3.6.1 Isolierung und Quantifizierung von RNA
Um den Expressionszustand der uns interessierenden Zielgene zu bestimmen, musste zunächst die RNA isoliert werden. Dafür wurden die in -80 °C gelagerten Proben auf Eis
4 Ergebnisse 34 aufgetaut. Um die Degradierung von RNA durch RNAsen zu verhindern, fanden alle Arbeiten unter RNAse-freien Bedingungen statt (entsprechendes Verbrauchsmaterial, Behandlung der Arbeitsflächen mit RNAse-Zap).
Zur Aufreinigung der Proben und Trennung von RNA und Proteinen wurde das AllPrep RNA/Protein Kit in Kombination mit dem QiaCube-Roboter gemäß der Herstelleranleitung verwendet. Dieses Kit beinhaltet eine Entfernung von DNA. Am Ende wurden die isolierten Proben auf Eis gelagert, um das Risiko einer enzymatischen Degradierung zu minimieren. Die Quantifizierung erfolgte mit einem BioPhotometer und einer speziellen Küvette für Mikrovolumina (LabelGuard). Dazu wurde ein Probenvolumen von 3 µl auf die Messzelle aufgetragen. Über Absorption bei 260 nm wurde der Nukleinsäure-Gehalt bestimmt. Dabei entspricht eine Extinktion von 1 bei 260 nm einer RNA-Konzentration von 40 µg/ml. Die Konzentration der Proteine wurde auf gleiche Weise bei ihrem Absorptionsmaximum von 280 nm bestimmt. Der Reinheitsgrad der RNA kann durch den Quotienten von 260/280 nm abgeschätzt werden, welcher zwischen 1,8 und 2,3 liegen sollte. Nach jeder Messung erfolgte die Reinigung der Messzelle. Als Leerwert diente die Absorption von doppelt destilliertem Wasser. Anschließend wurden die isolierten und quantifizierten Proben bei -80°C gelagert.
3.6.2 cDNA-Synthese
Die Quantifizierung von RNA-Molekülen über DNA-basierte PCR-Verfahren erfordert zunächst eine Umschreibung in cDNA mittels reverser Transkriptase. Hierbei synthetisieren RNA-abhängige Polymerasen anhand einer RNA-Matrize einen komplementären cDNA-Strang.
Für die resverse Transkription wurde standardmäßig 1 µg Gesamt-RNA eingesetzt. Das entsprechende Volumen wurde mit 0,1 U dN6 Random-Primer und RNAse-freiem Wasser auf 18,5 µl ergänzt. Dieser Ansatz wurde dann auf 72°C für 10 min im Thermocycler erhitzt, um die RNA zu denaturieren, und danach sofort auf Eis gebracht. Dann wurden pro Probe 11,5 µl Mastermix (Zusammensetzung siehe Tab. 15) zugefügt. Anschließend erfolgt die reverse Transkription im Thermocycler bei 50°C für 60 min und danach das Enzym bei 75°C für 15 min aktiviert.
Die cDNA-Proben wurden mit TE-Puffer auf eine finale Konzentration von 2 ng/µl (auf Basis der Quantifizierung für Gesamt-RNA) verdünnt und auf 96-Well-PCR-Platten ausgebracht, welche dann für die quantitativen real-time PCR-Messungen eingesetzt wurden.
Tab. 15 Pipettierschema Mastermix Reverse Transkription
Volumen/Reaktion
5 x RT-Puffer 6 µl
0,1 M-DTT 2,5 µl
ddH2O 1,5 µl
10 mM dNTPs 1 µl
RNAse Inhibitor 0,5 µl
Super Script III 0,25 µl
Gesamt 11,75 µl
3.6.3 Quantitative real-time PCR (qRT-PCR)
Die qRT-PCR ist eine quantitative Echtzeit-PCR, die der Bestimmung der Expressionsstärke von Genen dient. In dieser Arbeit wurde dabei ein Verfahren mit einem spezifischen Primerpaar zur Amplifikation und einem sich in dsDNA interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff zur Signaldetektion gewählt. Dabei wird das Fluoreszenzsignal während der Elongationsschritte gemessen, welches in einem bestimmten Bereich von Amplifikationszyklen der PCR proportional zur Menge der gebildeten PCR-Produkte ist. Im Bereich der exponenziellen Signalzunahme (in logarithmischer Darstellung linear) wird eine Signalintensität definiert und für die zu vergleichenden Proben einer Messplatte jeweils die zugehörige Zyklenzahl ermittelt. Über diese kann eine quantitative Aussage über die in der Probe enthaltenen RNA-Kopien des gemessenen Gens getroffen werden. Folgende Qualitätskriterien wurden für die einzelnen qRT-PCR-Assays festgelegt:
Amplifikationseffizienz von mindestens 90% (Bestimmung über Eichgerade in qRT-PCR), zum Nachweis der Spezifität ein singulärer Peak in der anschließenden Schmelzkurve (entspricht der ersten Ableitung des Fluoreszenzsignals bei einem graduell ansteigenden Temperaturgradienten) sowie eine singuläre Bande auf Agarosegel (letzteres nur bei Assayetablierung durchgeführt). Um messtechnische Variabilitäten so gering wie möglich zu halten, wurden alle Proben einer Messreihe für jedes zu analysierende Gen einzeitig auf einer Platte gemessen.
Für die einzelnen qRT-PCR-Assays wurde zunächst ein Mastermix gemäß Tab. 16 pipettiert.
Davon wurden jeweils 7 µl auf einer 384-Well-Platte vorgelegt (jede Probe als Duplikat) und dann jeweils 3 µl der in TE-Puffer auf 2 ng/µl eingestellten cDNA-Proben hinzugefügt. Die Messung erfolgte mit einem ABI 7900HT-Gerät gemäß des in Tab. 17 genannten Ablaufs.
Bei der initialen Aktivierung kommt es zur Dissoziiation der blockierenden Antikörper von der Polymerase. Anschließend werden die durch das spezifische Primerpaar flankierten Sequenzabschnitte amplifiziert, wobei das Fluoreszenzsignal bei dem hier verwendeten Verfahren, wie oben ausgeführt, während der Elongation gemessen wird. Zuletzt wird eine
4 Ergebnisse 36 Schmelzkurve aufgezeichnet. Die Ergebnisse wurden mit Hilfe der SDS 2.1 Software ausgewertet.
Als Zielgene wurde in dieser Arbeit die mRNA-Expression der TGFB-Signalweg-Gene TGFB1, TGFBR1 und SMAD2, SMAD3, SMAD4 und SMAD7 sowie von CAT (in Bezug auf ROS), CDKN1A (als Postitivkontrolle für Strahlenwirkung) und CTGF (als Effektor des TGFB-Signalwegs) bestimmt. Ein wichtiger Aspekt beim Vergleich der zu messenden Proben ist die Normierung. Ungenauigkeiten beim Pipettieren der qRT-PCR-Platten wurden durch eine hoch standardisierte Vorgehensweise und eine Kalibrierung auf den Fluorszenzfarbstoff ROX (im qRT-PCR-Mastermix enthalten) als internem Standard minimiert. Kritischer sind etwaige Inhomogenitäten im Vorfeld der qRT-PCR, d. h. bei der RNA-Quantifizierung und insbesondere bei der reversen Transkription. Um diese Faktoren kontrollieren zu können, wurde die Expression der Zielgene auf die von Referenzgenen bezogen. Als solche dienten im Rahmen dieser Arbeit GAPDH und HPRT1, aus welchen zur Normierung ein gewichtetes Mittel gebildet wurde. Eine Anforderung an die Referenzgene war, dass sich deren Expression möglichst wenig durch die durchgeführten Behandlungen (1,8 Gy, 3 µM 5-FU, TGFβ1) verändern.
Die Primersequenzen für die qRT-PCR-Assays sind in Tab. 3 gelistet.
Tab. 16 Pipettierschema für qRT-PCR
Initiale Aktivierung 15 min 95 °C
- Denaturierung 15 s 95 °C 45 Zyklen
Die Bestimmung der TGFβ1-Konzentration wurde mit einem kommerziellen Sandwich-ELISA-Kit (human TGFβ1-CytoSet) durchgeführt. Zu Beginn wurde nach Vorgabe des