II. Abkürzungsverzeichnis
4. Ergebnisse
4.1 Analyse der PTI1-Familie in Arabidopsis
4.1.4 Analyse der subzellulären Lokalisation der Arabidopsis PTI1-Kinasen
70 4.1.4 Analyse der subzellulären Lokalisation der Arabidopsis PTI1-Kinasen
71 kleinen Vesikeln (Abbildung 4-10 a-c). Ebenfalls war PTI1-6:GFP mit Vesikeln assoziiert, diese waren jedoch größer als die Vesikel der PTI1-1:GFP Lokalisation (Abbildung 4-10 h).
PTI1-5:GFP wurde an filamentösen Strukturen an der Peripherie der Zelle detektiert. Diese Strukturen glichen denen von kortikalen Mikrotubuli und waren zudem um den Nukleus herum stärker ausgeprägt (Abbildung 4-10 e, f). Um sicher zu stellen, dass es sich hierbei um Mikrotubuli handelt, wurden GFP-positive Zellen mit dem Mikrotubuli-Inhibitors Oryzalin behandelt (Abbildung 4-10 g). Der sukzessive Abbau der Untereinheiten spiegelte sich in einer Veränderung der GFP-Fluoreszenz wieder. Die beobachtete Depolymerisierung deckte sich mit den Angaben der Literatur (HASENSTEINet al. 1999; THITAMADEE et al. 2002) und unterstützt die Vermutung, dass PTI1-5 an den Mikrotubuli lokalisiert ist.
Die ubiPTI1-Kinasen zeigten im Gegensatz zu den PolPTI1-Kinasen ein einheitlicheres Bild und waren mit Ausnahme von PTI1-8:GFP alle an der Plasmamembran lokalisiert (Abbildung 4-10 j-n, p). PTI1-2:GFP und PTI1-4:GFP wurden in einigen Fällen zusätzlich im Cytoplasma gefunden. Zudem konnte für PTI1-4:GFP eine Lokalisation in/an kleinen Vesikeln detektiert werden. Für das an der Plasmamembran lokalisierte ZmPTI1a von Mais konnten HERRMANN et al. (2006) ein N-terminales Glycin an Position 2 als Myristoylierungssignal sowie eine S-Palmitoylierung der Cysteinreste an Position 3, 6 und 7 verantwortlich machen. Die für die N-Myristoylierung und S-Palmitoylierung und somit für die Lokalisation an der Plasmamembran verantwortlichen Aminosäurereste Gly2 und Cys3, 6 und 7 konnten bei den Arabidopsis PTI1-Kinasen nur in PTI1-7 gefunden werden, während die übrigen PTI1-Kinasen offenbar über andere membranassoziierende Mechanismen verfügen. PTI1-8:GFP zeigte im Gegensatz zu den anderen ubiPTI1-Kinasen sowohl eine cytoplasmatische als auch eine nukleäre Lokalisation (Abbildung 4-10 o).
Bei der vorangegangen Lokalisationsstudie handelt es sich um ein heterologes System, in dem die Lokalisation von Proteinen einer dikotyledonen Pflanze in Zellen einer monokotyledonen Pflanze untersucht wurden. Um mögliche Artefakte, hervorgerufen durch dieses heterologe System, auszuschließen, wurden die GFP-Fusionskonstrukte auch mittels Agrobacterium tumefaciens stabil in Arabidopsis Pflanzen transformiert (3.2.6.2). Die PTI1:GFP Konstrukte der PolPTI1-Kinasen wurden unter Kontrolle des LAT52-Promotors aus Tomate und die der ubiPTI1-Kinasen unter Kontrolle des 35S-Promotors gestellt. Der LAT52-Promotor ermöglicht eine pollenspezifische Expression in Arabidopsis (TWELL et al. 1990) während der 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus zu einer annähernd ubiquitären Expression in Arabidopsis führt, jedoch nicht in Pollen aktiv ist.
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Abbildung 4-10: Subzelluläre Lokalisation der Arabidopsis PTI1-Kinasen in transient transformierten Epidermiszellen der Frühlingzwiebel. Zwiebelepidermis wurde biolistisch mit den Fusionskonstrukten PTI1-1:GFP (a, b, c), PTI1-3:GFP (d), PTI1-5:GFP (e-g), PTI1-6:GFP (h), PTI1-2:GFP (j, k), PTI1-4:GFP (l, m), PTI1-7:GFP (n), PTI1-8:GFP (o), PTI1-9:GFP (p) und GFP (i) transformiert. (g) Mit PTI1-5:GFP transformierte Zwiebelepidermis wurde mit 10 µM Oryzalin behandelt, um so eine Depolymerisierung der Mikrotubuli hervorzurufen. Balken entspricht 25 µm.
Die Lokalisationsanalysen der PolPTI1:GFP Konstrukte, PTI1-1:GFP, PTI1-3:GFP, PTI1-5:GFP und PTI1-6:GFP, zeigte die GFP-Fluoreszenz nur in Pollen (Abbildung 4-11). Es war deutlich sichtbar, dass die Fusionsproteine PTI1-3:GFP und PTI1-6:GFP wie schon in den Experimenten zuvor nicht an der Plasmamembran lokalisierten (Abbildung 4-11 d, i, j). Eine Lokalisation von PTI1-6:GFP an Vesikeln konnte aber weder im Pollenkorn noch im
PTI1-3:GFP
PTI1-6:GFP
PTI1-2:GFP
GFP PTI1-5:GFP
PTI1-8:GFP PTI1-1:GFP
PTI1-7:GFP PTI1-4:GFP a
c b
e d
h
i
PTI1-9:GFP j
k
m l
n
o
p
f g
PTI1-5:GFP - Oryzalin PTI1-5:GFP + Oryzalin
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Abbildung 4-11: Subzelluläre Lokalisation der PolPTI1-Kinasen in stabil transformierten Arabidopsis Pflanzen. Arabidopsis Pflanzen des Ökotyps Col-0 wurden durch Agrobakterium tumefaciens stabil mit den Fusionskonstrukten PTI1-1:GFP (a,b), PTI1-3:GFP (c), PTI1-5:GFP (d-f), PTI1-6:GFP (g,h) unter Kontrolle des LAT52-Promotors aus Tomate transformiert. g = generative Zelle, N = Nukleus der vegetativen Zelle, Ps =Pollenschlauch. Balken entspricht 10 µm.
Pollenschlauch beobachtet werden. Für PTI1-1 war, wie bereits in der transient transformierten Zwiebelepidermiszelle, eine Lokalisation in der Plasmamembran sichtbar (Abbildung 4-11 a). Besonders deutlich war dies an den wachsenden Pollenschläuchen zu erkennen (Abbildung 4-11 b, c). In einigen Fällen lagen in den Pollenkörnern der PTI1-1:GFP Linien grün fluoreszierende Vesikel vor. Diese zeigten sich jedoch nur in Pollen mit einem besonders starken Fluoreszenzsignal (Daten nicht gezeigt). Es ist zu vermuten, dass es sich hierbei um Pollenkörner handelt, in denen eine übermäßige Menge an PTI1-1:GFP gebildet wurde und aufgrund dessen eine Fehllokalisation stattfand. PTI1-5:GFP zeigte in einigen Fällen ein Fluoreszenzsignal, welches dem des PTI1-1:GFP an der Plasmamembran glich (Abbildung 4-11 e). Eine solche Lokalisation war vor allem in den Pollenschläuchen der PTI1-5:GFP-Pollen zu erkennen (Abbildung 4-11 g, h). In den Pollenkörnern mit einem Fluoreszenzsignal an der Plasmamembran zeigte sich häufig zusätzlich eine punktuelle Lokalisation im Inneren des Pollenkorns, wobei es wahrscheinlich um den Nukleus der vegetativen Zelle handelt. Ebenfalls waren Pollenkörner mit einer eher diffusen Lokalisation des PTI1-5:GFP zu erkennen, in denen ebenfalls der Zellkern der vegetativen Zellen fluoreszierte. Dieses Bild ähnelt dem der mit PTI1-5:GFP transformierten Zwiebelzellen und könnte möglicherweise ebenfalls durch eine Lokalisation von PTI1-5:GFP an den Mikrotubuli hervorgerufen werden. Die Plasmamembranständigkeit von PTI1-1 wird besonders im binukleären Stadium II (kompaktes Callose-Stadium) der Pollenentwicklung
PTI1-3:GFP
PTI1-6:GFP PTI1-5:GFP
e i
PTI1-1:GFP
a b
f f j
N
Ps
g
g N
c
g g
d
h g
Ps
74 deutlich in welchem die generative Zelle nach Ausbildung der Zellplatte an die Pollenwand andockt und von einer bogenförmigen Schicht aus Callose umgeben ist (Abbildung 4-11 a).
Die generative Zelle ist auch als nicht fluoreszierende dunkle Struktur in den Pollenstadien der PTI1-5:GFP Linien sichtbar, da der LAT52-Promotor spezifisch in der vegetativen Zelle aktiv ist und in der generativen Zelle inaktiv ist (Abbildung 4-11 f). Um ein noch detaillierteres Bild über die subzelluläre Lokalisation der PolPTI-Kinasen in den Pollen und Pollenschläuchen zu erhalten sind weitere Untersuchungen, beispielsweise mittels konfokaler Mikroskopie notwendig.
Die ubiPTI1-Kinasen PTI1-2, PTI1-4, PTI1-7 und PTI1-9 zeigten in der stabilen Transformation ausschließlich eine Lokalisation an der Plasmamembran (Abbildung 4-12).
Dieses Resultat entspricht den Ergebnissen der transienten Lokalisationsstudien (Abbildung 4-10). Die zuvor PTI1-2 und PTI1-4 gefundene Lokalisation im Cytoplasma sowie an kleinen Vesikeln (Abbildung 4-10 i-m, o) konnte durch die stabile Transformation im homologen System nicht bestätigt werden. Es ist zu vermuten, dass die cytoplasmatische Lokalisation von PTI1-2 und PTI1-4 sowie die von PTI1-4 in Vesikeln, Artefakte der transienten Transformation darstellen. Vermutlich wurde dies durch die Verwendung des heterologen Systems hervorgerufen bzw. aufgrund einer übermäßigen Konzentration an PTI1:GFP-Fusionsprotein ausgelöst, die auf eine Überexpression der Fusionskonstrukte durch Verwendung des 35S-Promotors zurückzuführen ist. Eine stabile PTI1-8:GFP Pflanze konnte bislang nicht generiert werden.
Abbildung 4-12: Subzelluläre Lokalisation der ubiPTI1-Kinasen in stabil transformierten Arabidopsis Pflanzen. Arabidopsis Pflanzen des Ökotyps Col-0 wurden durch Agrobakterium tumefaciens stabil mit den Fusionskonstrukten PTI1-2:GFP (a), PTI1-4:GFP (b), PTI1-7:GFP (c) und PTI1-9:GFP (d) unter Kontrolle des 35S-Promotors transformiert.
PTI1-2:GFP
PTI1-7:GFP
PTI1-4:GFP
a b
c
PTI1-9:GFP
d
75 Die Zusammenfassung dieser Daten mit denen der vorherigen Kapitel ist in Abbildung 4-13 in den phylogenetischen Stammbaum der PTI1-Kinasen eingegliedert.
Abbildung 4-13: Phylogenie der PTI1-Kinasen aus Arabidopsis, Mais, Reis, Tabak und Tomate, einschließlich der präferentiellen Expression, der Gruppierung in die drei Subfamilien der PTI1-Kinasen, ihrer N-terminalen Sequenzen und ihrer subzellulären Lokalisation. Der phylogenetische Baum wurde durch Berechnungen mit ClustalX2 und Visualisierung mit Treeview erstellt. Außengruppe ist SlPTO. Die Unterteilung der PTI1-Kinasen in drei Subfamilien erfolgte anhand ihrer Aminosäuresequenz.
Eine Auflistung der ersten zehn Aminosäurereste des jeweiligen N-Terminus und ihrer bisher bekannten sowie der im Rahmen dieser Arbeit ermittelten subzellulären Lokalisationen befinden sich im rechten Teil der Abbildung (DISSANAYAKE et al. 2004; HERRMANN et al. 2006; KONG et al. 2007; REHDERS 2010). Die präferentielle Expression in Pollen ist durch den griechischen Buchstaben Theta (θ) symbolisiert.
AtPTI1-2 ist mit einem grauen Theta markiert, da eine Expression in Pollen nur durch Promotor-GUS-Studien belegt ist. Eine experimentell gestützte Beteiligung an Pathogenabwehr bzw. an Reaktionen auf abiotische und/oder biotische Stressoren ist durch den griechischen Buchstaben Phi (ϕ) gekennzeichnet.
I II
III
MFCCGGADEE…
MSCFGWCGSE…
MGCFGCCGGG…
MSCFGCCGED…
MSCFGCCRED…
MGCFSCCCVA…
MSCFACCGDE…
MSCFSCCDDD…
Plasmamembran
Plasmamembran
Cytoplasma + Vesikel
Vesikel
Cytoplasma + Nukleus
Cytoplasma Plasmamembran
Plasmamembran Cytoplasma + Nukleus Cytoplasma + Nukleus N-Termini subzelluläre
Lokalisation Subfamilie
Phylogenie und präferentielle Expression
Cytoplasma Cytoplasma + Nukleus
Plasmamembran
SlPTO ϕ ZmPTI1c ϕ ZmPTI1d AtPTI1-5 θ AtPTI1-3 θ AtPTI1-1 θ AtPTI1-2 ϕ θ OsRLCK1 θ ZmPTI1e θ AtPTI1-6 θ NtPK2 θ NtPK1 θ ZmPTI1a θ SlPTI1 ϕ AtPTI1-7 AtPTI1-8 AtPTI1-4 ϕ AtPTI1-9 ZmPTI1b ϕ
Cytoplasma Cytoplasma Plasmamembran
Mikrotubuli Cytoplasma
MRRWICCGDK…
MRKWICCTCQ…
MRRWLCCSCR…
MRRWLCCACH…
MRRWLCCNCH…
MRRWFCCTRF…
MSCCGGAEED…
MSCCGGGEED…
MSCCGGGEED…
MICCGGEEEE…
76 Wie bereits erwähnt, handelt es sich bei den Proteingruppen, die sich aufgrund der Sequenzähnlichkeit aus den bereits bekannten PTI1-Kinasen gebildet haben, nicht zwangsweise um putativ funktionsorthologe Proteine mit demselben Transkriptionsmuster.
Dies trifft nur auf die Mitglieder der Subfamilie I zu, die bisher alle präferentiell in Pollen exprimiert sind. Anhand der bereits bekannten subzellulären Lokalisationen sowie der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Lokalisationsstudien (Abbildung 4-10, Abbildung 4-11, Abbildung 4-12) ist sichtbar, dass die Sequenzhomologien der jeweiligen Subfamilien nicht in einer einheitlichen subzellulären Lokalisation resultieren. Jedoch zeichnet sich ab, dass einige PTI1-Kinasen, die eine hohe Homologie zueinander teilen, häufig die gleiche subzelluläre Lokalisation besitzen. So weisen AtPTI1-4 und AtPTI1-9 aus Subfamilie II sowie AtPTI1-1 und AtPTI1-2 aus Subfamilie III eine Lokalistation an der Plasmamembran auf.
AtPTI1-7 und ZmPTI1a aus Subfamilie II befinden sich ebenfalls beide an der Plasmamembran und besitzen als einzige ein Myristoylierungssignal. In Subfamilie I zeigen nur die beiden sehr ähnlichen PTI1-Kinasen aus Tabak eine Korrelation zwischen dem Grad der Sequenzähnlichkeit, der Expression und der Proteinlokalisation.
Nach Auswertung der Daten ist eine artübergreifende funktionelle Korrelation zwischen einheitlicher subzellulärer Lokalisation und einer gleichartig gewebespezifischen Expression der PTI1-Kinasen innerhalb einer Subfamilie sehr unwahrscheinlich.
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