Analyse der AtPTI1-Promotoraktivität in Promotor-GUS-Pflanzen

65 4.1.3.2 Analyse der AtPTI1-Promotoraktivität in Promotor-GUS-Pflanzen

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Abbildung 4-7: PolPTI1-Promotorspezifische GUS-Expression in Blüten und Infloreszenzen. X-Gluc-Färbung von a-d) PTI1-1Pro:GUS-, e-i)PTI1-3Pro:GUS-, j-n) PTI1-5Pro:GUS- und o-s)PTI1-6Pro:GUS-Pflanzen; a, e, j, o) Blüte; d, i, n, s) Infloreszenzen; b, g, k, l, p) Detailaufnahmen von Stigmata; c, q) in vitro Pollenschlauchwachstum; f, h, m) Antheren; r) Detailansicht einer Samenanlage mit Pollenschlauch. F = Filament, Pa = Papillen, Ps = Pollenschlauch, S = Samenanlage.

Pflanzen von PTI1-4 und PTI1-8 detektiert werden. Die Promotoren aller ubiPTI1-Gene wiesen eine Aktivität im Bereich des Blütenbodens auf. Für den Promotor von PTI1-9 war dies neben einer schwachen Expression in entwickelnden Samen (Abbildung 4-8 o) die einzige detektierbare Expression. Microarray-Daten von CASSON et al. (2005) und LE et al.

PTI1-3_Pro:GUS PTI1-1_Pro:GUS

PTI1-5_Pro:GUS

PTI1-6_Pro:GUS a

e

d c

b

g

i f

j m

h

k n

q

p

o s

l

r Ps

Ps

Ps

Ps

Ps Sa F

Pa

67 (2010) bestätigen das Expressionsmuster von PTI1-9 und grenzen es in den Samen auf die Kotyledonen des Herzstadiums und die Samenhülle ein. Für den Promotor von PTI1-2 wurde sowohl eine Aktivität in entwickelnden Samen sowie in Pollen bei neun von zehn unabhängigen Linien festgestellt (Abbildung 4-8 b, c). Eine geringe Expression von PTI1-2 ist in den Samen gemäß der Microarraydaten zu erwarten, während eine Expression in Pollen in drei unabhängigen Microarray-Experimenten nicht nachweisbar war (SCHMID et al. 2005;

H^ONYS & T^WELL 2004; Q^IN et al. 2009).

Abbildung 4-8: ubiPTI1-Promotorspezifische GUS-Expression in Blüten. X-Gluc-Färbung von a-c) PTI1-2Pro:GUS-, d-f)PTI1-4Pro:GUS-, g-h) PTI1-7Pro:GUS-, i-k) PTI1-8Pro:GUS-, und l-o)PTI1-9Pro:GUS-Pflanzen;

a, d, g, l) Blüte; b) Pistill; c, e, f, j) Antheren; h) Detailaufnahme Papillen; k, m) junge Blüten; o) Schote.

Bb = Blütenboden, Em = Embryo, F = Filament, Pa = Papillen, S = Samen, St = Stylus.

Eine Zusammenfassung der Ergebnisse der Microarray-Auswertung und der Promotor-GUS-Studie ergibt, dass alle untersuchten Gene der Familie individuelle und spezifische Expressionsmuster aufweisen. Zudem wird anhand der vielfältigen Expressionsmuster deutlich, dass die Einteilung in PolPTI- und ubiPTI1-Kinasen dieser Vielfalt nicht vollständig gerecht wird. Der Übersicht halber wird jedoch diese grobe Einteilung beibehalten.

Pti1-8

PTI1-4_Pro:GUS PTI1-2_Pro:GUS

PTI1-7_Pro:GUS

PTI1-9_Pro:GUS

PTI1-8_Pro:GUS a

b

c d

e

f

g h i

j

k

l n

m F

Pa

Bb

Em

F

St

Pa Bb Bb

F St

Bb Bb

Pa

o

S

68 Die vier PolPTI1-Gene aus Arabidopsis (PTI1-1, PTI1-3, PTI1-5 und PTI1-6) werden vorwiegend in der späten Pollenentwicklung, im trizellulären Pollen und im reifen Pollenkorn exprimiert. Für diese PTI1-Gene zeigten die Microarray-Daten, dass eine große Transkriptmenge auch noch während der Pollenkeimung vorliegt. Ebenfalls konnte eine Aktivität des PTI1-2-Promotors in Pollen der Promotor-GUS-Pflanzen detektiert werden.

Dieses Resultat deckt sich nicht mit den Ergebnissen der Microarray-Studien, möglicherweise aufgrund unterschiedlicher Sensitivität der Nachweismethode. Da jedoch neun von zehn Linien dieses Bild zeigen, können Positionseffekte ausgeschlossen werden.

Zwei der vier PolPTI1-Gene, PTI1-1, PTI1-3 sind präferentiell, aber nicht ausschließlich in Pollen exprimiert. Die Daten der Microarray-Studien, der semi-quantitativen RT-PCR und der Promotor-GUS-Studien zeigen, dass eine schwächere Expression von PTI1-1 und PTI1-3 zusätzlich in Rosetten- und Stängelblättern, Kelchblättern sowie Wurzeln zu finden ist. Für das Promotor-GUS-Konstrukt von PTI1-1 konnte ebenfalls eine Aktivität in den Filamenten der Antheren detektiert werden. Die Expression der PTI1-5- und PTI1-6-Gene ist sehr wahrscheinlich auf Pollen limitiert, da auch mittels semi-quantitativer Expressionsanalyse PTI1-5- und PTI1-6-Transkripte nur in Blütenstadien gefunden werden konnten, die entwickelnde bzw. reife Antheren enthalten und zudem die Transkriptmenge vom Knospenstadium bis zu den reifen Blüten ansteigt. In den ausgewerteten Microarray-Experimenten wurden diese Transkripte nur in geringer Menge in reifen Blüten gefunden.

Diese Ergebnisse decken sich mit denen der Promotor-GUS-Experimente, in denen die Promotoren von PTI1-5- und PTI1-6 ebenfalls erst in reifen Blüten aktiv waren.

Promotoraktivitäten der ubiPTI1-Gene (PTI1-2, PTI1-4, PTI1-7, PTI1-8 und PTI1-9) konnten in verschiedenen Blütengeweben wie Papillen, Filamenten, Stylus, Pollen, Blütenboden und in den Samen gefunden werden. Nahezu jedes Gen der PTI1-Familie weist ein eigenes gewebespezifisches Expressionsmuster auf.

Die Daten der Expressionsanalyse wurden dem phylogenetischen Stammbaum von PTI1-Kinasen aus Arabidopsis, Mais, Reis, Tabak und Tomate gegenüber gestellt und mit den zugeschriebenen Expressionsorten bzw. biologischen Funktionen – soweit bekannt – verglichen (Abbildung 4-9). Es wird deutlich, dass Proteine verschiedener Spezies, die aufgrund der Sequenzähnlichkeit und konservierten N-Termini eine sehr hohe Verwandtschaft besitzen, meist nicht die gleiche Gewebespezifität besitzen. Die Pol PTI1-Kinasen aus Arabidopsis finden sich z.B. in den Subfamilien I und III, während sich die beiden präferentiell in Pollen exprimierten PTI1-Kinasen aus Mais in den Subfamilien II (ZmPTI1a) und I (ZmPTI1e) finden. In Subfamilie I sind zudem noch die PTI1–Kinasen

69 NtPK1, NtPK2 und OsRLCK1 eingruppiert, welche ebenfalls hauptsächlich in Pollen exprimiert werden. Die PTI1-Kinasen, denen eine Beteiligung an der Pathogenabwehr bzw.

an einer Reaktion auf abiotische und biotische Stressoren zugeschrieben wird, befinden sich in den Subfamilien II (SlPTI1, ZmPTI1b und AtPTI1-4) und III (AtPTI1-2). Demnach ist allein aufgrund der Zuordnung zu einer Subfamilie auf Basis der Aminosäuresequenz nicht zwangsweise auf die in planta Expressionsorte der Kinasen zu schließen. Dies trifft bislang allein auf Subfamilie I zu, deren bislang bekannte Vertreter ausschließlich präferentiell in Pollen exprimiert werden.

Abbildung 4-9: Phylogenie der PTI1-Kinasen aus Arabidopsis, Mais, Reis, Tabak und Tomate, inklusive der präferentiellen Expression und ihrer N-terminalen Sequenzen. Der phylogenetische Baum wurde durch Berechnungen mit ClustalX2 und Visualisierung mit Treeview erstellt. Außengruppe ist SlPTO. Die PTI1-Kinasen sind in drei Subfamilien unterteilt, die sich insbesondere in den konservierten N-terminalen Sequenzen wiederspiegeln. Eine Auflistung der ersten zehn Aminosäurereste des jeweiligen N-Terminus befindet sich im rechten Teil der Abbildung. Eine überwiegende Expression in Pollen ist durch den griechischen Buchstaben Theta (θ) gekennzeichnet. AtPTI1-2 ist mit einem grauen Theta markiert, da eine Expression in Pollen nur durch Promotor-GUS-Studien belegt ist. Kinasen, denen eine Beteiligung an der Pathogenabwehr bzw. an Reaktionen auf abiotische und/oder biotische Stressoren zugeschieben wird, sind mit dem griechischen Buchstaben Phi (ϕ) gekennzeichnet.

I II

III

MFCCGGADEE…

MSCFGWCGSE…

MGCFGCCGGG…

MSCFGCCGED…

MSCFGCCRED…

MGCFSCCCVA…

MSCFACCGDE…

MSCFSCCDDD…

N-Termini Subfamilie

Phylogenie und präferentielle Expression

SlPTO ϕ ZmPTI1c ϕ ZmPTI1d AtPTI1-5 θ AtPTI1-3 θ AtPTI1-1 θ AtPTI1-2 ϕθ OsRLCK1 θ ZmPTI1e θ AtPTI1-6 θ NtPK2 θ NtPK1 θ ZmPTI1a θ SlPTI1 ϕ AtPTI1-7 AtPTI1-8 AtPTI1-4 ϕ AtPTI1-9 ZmPTI1b ϕ

MRRWICCGDK…

MRKWICCTCQ…

MRRWLCCSCR…

MRRWLCCACH…

MRRWLCCNCH…

MRRWFCCTRF…

MSCCGGAEED…

MSCCGGGEED…

MSCCGGGEED…

MICCGGEEEE…

70 4.1.4 Analyse der subzellulären Lokalisation der Arabidopsis PTI1-Kinasen

Im Dokument Funktionelle und biochemische Charakterisierung der PTI1-Kinasefamilie aus Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (Seite 72-77)