen berechnet werden.

2.4.2.3 Massenspektrometrie

Die Strukturen der Produkte, für die es keinen authentischen Standard gab, der für die Cochromatografie in der HPLC verwendet werden konnte, wurden über Massenspektro-metrie (MS) bestimmt.

LC/MS:

Hierzu wurden die HPLC gereinigten Substanzen in einem 1:1 Gemisch aus Methanol und 50 mM Ammoniumhydrogencarbonat pH 8.0 aufgenommen und über die Negativ-Ionen-Massenspektrometrie analysiert. Aliquots der Probe wurden mit 3 µl/min in die auf 200°C erhitzte Injektions-Kapillare eines LCQ-Ionenfallen-Massenspektrometers (Thermoquest, Engelsbach) eingespritzt. Die Ionisierung der Proben erfolgte mittels Elektrospray bei 4 kV. Die Ionen wurden im negativ-Modus in einem Bereich von m/z 100-500 detektiert.

Weitere Fragmentierung einzelner Molekül-Ionen (MS/MS) erfolgte bei einer Spannung zwischen 10 und 40 Volt.

GC/MS:

Für die Analyse von Produkten über GC/MS wurden diese zunächst über RP- bzw. SP-HPLC gereinigt. Anschließend mussten sie folgenderweise derivatisiert werden: Carbo-xylgruppen wurden mit Diazomethan verestert (2.8.3) und Hydroxygruppen mit Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamid in trockenem Pyridin silyliert. Die Messungen wurden an einem Shimadzu GC/MS QP-2000 System, ausgerüstet mit einer fused silica Kapillare SPB 1 (30 m x 0,32 mm, Beschichtungsdicke 0,25 µm), durchgeführt. Eine Injektor-Temperatur von 270°C, Ionenquellen-Injektor-Temperatur von 180°C und Elektronen-Energie von 70 eV wurden eingestellt. Die Fettsäurederivate wurden mit folgendem Temperaturpro-gramm eluiert: 2 min 180°C isotherm, danach Erhöhung der Temperatur mit einer Rate von 5°C/min bis 290°C, abschließend 5 min isotherm bei 290°C.

Für weiterführende Analysen wurden vor der Silylierung der Hydroxygruppen Doppelbin-dungen der Fettsäurederivate hydriert. Dazu wurden 10 µg der Fettsäure in 1 ml Ethanol

mit 5 mg Palladium/Aktivkohle als Katalysator versetzt und anschließend Wasserstoff für zwei Minuten bei Raumtemperatur hindurchgeleitet. Nach Abfiltrieren des Katalysators wurde das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in 20 µl Dodekan aufgenommen.

2.4.3 Proteinbestimmung

Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurde das Roti-Quant System (Roth, Karlsru-he), basierend auf der Methode nach Bradford, verwendet. Für die Eichung wurden verschiedene BSA-Konzentrationen im Bereich von 1 mg/ml bis 8 mg/ml verwendet.

2.4.4 Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Für SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophoresen (SDS-PAGE) wurde die Methode nach Laemmli angewandt (Laemmli, 1970). Es wurden 10% Mini-Gele verwendet und die Elektrophorese bei 27-30 mA durchgeführt. Anschließend erfolgte die Färbung der Proteine mit Coomassie und Trocknung des Gels oder ein Western Blot.

2.4.5 Western Blot

Proteine wurden nach Auftrennung über die SDS-PAGE auf eine Nitrozellulose-Membran nach der semi-dry Methode geblottet (1 h, 10 V). Der Blot wurde mit 5% Magermilch in PBS/0,1% TWEEN-20 blockiert und mit dem ersten Antikörper inkubiert (1 h). Nach intensivem Waschen mit PBS/TWEEN kam als zweiter Antikörper ein Peroxidase-Konjugat zum Einsatz (Inkubationszeit 1 h). Der Blot wurde nach erneutem intensiven Waschen mit PBS/TWEEN mit dem Western-Lightning Chemilumineszenz Plus Reagenz behandelt und zwischen 1 s und 20 s auf einen Röntgenfilm (Kodak) gelegt. Für eine quantitative Auswertung wurde die Intensität der Banden auf dem Röntgenfilm unter Ver-wendung des Programms Phoretix 1D (Phoretix International, Newcastle, Großbritannien) densitometrisch bestimmt.

2.5 Bestimmung von Enzymeigenschaften