ATc-Induktion verursacht eine verlangsamte Replikation des Fd ikd-Stammes86

Fd Knockdown Mutante festgestellt werden (siehe 4.3.3). Um den Replikationsprozess des Fd ikd-Stammes während des in Abb. 25A dargestellten lytischen Zyklus unter ATc-Behandlung zu beschreiben, wurde die Verdopplungszahl der Parasiten innerhalb der parasitophoren Vakuole während des ersten, zweiten und dritten lytischen Zyklus ermittelt.

Bei Behandlung mit Ciprofloxacin, Clindamycin oder Chloramphenicol (CAM) zeigt T. gondii einen sogenannten delayed death-Phänotyp, bei dem die Verdopplungszahl im ersten Zyklus unverändert bleibt; ab dem zweiten lytischen Zyklus beginnt diese sich jedoch zu reduzieren bis die Parasiten schließlich in den folgenden Zyklen absterben (siehe Abb. 25B, Kim et al. 1993, Fichera et al. 1995, Fichera und Roos 1997). Da es zu klären gilt, ob eine Herabregulation der Fd-Expression einen delayed death-Phänotyp verursacht, wurde der Fd ikd-Stamm zudem zur Kontrolle mit CAM behandelt. Zur Bestimmung der Verdopplungszahl wurden die Parasiten nach jedem Zyklus (alle 48 h) mechanisch vereinzelt und für jeden weiteren Zyklus zur Infektion zu neuen Wirtszellen mit der entsprechenden Behandlung gegeben. Während der jeweiligen Zyklen wurde alle 12 h die Anzahl der Parasiten pro Vakuole pro Bedingung von mindestens 50 parasitophoren Vakuolen bestimmt.

Die Behandlung des Fd ikd-Stammes mit Pyrimethamin als letale Wirkstoff-Kontrolle führte bereits im ersten Zyklus zum Absterben der Parasiten (Daten nicht gezeigt).

Abb. 25: Lytischer Zyklus und delayed death-Phänotyp von T. gondii

A Schematische Darstellung des lytischen Zyklus von T gondii. Ein Parasit invadiert eine Zelle, repliziert sich in dieser und tritt schließlich nach 48-56 h durch Wirtszelllyse aus dieser wieder heraus (1. Zyklus). Die freigesetzten Parasiten können erneut Zellen infizieren und der Zyklus beginnt von neuem (2. Zyklus). Abb.

verändert entnommen von https://www2.bc.edu/~gubbelsj/Toxoplasma.html, 12.05.2015, 12.15 Uhr. B Verlauf der Graphen bei delayed death-Phänotyp. Die Behandlung von T gondii mit Clindamycin (aber auch Chloramphenicol) führt ab dem zweiten lytischen Zyklus im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle zu einer reduzierten Verdopplung der Parasiten; in den weiteren 2-3 Zyklen schließlich zum Absterben der Parasiten.

Abb. verändert entnommen von Fichera et al. 1995.

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Es stellte sich heraus, dass die ermittelten Verdopplungszahlen für jeden Zeitpunkt des ATc-behandelten parentalen als auch des Fd ikd kompl.-Stammes in allen Zyklen zu denen ohne ATc-Induktion vergleichbar waren, weshalb in den Graphen neben der Fd Knockdown Mutante lediglich die Verdopplungszahlen des ATc-induzierten Fd ikd kompl.-Stammes zum Vergleich aufgetragen sind (siehe Abb. 26). Der Fd ikd-Stamm zeigte ohne Induktion in allen ermittelten Zyklen ein ähnlichen Verlauf der Graphen, also eine vergleichbare Replikationsrate, wie der des komplementierten Fd ikd-Stammes (siehe Abb. 26). So verdoppelte sich die Parasitenzahl pro Vakuole ungefähr alle 8 h bis die Parasiten nach 48-56 h die Wirtszelle lysierten. Dies geschah ab einer Parasitenanzahl von 64 (2⁶) – 128 (2⁷), selten bei 256 (2⁸), was in den Aufnahmen durch extrazelluläre Tachyzoiten erkennbar war.

Unter ATc-Behandlung hat sich die Verdopplung der Parasiten des Fd ikd-Stammes innerhalb des ersten Zyklus lediglich nach 48 h unwesentlich verringert (nicht signifikant, siehe Abb. 26, 1. Zyklus). Im zweiten Zyklus unter ATc-Behandlung ist eine Verlangsamung der Verdopplung des Fd ikd-Stammes bereits nach 36 h auszumachen, jedoch auch hier noch nicht signifikant. Nach 48 h war die Replikationsrate hingegen um 9 % signifikant verringert im Vergleich zum unbehandelten Fd ikd-Stamm (siehe Abb. 26, 2. Zyklus). Während des dritten Zyklus unter ATc-Induktion wies der Fd ikd-Stamm bereits nach 24 h eine signifikant um 26 % geringere Parasiten-Verdopplung im Vergleich zum unbehandelten Fd ikd-Stamm auf. Nach 36 h betrug die Verlangsamung der Replikationsrate knapp 15 % und stieg nach 48 h auf 37 % im Vergleich zum unbehandelten Fd ikd-Stamm an. Die Anzahl der Parasiten pro Vakuole blieb nach 36 h und 48 h annähernd konstant (siehe Abb. 26, 3. Zyklus).

Der mit CAM als delayed death-Phänotyp Kontrolle behandelte Fd ikd-Stamm zeigte im ersten Zyklus, wie erwartet, keine Verringerung der Verdopplungszahl (siehe Abb. 26, 1. Zyklus). Im zweiten Zyklus ab 36 h war eine um 24 % signifikant reduzierte Replikationsrate im Vergleich zum unbehandelten Fd ikd-Stamm auszumachen, die nach 48 h weiterhin reduziert blieb (28 %, siehe Abb. 26, 2. Zyklus). Die CAM behandelten Parasiten des Fd ikd-Stammes zeigten im dritten Zyklus nach 24 h eine um 30 % signifikante Reduktion der Verdopplungsrate, sowohl nach 36 h als auch nach 48 h war diese mit 42 % und 57 % im Vergleich zum ATc-behandelten Fd ikd-Stamm weiter verringert (siehe Abb. 26, 3. Zyklus).

Die durch ATc-Induktion bewirkte Herabregulation von Fd verursachte ab dem zweiten Zyklus eine leicht verlangsamte Replikation (9 %), ab dem dritten Zyklus setzt diese bereits früher ein und ist mit bis zu 37 % stärker ausgeprägt. Dass eine Auswirkung auf die Replikation erst ab dem zweiten Zyklus zu beobachten ist, steht im Einklang mit dem erst nach 48 h ausbleibenden Fd Myc-Signal in Immunfluoreszenz-mikroskopischen Aufnahmen

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Abb. 26: Der Fd ikd-Stamm zeigt ab dem dritten Zyklus unter ATc-Behandlung eine deutlich verringerte Replikation

Die Bestimmung der Parasitenzahl pro Vakuole wurde für die jeweiligen Stämme (Fd ikd, Fd ikd kompl.) und Bedingungen (unbehandelt, ATc- oder CAM-Behandlung) alle 12 h vorgenommen. Der Mittelwert und die Standardabweichung der Parasiten-Verdopplung (log2) ist gegen die Zeit für die Stämme Fd ikd (unbehandelt, +ATc, +CAM) sowie Fd ikd kompl. (+ATc) aufgetragen. Die Anzahl der Parasiten-Verdopplung nach der Infektion mit den Tachyzoiten-Stämmen wurde als log2 (Parasitenanzahl/Vakuole) angegeben, da sich die Tachyzoiten innerhalb einer Vakuole synchron replizieren (Fichera et al. 1995). Der Mittelwert und die Standardabweichung wurden für jeden Zeitpunkt und jeden Stamm aus mindestens 50 parasitophoren Vakuolen zufällig gewählter Bildausschnitte berechnet. Die statistische Auswertung erfolgte auf Grundlage einer Two-way ANOVA-Analyse mit anschließendem Bonferroni-Test (** P ≤ 0,01; **** P ≤ 0,0001; ohne weitere Angabe entspricht „nicht signifikant“)

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(siehe 4.3.2). Die delayed death-Phänotyp Kontrolle (CAM-Behandlung) zeigte insgesamt eine stärkere Reduktion der Replikationssrate auf. Zudem wirkten die Parasiten im dritten Zyklus unter diesen Bedingungen im Vergleich zu den ATc-induzierten Parasiten in den Aufnahmen merklich beeinträchtigt: Die parasitophoren Vakuolen waren kleiner und die Parasiten selbst hatten zudem eine kleinere, abnorme Form (Daten nicht gezeigt). Demnach verursacht eine Fd-Repression keinen delayed death-Phänotyp, jedoch eine reduzierte Replikationssrate der Parasiten insbesondere nach fünftägiger ATc-Induktion.

Lichtmikroskopisch konnte keine morphologische Änderung der Fd Knockdown Mutante ausgemacht werden, was im Folgenden durch Elektronenmikroskopische Aufnahmen näher untersucht wurde.

4.3.5 Verringerte Motilität als Folge einer beeinträchtigten Isoprenoidsynthese der Fd Knockdown Mutante

Wie in 1.2.2 beschrieben, besteht eine direkte Verbindung des Ferredoxin-Redoxsystems zur Isoprenoidsynthese: So fungiert Fd zumindest in P. falciparum als Elektronendonator in den letzten beiden Syntheseschritten der Isoprenoidvorstufen und liefert Elektronen an LytB und voraussichtlich GcpE (Rohrich et al. 2005). Kürzlich wurde festgestellt, dass das Ausbleiben der Isoprenoidsynthese zu einer massiven Beeinträchtigung der Motilität von T. gondii führt, was die Folge des Verlusts der N-Glykosylierung des GAP50-Proteins sein soll (Vortrag B. Striepen „Using genetics to study Toxoplasma and Cryptosporidium“, International Congress of Coccidiosis 2014, Dresden). Das N-glykosylierte GAP50-Protein ist eine wichtige Komponente des Multiprotein-Komplexes der Gleit-Fortbewegung und somit verantwortlich für eine einwandfreie Motilität von T. gondii (Fauquenoy et al. 2011). Ob die Fd Knockdown Mutante nach ATc-Induktion und somit der Fd Herabregulation eine verringerte Motilität zeigt, die neben der festgestellten verlangsamten Replikation zu kleineren Plaques im Plaqueassay geführt haben könnte, soll mit Hilfe eines Motilitätsassay ermittelt werden. T. gondii hinterlässt bei der Fortbewegung eine Spur aus sekretierten Oberflächenprotein SAG1 (Hakansson et al. 1999), welches mit einem α-SAG1-Antikörper (DG52) angefärbt werden kann. Im Anschluss wurden die Aufnahmen verblindet und die Spuren vermessen. Da das das Signal des Myc-markierten Fd erst nach 48 h ATc-Induktion nicht mehr nachweisbar war und die Replikation insbesondere nach 4 d ATc-Behandlung reduziert war (siehe 4.3.2 und 4.3.4), wurden der Fd ikd-, der Fd ikd kompl.- sowie der parentale Stamm einer viertägigen Vorbehandlung mit ATc unterzogen. Alle Stämme wurden zudem ohne Behandlung untersucht. Es stellte sich heraus, dass sowohl die unbehandelten

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(Fd ikd, Fd ikd kompl., parental) als auch der ATc-induzierte parentale und komplementierte Fd ikd-Stamm einen vergleichbaren Median der Spurlänge zeigten. In Abb. 27A sind daher nur die erhaltenen Werte der Spurlängen aller Stämme nach ATc-Behandlung (4 d) dargestellt.

Der Fd ikd-Stamm zeigte nach 4 d ATc-Induktion einen um etwa 20 % reduzierten Median der Spurlänge im Vergleich zum parentalen und auch zum Fd ikd kompl.-Stamm (Abb. 27A).

Beispielhaft sind Aufnahmen der vermessenen Spuren aller induzierten Stämme in Abb. 27B dargestellt; diese ließen ohne Vermessung keinen Schluss auf eine mögliche Verkürzung der Spuren der Fd Knockdown Mutante zu.

Die Bestimmung der Motilität durch Vermessen der Spuren des Fd ikd-Stammes zeigte einen um 20 % reduzierten Median der Spurlänge im Vergleich zum komplementierten Fd ikd- und parentalen Stamm. Demnach scheint die Herabregulation der Fd-Expression zu einer verringerten N-Glykosylierung des GAP50-Proteins durch einen Einfluss auf die Isoprenoidvorstufen-Synthese geführt zu haben, was sich in einer verkürzten Spurlänge niederschlug.

Abb. 27: Ein Fd Knockdown führt zu einer verringerten Motilität

A Der Motilitätsassay der Stämme (parental, Fd ikd kompl., Fd ikd) wurde nach 4 d ATc-Vorbehandlung durchgeführt. Die Spuren wurden mit einem α-SAG1-Antikörper 1:1000 (Ziege-α-Maus Alexa Fluor® 546, 1:4000) angefärbt und am Zeiss Axio Imager Z1/Apotome detektiert. Aufgetragen ist der Median der mit dem NeuronJ ermittelten Länge von mindestens 500 Spuren der ATc-vorbehandelten Stämme. Die mit Hilfe des Plugins Macro for Blind Analyses verblindeten Daten wurden aus drei biologischen Replikaten erhoben und sind als Box Plot mit Tukey-Style Whiskers dargestellt. Die statistische Auswertung erfolgte auf Grundlage einer One-way ANOVA-Analyse mit dem Kruskal-Wallis Test (** P ≤ 0,01; ns nicht signifikant) B Aufnahmen der gemessenen Spuren von jeweils beispielhaft einem Parasiten der Stämme (parental, Fd ikd, Fd ikd kompl.) nach viertägiger ATc-Induktion. (Maßstabsbalken 5 µm)

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4.3.6 Der Fd ikd-Stamm zeigt nach ATc-Induktion einen Mangel der im Apicolasten