Auch ApsB ist ein peroxysomales Protein

Analog zu HexA wurde auch für ApsB ein Stamm durch Transformation von TALX207-10 mit dem Plasmid pDV42a (alcA(p)::mRFP1::apsB^3.2) erzeugt (SDV70b). Dieser Stamm enthält grün gefärbte Peroxysomen (GFP-AcuE) und rotes ApsB (mRFP1-ApsB), das mit AcuE colokalisiert werden konnte (Abb. III. 26 B). Demnach handelt es sich bei ApsB um ein in Peroxysomen lokalisiertes Protein. Allerdings war die Frequenz der Colokalisierung deutlich geringer als bei HexA.

Hier betrug die Colokalisierung 14%. Das ist aber zumindest in soweit verständlich, als daß es in der Zelle ApsB Proteine geben muß, die sicherlich nicht von einer peroxysomalen Membran umgeben sind, wie beispielsweise die Spindelpolkörper an den Kernen und an den Mitosespindeln (vgl.Abb. III.

02).

Welche weiteren Hinweise gibt es, daß ApsB ein peroxysomales Protein ist? Zunächst wurde überprüft, ob ApsB auch eine für solche Proteine typische peroxysomale Zielsequenz enthält. Dazu wurde seine Proteinsequenz mit dem Computerprogramm "PSORT" analysiert (http://psort.hgc.jp/).

Tatsächlich konnte für ApsB eine peroxysomale Zielsequenz an Position 66 bis 74 gefunden werden:

"KIRDLEKQL". Dabei handelt es sich allerdings um eine "Typ 2" und nicht wie bei HexA um eine "Typ 1" Sequenz. Zur weiteren Bekräftigung wurden die nach Sawin et al. (2004) definierten zu ApsB schwach homologen Proteine ebenfalls untersucht. Bei sechs der acht Proteine fand sich ebenfalls eine peroxysomale Zielsequenz vom Typ 2 (S. pombe_mod20_NP588284;S. pombe_pcp1p_Q92351;

N. crassa_NCU02332.1_XP331108; N. crassa_NCU02411.1_XP331187; D. rerio_AAH46878; H.

sapiens_CDK5RAP2_Q96SN8). Die Zielsequenzen sind jedoch nicht stark konserviert, da sie voneinander abweichende Sequenzen haben und sich an unterschiedlicher Position im Protein befinden. Auf Grund der ohnehin geringen Sequenzidentität zu ApsB ist das aber nicht verwunderlich.

Abbildung III. 27

HexA und ApsB an den Septen.

(A) Die Woronin Körper (hier vonN.

crassa) sind noch von einer einfachen peroxysomalen Membran umgeben (Pfeil). Die Abbildung wurde entnommen aus Yuan et al.

(2003). Der Größenmaßstab beträgt 100 nm. (B) Im Stamm SDV49-4 erkennt man, daß sich der Woronin Körper (GFP-HexA) in direkter Nachbarschaft zu mRFP1-ApsB befindet, aber offenbar nicht exakt colokalisiert. Beide Proteine lokalisieren unabhängig voneinander am Septum als zwei verschiedenen Strukturen, die zudem noch durch eine Membran getrennt sind, so wie in(C)schematisch dargestellt ist.

Ein weiterer Hinweis auf eine peroxysomale Beziehung ist die Ähnlichkeit in den Dynamiken des Transportes von ApsB und den Peroxysomen entlang der Mikrotubuli. Beide werden mit einer Geschwindigkeit von gemessenen 0,5 µm – 6 µm sec^-1 bidirektional transportiert (wie in Abschnitt III.

1.1.8, Seite 31 beschrieben). Ein Unterschied bestand jedoch darin, daß die Peroxysomen relativ häufig (60% der Gesamtzahl in einer Hyphen) eine Bewegung ausführten, während dies bei den ApsB Spots ein ungleich selteneres Ereignis war (5%).

Durch die Entdeckung, daß ApsB dem Anschein nach ebenso wie HexA ein peroxysomales Protein ist, gewinnt die Beobachtung der Interaktion im yeast-two-hybrid Ansatz an Bedeutung.

Allerdings stellt sich die Frage an welchem Ort genau die beiden Proteine miteinander interagieren. An den Septen oder den cytoplasmatischen Peroxysomen? Bei den Septen entsteht ein Problem. Da der Woronin-Körper noch von einer peroxysomalen Membran umgeben und beiderseits eines Septums positioniert ist, ApsB dagegen in der Pore vom Septum lokalisiert, haben die beiden Proteine offenbar keinen Kontakt (weil sie durch die Membran getrennt sind), was eine Protein-Protein Interaktion wie sie im yeast-two-hybrid Ansatz entsteht, an dieser Stelle unwahrscheinlich macht (Abb. III. 27).

Eine solche Interaktion kann nur dann stattfinden, wenn sich die beiden Proteine auf derselben Seite der Membran befinden und nicht durch sie getrennt werden. Entweder haben HexA und ApsB einen Berührungspunkt innerhalb der Peroxysomen, oder sie interagieren schon außerhalb miteinander, bevor sie in das Peroxysom importiert werden, oder sogar gerade während dieses Vorgangs. Um einen genaueren Einblick zu erhalten, wo genau die Interaktion stattfindet, wurde eine Methode benutzt, die es einerseits erlaubt eine Protein-Protein Interaktion nachzuweisen, andererseits aber auch gleichzeitig den Ort der Interaktion in der Zelle angibt. Das ist ein bedeutender Vorteil gegenüber dem yeast-two-hybrid Ansatz, bei dem man in einen anderen Organismus wechseln muß (nämlich in die Hefe) und der Test so ausgelegt ist, daß die Interaktion im Zellkern der Hefe stattfindet.

Man erhält dabei also keinerlei Information über den subzellulären Ort der Interaktion im eigentlich benutzen Organismus (hierA. nidulans). Deswegen wurde der so genannte "bimolecular fluorescence complementation assay" = BiFC benutzt und das entsprechende System im Labor für A. nidulans etabliert.

Abbildung III. 28 Bimolekularer Fluoreszenz Komplementationsansatz (BiFC).

(A) Ein fluoreszierendes Protein ist dadurch besonders, daß es nach Anregung mit Licht bestimmter Wellenlänge (z. B. blau) zur Fluoreszenz (hier grün) angeregt werden kann und dabei keinerlei Cofaktoren benötigt. Da es sich um Proteine handelt, können sie mit anderen Proteinen fusioniert werden und dienen daher als intrazelluläre Marker. (B) Das Kernstück eines fluoreszierenden Proteins besteht aus dem so genannten "Chromophor" (grün) in der Mitte einer coaxialen α-Helix. Er ist umgeben von einem 11 strängigem β-barrel. Der Chromophor besteht aus drei Aminosäuren, die für jedes Fluoreszenzprotein charakteristischen. Im Fall des häufig benutzten und genetisch modifizierten eGFP sind es die Aminosäuren Threonin⁶⁵-Glycin⁶⁶-Tyrosin⁶⁷ (C). (D) Spaltet man ein Fluoreszenzprotein (z. B.

YFP) in eine N-terminale und eine C-terminale Hälfte (YFP^N und YFP^C), und fusioniert jede dieser Hälften mit je einem zu untersuchenden Protein, so kann die Fluoreszenzfähigkeit wieder hergestellt werden, wenn die beiden Proteine z.B. durch Interaktion die YFP-Hälften wieder nahe genug zusammen bringen (D).

Eine ausführliche Beschreibung zu Fluoreszierenden Proteinen findet sich in Veith und Veith (2005), aus der auch die Abbildungen entnommen wurden.

2.1.6 Bimolekularer – Fluoreszenz – Komplementations – Ansatz: "BiFC"

Ursprünglich stammt die Methode von Ghosh et al. (2000) und beruht auf der Entdeckung, daß ein beliebiges fluoreszierendes Protein an einem bestimmten, nicht konservierten und daher für die Funktion nicht wichtigen Bereich in zwei Proteinhälften gespalten werden kann und diese beiden für sich alleine nicht-fluoreszierenden Hälften wieder leuchten, wenn sie nahe genug zusammen gebracht werden (Abb. III. 28). Das ist zum Beispiel dann der Fall, wenn die beiden Hälften mit je einem anderen Protein fusioniert werden und diese beiden Proteine miteinander interagieren oder im selben Proteinkomplex sehr nahe beieinander liegen. Eine solche Protein-Protein Interaktion zwischen zwei verschiedenen Proteinen wurde erstmals von Hu et al. (2002) publiziert und ist inzwischen für Säugetierzellen, Pflanzen, Pilze und Bakterien beschrieben (Blumenstein et al., (2005); Atmakuri et al., (2003); Grinberg et al., (2004); Bracha-Drori et al., (2004); Hynes et al., (2004); Hoff und Kück (2004); Walter et al., (2004)). Der BiFC ist dem yeast-two-hybrid Ansatz in mehrfacher Hinsicht überlegen. So kann das leicht zu detektierende Fluoreszenzsignal ohne Fixierung der Zellen gemessen werden. Aus diesem Grund ist es daher auch möglich die Studien in lebenden Zellen durchzuführen. Die entscheidenden Vorteile liegen aber darin, daß man die Untersuchungen in dem Organismus durchführen kann, mit dem man gerade arbeitet, und nicht zum Hefesystem wechseln muß. Außerdem wird damit gleichzeitig die Möglichkeit gegeben den genauen Ort der Interaktion innerhalb der lebenden Zelle festzustellen, so daß sogar noch weitere Studien in vivo (etwa Zeitrafferstudien) durchgeführt werden können. Darüber hinaus wurde auch gezeigt, daß die Hälften von unterschiedlichen fluoreszierenden Proteinen wie GFP (grün), BFP (blau), CFP (cyan) oder YFP (gelb) miteinander kombiniert werden können, so daß sogar noch neue Farbvariationen entstehen, die Mehrfachmarkierungen innerhalb einer Zelle mit mehreren Proteinen ermöglichen (Hu und Kerppola (2003).

Zur Etablierung des BiFC Systems wurde das eYFP Gen von Clontech benutzt. eYFP besteht aus 720 Basenpaaren (Startcodon bis Stopcodon) also 239 Aminosäuren (717 bp) und enthält kein Intron. Zur Aufteilung des eYFP muß es an einer Stelle im Protein gespalten werden, die für die Funktion nicht wichtig ist. Eine solche Stelle ist daher innerhalb der fluoreszierenden Proteine nicht stark konserviert. Nach Hu und Kerppola (2003) gibt es einige wenige solcher Stellen, beispielsweise and den Aminosäurepositionen 155 oder 173. Für die Wahl einer der beiden Positionen spielte es eine Rolle, daß die zu produzierenden eYFP Hälften in den Vektor pMCB17apx (Abb. III. 01, Seite 20) eingebaut werden sollte, also die zukünftigen mit dem BiFC zu untersuchenden Proteine N-terminal mit jeweils einer der beiden Hälften fusioniert werden würden. Dabei galt es zu berücksichtigen, daß die beiden Hälften also jeweils ein eigenes Startcodon benötigten, aber keiner ein Stopcodon haben durfte, da sonst das dahinter liegende Gen nicht mehr translatiert werden würde. Die zu erstellenden N-terminale Hälfte des eYFP (YFP^N) besaß durch das normale Startcodon des eYFP schon ein eigenes Startcodon und kein Stopcodon. Hier musste also bei der Erstellung der Primer nichts berücksichtigt werden. Die C-terminale Hälfte des eYFP (YFP^C) jedoch besaß allerdings kein Startcodon und dazu noch das normale Stopcodon des eYFP, welches bei der Erstellung der Primer nicht mit eingebaut werden durfte. Um es für YFP^C leichter mit dem Startcodon zu machen, wurde das eYFP genau an der Aminosäureposition 154 gespalten, wo sich nämlich zufällig ein ATG (Methionin) befindet, daß für YFP^C als Startcodon dienen sollte. Außerdem musste in den Vorwärtsprimern die Schnittstelle für das Restriktionsenzym KpnI eingebaut werden und bei den Rückwärtsprimer eine AscI Schnittstelle sowie zusätzlich ein Proteinlinker. Diese zusätzlich eingefügten Aminosäuren der Linker dienen dazu eine art flexibles Gelenk zwischen den eYFP Hälften und den fusionierten Proteinen zu erstellen, damit diese beim Annäherungsprozess der interagierenden Proteine auch wirklich die beiden eYFP Hälften nahe zusammenbringen. Damit ist klar, daß YFP^Netwas größer ist als YFP^C und daß YFP^N den für das Fluoreszenzleuchten wichtigen Chromophor enthält (Abb. III. 29).

Als Primer für die Amplifikation von YFP^N wurden "fwd_Kpn_YFP-N" und "rev_YFP-N_Li_Asc" sowie für die Amplifikation von YFP^C "fwd_Kpn_YFP-C" und "rev_YFP-C_Li_Asc" benutzt. Nach der PCR entstanden zwei Fragmente der Größe ~490 bp (YFP^N + Linker + Schnittstellen) bzw. 320 bp (YFP^C + Linker + Schnittstellen). Diese Fragmente wurden erst in den Topo-Vektor zwischenkloniert, anschließend mitKpnI undAscI ausgeschnitten und in den Vektor pMCB17apx-apsB ligiert (pDV7 &

pDV8). Danach wurde die Richtigkeit der vollständigen Sequenz durch kommerzielle Sequenzierung (MWG, Ebersberg, Germany) bestätigt. Diese beiden Vektoren enthalten noch 1,5 kb von apsB als Kontrolle für Restriktionsverdaue. Von hier ausgehend wurden alle Gene der zu untersuchenden Proteine, beispielsweise 3,2 kb von apsB und 680 bphexA, mit KpnI und AscI einkloniert, wobei auf die Einhaltung des Leserasters geachtet wurde:

3,2 kb vonapsB (pDV21a) in pDV7 alcA(p)::YFP^N::apsB^3.2 (pDV22b) 3,2 kb vonapsB (pDV21a) in pDV8 alcA(p)::YFP^C::apsB^3.2 (pDV23a) 680 bp vonhexA(pDV15) in pDV8 alcA(p)::YFP^C::hexA⁶⁸⁰ (pDV17) 1.0 kb vonhexA(pDV18) in pDV7 alcA(p)::YFP^N::hexA^1.0 (pDV19a) 1.0 kb vonhexA(pDV18) in pDV8 alcA(p)::YFP^C::hexA^1.0 (pDV20b)

Für den BiFC Ansatz wurden folgende Plasmide in GR5 cotransformiert:

a) pDV17 + pDV22b YFP^N-ApsB^3.2 +YFP^C-HexA⁶⁸⁰ Stamm: SDV42 b) pDV19a + pDV23a YFP^C-ApsB^3.2+YFP^N-HexA^1.0 Stamm: SDV43 c) pDV22b + pDV20b YFP^N-ApsB^3.2 +YFP^C-HexA^1.0 Stamm: SDV48

Als Kontrolle wurden auch die einzelnen Plasmide mit YFP^N in GR5 transformiert. Außerdem wurde eine Kombination von HexA mit einem Protein (Phytochrom Photorezeptor: FphA; siehe Blumenstein et al., 2005), das keine Interaktion mit HexA zeigen sollte, transformiert (YFP^N-HexA + YFP^C-FphA (SDV45b) bzw. YFP^N-FphA + YFP^C-HexA (SDV46a)). Einzelne Plasmide mit YFP^C Hälften wurden nicht transformiert, da angenommen wurde daß sie ohne den Chromophor gar nicht leuchten können.

Während keine dieser Kontrollen ein Fluoreszenzsignal zeigte, konnte beim BiFC Interaktionstest zwischen ApsB und HexA ein charakteristisches Fluoreszenzsignal in Form von cytoplasmatischen Spots dokumentiert und sogar der Ort der Interaktion bestimmt werden.

A

[ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTT CAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCG TGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGAC TTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGC CGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGG GGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATC{ATG]GCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACT TCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCC GTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCT GCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG}TAA

B

ggtacc[ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCC ACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAG CTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCA GCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGA CCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAAC ATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATG]cgctccatcgccacgGGCGCGCC

C

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D

Abbildung III. 29

Spaltung des eYFP in eine N- und eine C-terminale Hälfte.

(A)Offener Leserahmen von eYFP. Startcodon und Stopcodon sind eingezeichnet, ebenso wie der aus drei Aminosäuren (Glycin-Tyrosin-Glycin) bestehende Chromophor. Mit Hilfe einer PstI Schnittstelle kann eYFP von eGFP leicht unterschieden werden. An Aminosäureposition 154 wurde eYFP gespalten und das ATG als Startcodon für die C-terminale Hälfte benutzt. Die [eckige Klammer] gibt die Sequenz von YFP^N an, und die {geschwungene Klammer} die Sequenz von YFP^C. Das ATG war der Überschneidungspunkt.(B, C) Beide YFP Hälften mit Angabe der Restriktionsschnittstellen KpnI undAscI (unterstrichen) sowie der angefügten Linkersequenzen. Die beiden Fragmente haben jeder ein Startcodon, aber kein Stopcodon.(D) Darstellung von eYFP und der beiden Hälften. eYFP besteht aus 720 bp die für 239 Aminosäuren codieren. Startcodon, Stopcodon, Chromophor sowie ATG an Position 154 sind eingezeichnet. YFP^N besteht aus 462 bp (bzw. 477 wenn derLinker mitgezählt wird) also 154 (159) Aminosäuren. Im fertigen Vektor befindet sich vor derKpnI Schnittstelle deralcA-Promotor und hinterAscI das jeweilige zu untersuchende Gen. Gleiches gilt für YFP^C, das aus 258 bp (309 bp) mit 86 (103) Aminosäuren besteht und einen längerenLinker besitzt.