5. Enzymatische reduktive Aminierung
5.2. Amindehydrogenasen
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präsentiert, der mit dem Teilschritt der Transaminierung kompatibel ist. Das Konzept der Kompartimentierung wird in den nächsten Kapiteln weiter in der Tiefe diskutiert. Für die Anwendbarkeit des Konzepts der formalen asymmetrischen Hydroaminierung konnte auch ein Substratspektrum aufgezeigt werden, sodass verschiedene Arten von Molekülen zugänglich werden.
Durch den Einsatz von organischen Lösungsmitteln als Additiv, konnte bereits eine Möglichkeit vorgestellt werden, die Diffusionsgeschwindigkeit durch eine PDMS-Membran deutlich zu steigern.
Auf diese Weise kann die Reaktionsgeschwindigkeit in einer Tandemreaktion (siehe Kapitel 7) gesteigert werden.
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Abbildung 47). Die Konzentrationen wurden angelehnt an die von Löwe durchgeführten Experimente.[181]
Abbildung 47 zeigt eindrucksvoll, wie gut und selektiv die reduktive Aminierung katalysiert durch die Amindehydrogenase abläuft. Ein Umsatz von 96 % bei nahezu quantitativer Wiederfindung spiegelte die Effektivität der Reaktion und die Robustheit der Analytik wider. Außerdem überzeugte die Amindehydrogenase mit exzellenter Selektivität bei einem gemessenen Enantiomerenüberschuss von
>99 %ee. Diese Bedingungen wurden ohne weitere Optimierungen für die folgenden Experimente übernommen.
99
0 20 40 60 80 100
4
96 99
[%]
99
Abbildung 47: Benchmark Transformation von Acetophenon 8 zu 1-Phenylethylamin (R)-9 in Gegenwart einer Amindehydrogenase.
Im Hinblick auf eine Kaskadenreaktion im Sinne einer formalen asymmetrischen Hydroaminierung folgt als nächstes die Betrachtung des einfachsten Systems, der Eintopfreaktion. Um eine solche Eintopfreaktion durchführen zu können, müssen die Katalysatoren der Teilreaktionen miteinander kompatibel sein. Diese Kompatibilität wird mit den folgenden Experimenten untersucht. Der Fokus wurde dabei zuerst auf die enzymatische Kaskade gelegt. Während die Wacker-Oxidation als zuerst durchgeführte Reaktion nicht zwangsläufig kompatibel sein muss, so ist der umgekehrte Fall für ein
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erfolgreiches Experiment entscheidend. In einem sequentiellen Verfahren können die Katalysatoren der Wacker-Oxidation zunächst ohne Einschränkung eingesetzt werden. Nach Zugabe der enzymatischen Katalysatorkomponente dürfte die Aktivität verloren gehen, weil das Substrat bereits vollständig zu Acetophenon 8 umgesetzt ist. Umgekehrt kann die Eintopfreaktion nicht ablaufen, wenn die enzymatische Kaskade durch die Übergangsmetallsalze der Wacker-Oxidation eingeschränkt oder inhibiert wird. Eine einfache Abtrennung aufgrund der physikalischen und chemischen Eigenschaften der Reaktionsmischung ist hier nicht möglich.
Abildung 48: Überprüfung der Katalysatorkompatibilität von Amindehydrogenase und den beiden Metallsalzen der Wacker-Oxidation.
Abildung 48 zeigt die Ergebnisse aus den Experimenten zur Kompatibilität der enzymatischen Kaskade mit den Metallsalzen der Wacker-Oxidation. Die Menge der Metallsalze wird dabei anhand der Bedingungen für die Wacker-Oxidation abgewogen. In Zeile 1 der Tabelle ist das oben diskutierte Benchmark-Experiment aufgeführt. Um auch kleinere Einschränkungen der Enzymaktivität zu registrieren, wurde für die Folgeexperimente die Reaktionszeit auf 38 h reduziert (siehe Abildung 48, Zeile 2). Wird der Reaktionsmischung PdCl2 als Additiv zugefügt, sinkt der Umsatz geringfügig auf 77 % ab. Die Selektivität der enzymatischen Transformation in Gegenwart des Palladiumsalzes bleibt unbeeinflußt. Die Biotransformation in Gegenwart von CuCl bleibt vollständig aus. Nach 38 h konnte kein Umsatz gemessen werden und entsprechend auch keine Selektivität bestimmt werden.
Aus diesen Experimenten folgt, dass eine Eintopfreaktion egal ob in sequentieller oder paralleler Form in Gegenwart beider Katalysatorkomponenten nicht in Frage kommt. Angelehnt an die vorangegangenen Arbeiten der Kombination von Wacker-Oxidation und Transaminierung kann auch in diesem Fall eine PDMS-Membran die Lösung darstellen (siehe Abbildung 49). Damit wäre nicht nur eine weitere chemoenzymatische Kaskade erfolgreich aufgebaut, sondern könnte auch gezeigt werden,
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dass die Kompartimentierung als modulares System extrem robust (im Sinne des Konzepts) und flexibel (im Hinblick auf synthetische Anwendungsbreite) einsetzbar ist.
Bei der Entwicklung einer chemoenzymatischen Kaskade mit Transaminasen stellte sich die PDMS-Membran als günstiges semipermeables Trennmittel heraus. Einer Enzymdeaktivierung konnte vor vollständigem Umsatz entgegengewirkt werden. Das Szenario eines biokatalytischen Umsatzes mit Amindehydrogenasen ist nahezu gleich. Das Enzym und die Cofaktoren /-substrate stellen eine wässrige Lösung im äußeren Volumen des Reaktors dar (siehe Abbildung 49). Aus diesem Grund können alle Daten, die in Kapitel 5.1 gewonnen wurden, auf diese Herausforderung übertragen werden. Sehr hilfreich und im Hinblick auf eine attraktive Prozessanwendung stellte sich ein Cosolvensadditiv heraus.
So konnte die Diffusionsgeschwindigkeit des Zwischenprodukts Acetophenon 8 (und seiner Derivate) durch die Membran deutlich erhöht werden. Diese Idee wurde auch im Zusammenhang mit den Amindehydrogenasen verfolgt.
Abbildung 49: Kompartimentierung zweier inkompatibler Katalysatoren durch eine PDMS-Membran.
In Abbildung 50 sind die Umsätze und Enantiomerenüberschüsse in Gegenwart verschiedener Cosolventien dargestellt. Bei der Wahl der Cosolventien wurde weniger auf Anzahl verschiedener Lösungsmittel geachtet, als vielmehr geschaut, welche sich in vorangegangenen Arbeiten bereits als kompatibel herauskristallisierten. Transaminasen zeigten gegenüber MeOH und DMSO hohe Toleranz bis zu einem Volumenanteil von 20 %.[182] Deshalb wurden diese beiden Lösungsmittel auch für die Amindehydrogenasen als erstes in Betracht gezogen.
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70 71
37
0 2 1
69 67
59 46
99 99 99
0 0 0
99 99 99 99
MeOH 10 %
MeOH 20 %
MeOH 30 %
MeOH 40 %
DM SO 10 %
DM SO 20 %
Wa sser 10 %
Wa sser 20 %
Wa sser 30 %
Wa sser 40 % 0
20 40 60 80 100
[%]
Umsatz Enantiomerenüberschuss
Abbildung 50: Reduktive Aminierung mit Amindehydrogenasen in Gegenwart verschiedener Cosolventien.
Im obigen Experiment wurde der Volumenanteil eines Cosolvens´ sukzessiv erhöht. Als Kontrollexperiment wurde parallel ein Versuch mit selbigem Anteil reinem Wasser durchgeführt, um zu verhindern, dass Umsatzunterschiede auf Konzentrationsänderungen der Reaktionskomponenten zurückzuführen sind. Abbildung 50 zeigt, dass MeOH bis zu einem 20 %igen Volumenanteil zugesetzt werden kann ohne Umsatzeinbußen im Vergleich zur Referenz hinnehmen zu müssen. Wurde der Volumenanteil weiter erhöht, sinkt der Umsatz schnell gegen null (bei 40 % MeOH). DMSO wurde von der Amindehydrogenase nahezu gar nicht toleriert. Bei einem Volumenanteil von 10 % sank der Umsatz auf 2 % und eine Erhöhung des DMSO-Anteils führte zur Nachweisgrenze eines Umsatzes. Die Enantioselektivität der AmDH blieb von jedem Additiv Additiv unbeeinträchtigt, wobei die in DMSO durchgeführten Experimente keine Enantiomerenüberschussmessung zuließen. Das Experiment mit 30 % Volumenanteil MeOH zeigte, dass die Aktivität deutlich gesenkt war, aber die Enantiomerenreinheit des gewünschten Produkts erhalten blieb.
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Mit diesen Ergebnissen stand ein weiteres Modul zur formalen asymmetrischen Hydroaminierung durch Kombination von Wacker-Oxidation und enzymatischer reduktiver Aminierung bereit. Das System aus Amindehydrogenase, GDH und D-Glucose in Gegenwart von Cofaktor und einem Überschuss Ammoniak kann in Kapitel 7 direkt zur Kombination mit der Wacker-Oxidation eingesetzt werden.
Im nächsten Schritt sollte das Mehrkomponentensystem der Amindehydrogenase vereinfacht werden und eine alternative Cofaktorregenerierung vorgestellt werden. Die Amindehydrogenase katalysiert wie auch die Transaminase die reduktive Aminierung, wobei es sich um ein thermodynamisches Gleichgewicht handelt.[171] Alle Teilreaktionen verlaufen reversibel. Somit ist auch eine Rückreaktion von primären Aminen zu Carbonylverbindungen denkbar. In einigen Aktivitätsassays wird diese Reaktion bereits beschrieben, wobei die Reaktion in umgekehrte Richtung um den Faktor 100 schneller abläuft.[72,169] Aber eine Grundaktivität ist vorhanden, sodass ein System wie rechts in Abbildung 51 dargestellt möglich scheint. Dabei wird die Amindehydrogenase selbst zur Cofaktorregenerierung genutzt. Als Cosubstrat fungiert ein primäres Amin. Um die Gleichgewichtsreaktion auf die Seite der Produkte unabhängig von den thermodynamischen Eigenschaften des gewünschten Aminprodukts zu verschieben, sind unter dem rechten Reaktionsschema in Abbildung 51 mögliche Cosubstrate aufgeführt, die das ganze Reaktionssystem irreversibel gestalten. Den einfachsten Vertreter stellt Isopropylamin dar, welches erst oxidiert und anschließend zu Aceton hydrolysiert wird. Analog zu den Transaminasen kann Aceton durch die hohe Flüchtigkeit in situ aus der Reaktionsmischung verdampft werden.
Abbildung 51: Komprimierte reduktive Aminierung katalysiert durch eine Amindehydrogenase mit nur einem Enzym.
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Ein alternativer Ansatz, der in der Literatur bislang nicht beschrieben ist, wird auf der linken Seite von Abbildung 51 gezeigt. Ein endständiges primäres Amin wird durch die Amindehydrogenase zum Aldehyd umgesetzt. In Gegenwart von Sauerstoff findet Autoxidation zur Carbonsäure statt, welche irreversibel ist und auf diese Weise das biokatalytische System auf die Seite der Produkte verschiebt.
Um das in Abbildung 51 vorgestellte System aufzubauen, wurden zunächst die Teilschritte analysiert.
Als erstes wurden zwei Substrate gewählt, deren Analytik recht einfach zu etablieren ist. Hier wurden para-Methylacetophenon 60 als Substrat für die reduktive Aminierung gewählt. Zur Cofaktorregenerierung wird (R)-1-Phenylethylamin 9 eingesetzt. Augrund der voraussichtlich niedrigeren Aktivität in oxidativer Richtung, wurde das Cosubstrat bereits im Überschuss eingesetzt.
Der Cofaktor wurde in oxidierter Form zu Beginn der Reaktion zugefügt.
Abbildung 52: Enzymatische reduktive Aminierung mit einer Amindehydrogenase mit eigener Cofaktorregenerierung.
Abbildung 52 zeigt, dass das gewünschte Amin nach 48 h mit einem Umsatz von 1 % detektiert wurde.
Das Nebenprodukt mit einem Umsatz von 10 % entstanden. Mit diesem Experiment kann gezeigt werden, dass ein solches System mit interner Cofaktorregenerierung möglich ist, jedoch bei dem geringen Umsatz für eine synthetische Anwendung noch nicht in Frage kommt. Im nächsten Schritt wurde für die reduktive Aminierung ein Substrat gewählt, gegenüber welchem die AmDH eine deutlich höhere Aktivität aufweist, da der Regenerierungsschritt über 1-Phenylethylamin (R)-9 bereits zu diesem Zeitpunkt funktioniert. Die Wahl fällt auf Isopropylmethylketon 69, welches schneller von der Amindehydrogenase umgesetzt wird als para-Methylacetophenon.[170,180]
In Abbildung 53 ist das Experiment mit dem neuen Substrat für die reduktive Aminierung dargestellt.
Nach Ablauf der Reaktionszeit wurde ein 31 %iger Umsatz von 1-Phenylethylamin (R)-9 zu Acetophenon 8 nachgewiesen. Damit konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass das selbtsregenerierende Cofaktorsystem funktioniert, denn es sind mehr Äquivalente Acetophenon 8 entstanden, als Cofaktor zu Beginn der Reaktion zur Verfügung stand. Isopropylmethylamin (R)-70 und das korrespondierende Keton 8 konnten im Rohprodukt in Spuren nachgewiesen werden, aber eine Umsatzbestimmung anhand der Integrale im 1H-NMR-Spektrum war nicht sinnvoll. Der Grund liegt wohl in der Art der Aufarbeitung. Nach Abbruch der Reaktion wird die Reaktionmischung mit DCM
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extrahiert und die organische Phase im Vakuum vom Lösungmittel befreit. Sowohl Isopropylmethylketon als auch Isopropylmethylamin sind flüchtige Substanzen, die dem Rohprodukt wahrscheinlich im Vakuum entzogen wurden. Um das Amin auch quantitativ nachzuweisen wären an dieser Stelle Derivatisierungen denkbar, aber diese lagen nicht im Fokus dieser Arbeit. Mit dem eindeutigen Umsatz der Nebenreaktion zur Cofaktorregenerierung aus Abbildung 53 wurde der erfolgreiche Ablauf der oberen Reaktion angenommen und für die weitere Optimierung vorausgesetzt.
Abbildung 53: Enzymatische reduktive Aminierung mit einer Amindehydrogenase mit eigener Cofaktorregenerierung.
Für einen höheren Umsatz wären eine geringere Substratkonzentration oder mehr Amindehydrogenase denkbar. Beides würde zu gigantischen Wassermengen im Vergleich zur Produktmenge führen. Deshalb wurde an dieser Stelle ein Blick auf den Mechanismus geworfen, um mögliche geschwindigkeitsbestimmende Teilschritte zu finden. In dem von Sekimoto et al.[78] vorgeschlagenen Mechanismus gibt es zwei chemische Teilschritte. Zum einen wird das Amin zum Imin oxidiert und darauf folgt die Hydrolyse eines Imins.
Im postulierten Mechanismus folgt nach der Oxidation ein Verweilen des reduzierten Cofaktors in der Nähe des zuvor umgesetzten Substrats. Das heißt sollte einer dieser Schritte langsam erfolgen, kann durch Veränderung von Substratkonzentrationen kein Einfluss genommen werden. In einem auflösenden Schritt (siehe Abbildung 54 oben rechts) werden alle Substrate ausgetauscht und es werden keine Angaben bezüglich der Reihenfolge des Ein- und Austritts der Substrate aufgeführt. Auch bezüglich der Austauschsgeschwindigkeit wurden keine Ergebnisse abgebildet. Im einfachsten Fall könnte der Ammoniak als kleines Molekül vielleicht am schnellsten aus dem aktiven Zentrum diffundieren, während der Cofaktor aufgrund seiner Größe eher langsam aus dem Enzym diffundiert.
Für die gewünschte eigene Cofaktorregenerierung ist die mögliche Mobilität von Ammoniak ungünstig, weil er widerum für die reduktive Aminierung der Carbonylverbindung essentiell ist. Im folgenden Experiment wurde neben dem Aminäquivalent auch ein Überschuss Ammoniak zugegeben, um nach obiger Hypothese die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen, dass das Enzym und Ammoniak aufeinandertreffen.
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Abbildung 54: Vorgeschlagener Mechanismus für Leucindehydrogenasen.[78]
Abbildung 55 zeigt, dass Ammoniak im Überschuss zu einer Verdreifachung des Umsatzes vom Cosubstrat führt. Er beschleunigt die Reaktion, sodass nach 48 h ein 96 % des eingesetzten Cosubstrats (R)-9 in Form von Acetophenon 8 detektiert wurden.
Abbildung 55: Enzymatische reduktive Aminierung mit einer Amindehydrogenase mit eigener Cofaktorregenerierung.
Mit dieser Reaktion scheinen Bedingungen gefunden worden zu sein, mit denen weiter im Hinblick auf ein neues innovatives selbstregenerierendes Amindehydrogenasesystem gearbeitet werden konnte. Im
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letzten Experiment wurde keines der in Abbildung 51 vorgestellten Konzepte zur Verschiebung des chemischen Gleichgewichts angewandt. Prinzipiell hätte die Reaktion bei anderen thermodynamischen Eigenschaften der Substrate auch gar nicht ablaufen können, wobei 1-Phenylethylamin (R)-9 aus anderen Arbeiten[183] bereits als guter Amindonor bekannt ist. Deshalb sollten als nächstes die in Abbildung 51 vorgestellten Kandidaten untersucht werden. Auf der einen Seite ein endständiges primäres Amin, welches nach oxidativer Deaminierung via Autoxidation irreversibel in eine Carbonsäure überführt wird und auf der anderen Seite Isopropylamin. Das Koppelprodukt Aceton kann mit seiner Flüchtigkeit in situ verdampft werden und so das Gleichgewicht auf die Seite der Produkte verschieben.
Als erstes wurde Butylamin 71 als mögliches Substrat untersucht. Dazu wurden Acetophenon 8 und Butylamin 71 als Substrate für die AmDH vorgelegt und in dem oben beschriebenen System inkubiert (siehe Abbildung 56). Nach 48 h kann weder 1-Phenyethylamin (R)-9 noch der korrespondierende Aldehyd 72 bzw. die daraus entstandene Säure 73.
Abbildung 56: Reduktive Aminierung mit AmDH und Butylamin 71 als Amindonor.
An dieses Experiment wurde eine Biotransformation mit Hexylamin als Reduktionsäquivalent angeschlossen mit demselben Ergebnis. Weder 1-Phenylethylamin (R)-9 noch die Carbonylanaloga wurden nach der Reaktion wiedergefunden. Scheinbar stellen endständige Amine keine Substrate für die verwendete Amindehydrogenase dar.
Leicht strukturverwandt zu dem sehr gut akzeptierten Isopropylmethylamin 70 ist Isopropylamin 6. Im nächsten Experiment wird neben dem Substrat Acetophenon 8 Isopropylamin 6 als Redoxäquivalent und Stickstoffdonor eingesetzt (siehe Abbildung 57).
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Abbildung 57: Reduktive Aminierung mit AmDH und Isopropylamin 6 als Amindonor
Nach 48 h kann ein Umsatz von 17 % des Acetophenons 8 zum gewünschten Amin (R)-9 detektiert werden. Damit kann auch ein attraktives Cosubstrat erfolgreich in dem neuen 1-Enzymsystem der AmDH erfolgreich umgesetzt werden.
Die aufgezeigte Reaktionsführung stellt einen erfolgreichen proof of concept dar, wird aber für eine Tandemreaktion im Sinne der formalen Hydroaminierung nicht eingesetzt aufgrund des geringen Umsatzes und der hohen Katalysatormenge. Obwohl der Umsatz noch zu gering ist, um ein syntethische Interesse zu wecken, kann mit dem Konzept kombiniert mit verfahrenstechnischen Lösungen wie in situ Destillation des Acetons in kurzer Zeit eine attraktive Synthesestrategie entstehen.
Die Ursache für den geringen Umsatz kann nach der obigen Diskussion mehrere Ursachen haben.
Aceton kann auf der einen Seite ein thermodynamisch weniger bevorzugtes Produkt sein. Eine andere Begründung wäre die deutlich geringere Aktivität der Amindehydrogenas gegenüber der Austauschreaktion Isopropylamin-Aceton. Aus technischer Sicht wäre dem ersten Fall leicht entgegenzuwirken, indem das entstehende Aceton in situ verdampft wird. Auf diese Weise wird das Gleichgewicht auf die Seite der Produkte verschoben.
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