Ausblick

T. gondii besitzt ein Plastid-ähnliches Organell, den Apicoplasten, in welchem sich das darin einzig bekannte Redoxsystem, bestehend aus der Ferredoxin-NADP⁺-Reduktase und Ferredoxin (Fd), befindet. Das Ferredoxin-Redoxsystem nimmt eine zentrale Rolle im Metabolismus des Apicoplasten ein; so liefert Fd als Elektonendonator an mindestens zwei essentielle Stoffwechselwege Elektronen: Zum einen, wie in dieser Arbeit gezeigt, an LipA, ein Enzym der Liponsäuresynthese (Frohnecke et al. 2015), und zum anderen an die Isoprenoidsynthese, was in der Vergangenheit bereits für P. falciparum gezeigt werden konnte (Rohrich et al. 2005).

Die im Rahmen dieser Arbeit mit Hilfe des bakteriellen Reverse Two-Hybrid Systems (RTHS) nachgewiesene Interaktion von Fd und LipA belegt eine direkte PPI, die für eine Elektronenübertragung nötig ist (Frohnecke et al. 2015). Das für Fd und LipA verwendete RTH System ermöglicht neben dem Nachweis der Interaktion eine Kombination mit einer zyklischen Peptidbank (SICLOPPS), wodurch ein Dissoziator der Interaktion entwickelt werden kann (siehe 5.1.2, Horswill et al. 2004). Nach erfolgreicher Optimierung des Selektionsmediums für stringente Screeningbedingungen (siehe 4.1.3) steht der generierte Fd-LipA RTHS-Stamm zur Kombination mit einer zyklischen Peptidbank zur Verfügung.

Nach der Durchführung mehrerer Screeningrunden können Inhibitoren identifiziert und die Peptidsequenz der Inhibitoren ermittelt werden (Horswill und Benkovic 2006). Das Ausmaß der Inhibition kann, nachdem die Struktur der Dissoziatoren bekannt ist und die Peptide in ausreichender Menge nach Expression oder chemischer Synthese vorliegen, anhand analytischer Gelfiltration mit den gereinigten Proteinen Fd und LipA untersucht werden (Rohrich et al. 2005). Um die Auswirkungen der Inhibition von Fd und LipA zu analysieren und mit denen des Fd Knockdowns zu vergleichen, ist es u.a. von besonderem Interesse den Dissoziator direkt in T. gondii zu exprimieren. Adriana Preiß hat in der von mir betreuten Masterarbeit bereits die Split-Intein-Chemie, die zur Zyklisierung der Peptide verwendet wird, in T. gondii eingebracht und so die Apicoplasten-Lokalisation eines zyklischen YFP nachgewiesen (Preiß 2014). Im Gegensatz zur Fd Knockdown Mutante wäre bei der Inhibition der Fd-LipA-Interaktion, sofern der Dissoziator spezifisch ist, nur ein Stoffwechselweg betroffen und es somit möglich, die Auswirkungen auf diesen gesondert

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untersuchen zu können. Inwiefern ein potentieller Wirkstoff mit einem Target im Apicoplasten, wie dem Ferredoxin-Redoxsystem, die Wirtszellmembran, die Membran der parasitophoren Vakuole, die Parasitenmembran und schließlich die vier den Apicoplasten umgebenden Membranen überwinden kann, muss durch geeignete Untersuchungen gezeigt werden. Jedoch sind bereits verschiedene Substanzen bekannt, die mit dem Target Apicoplast Wirkungen auf Apicomplexa zeigten (Wiesner und Seeber 2005). Darunter befindet sich das natürliche, makrozyklische Peptid Thiostrepton mit einer Größe von 1289 Da, was ungefähr 11-12 Aminosäuren entspricht und welches inhibitorische Effekte auf den Apicoplasten zeigte (Clough et al. 1999).

Neben den Interaktionsanalysen mit Hilfe des bakteriellen RTHS wurde zudem überprüft, ob Fd - als Bestandteil des voraussichtlich einzig vohandenen, zentralen Redoxsystems des Apicoplasten - essentiell für das Überleben von T. gondii ist bzw. welche Auswirkungen eine Herabregulation der Fd-Expression auf T. gondii hat (siehe 5.2). Zur Überprüfung dieser These ist zum einen das DiCre Knockout-System zum Einsatz gekommen (Andenmatten et al.

2013) und zum anderen das Tet-induzierbare Knockdown-System (Meissner et al. 2002).

Das DiCre Knockout-System zur Exzision von Fd wurde erfolgreich etabliert, jedoch konnte trotz verschiedener Analysen nicht zweifelsfrei die Fd Exzision und somit auch die Folgen eines Fd Knockouts gezeigt werden (siehe 4.2). Hingegen konnten mittels des ebenfalls erfolgreich generierten Fd Knockdowns verschiedene Assays zur Ermittlung der Aus-wirkungen einer Fd Herabregulation angefertigt werden (siehe 4.3). Es zeigten sich u.a.

drastische Konsequenzen auf das Wachstum der Parasiten, jedoch stellte sich Fd bei Verwendung des Tet-induzierbaren Systems widererwartend als nicht essentiell dar. Dies ist zum einen möglicherweise in einem ungenügend reprimierten Promoter und/oder zum anderen in gegenregulierenden retrograden Signalkaskaden begründet (siehe 5.2). Um eine verbleibende Restaktivität des Promoters zu überprüfen und somit geringe Mengen an exprimierten Fd zu detektieren, ist es zwingend erforderlich, wie in 5.2 beschrieben, eine RT-PCR durchzuführen. Das Knockdown-System eignet sich hervorragend dazu Auswirkungen einer Fd Herabregulation zu ermitteln. So kann der Fd Knockdown-Stamm dazu verwendet werden die mögliche Akkumulation der Intermediärmetabolite der Isoprenoidsynthese, wie insbesondere MEcPP – als potentieller Auslöser einer retrograden Signalkaskade (siehe 5.2.2.3), zu untersuchen. Durch Kopplung der Festphasenextraktion (SPE - solid phase extraction) und der UHPLC-MS (Ultra High Performance Liquid Chromatograph-Massenspektrometrie) ist es Zhou et al. 2012 gelungen die

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Zwischenprodukte der Isoprenoidsynthese von E. coli Extrakten zu quantifizieren, was ebenso für T. gondii Extrakte des Fd Knockdown-Stammes interessant wäre.

Um weitere Auswirkungen der Fd Herabregulation auf die Fettsäuresynthese zu untersuchen, kann mit Hilfe der thin layer chromatography nach Saponifikation der entsprechenden Proben die zellulären Fettsäuren bestimmt werden (Ramakrishnan et al. 2015). Mit dieser Methode ist es zudem möglich Dolichole zu detektieren, dessen Gehalt nach Herabregulation der Isoprenoidsynthese erniedrigt ist (Vortrag B. Striepen „Using genetics to study Toxoplasma and Cryptosporidium“, International Congress of Coccidiosis 2014, Dresden).

Welche Konsequenzen eine Fd Defizienz auf eine T. gondii-Infektion hat, kann durch die Infektion von Mäusen mit dem Fd Knockdown-Stamm bestimmt werden (Huynh und Carruthers 2006, Mazumdar et al. 2006). Dabei wird die Zeitspanne bis zur lethalen Wirkung einer T. gondii-Infektion nach Fd Herabregulation (ATc-Gabe über das Trinkwasser) im Vergleich zum nicht-induzierten bzw. parentalen Stamm ermittelt. Aufgrund der festgestellten Wachstumsinhibition der Fd Knockdown Mutante in vitro wird erwartet, dass sich der Knockdown als weniger virulent erweist.

Mit den in dieser Arbeit verwendeten Fd Knockdown und Knockout Systemen konnten verschiedene Auswirkungen einer Fd Defizienz ermittelt werden, jedoch beherbergt jedes dieser Systeme unterschiedliche Limitationen, die in 5.2 aufgeführt sind. Eine weitere Alternative zur Elimination des Fd-Gens stellt das CRISPR/Cas9-System dar (Ishino et al.

1987, Jansen et al. 2002). Dieses hat bereits vielfach zur Modulation von DNA-Sequenzen eukaryotischer Zellen Anwendung gefunden (zusammengefasst in Mali et al. 2013, Sampson und Weiss 2014) und wurde zudem erfolgreich in T. gondii etabliert (Shen et al. 2014, Sidik et al. 2014). Mit Hilfe des CRISPR/Cas9-Systems werden Doppelstrangbrüche mit einer small guide RNA (sgRNA) an gewünschter Stelle im Genom vorgenommen, die durch den NHEJ pathway - meist fehlerhaft - wieder zusammengefügt werden, so dass das entsprechende Gen zerstört wird (Sampson und Weiss 2014). Ein großer Vorteil dieser Methode ist, dass das Genom direkt bearbeitet werden kann und keine vorherige Generation von Konstrukten mit endogenen DNA-Abschnitten notwendig ist (Jimenez-Ruiz et al. 2014). Die Arbeitsgruppe von S. Lourido (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA, USA) untersuchte bereits in einem Screen mit Hilfe des CRISPR/Cas9-Systems das T. gondii Genom unter Verwendung einer sgRNA-Bank, die sämtliche ~8200 Gene des Parasiten umfasste. Dabei wurde eine Vielzahl von Genen ermittelt, die sich als essentiell für T. gondii erwiesen haben, darunter auch Fd (Sidik et al. 2016). So dass ein effizientes Fd Knockout-System, wie das CRISPR/Cas9-System einen robusten Phänotyp zeigen sollte.

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