7 Cyclische Hexapeptide zur Komplexierung von Erdalkalimetallionen
8.2 Synthese
8.2.1 Allgemeine Versuchsvorschriften
8.2.1.1 Standard-Peptidkupplung AV1261
In einem ausgeheizten Rundkolben werden unter Stickstoffatmosphäre und Eiskühlung äquimolare Mengen an Boc-geschützter und Bzl-geschützter Kupplungskomponente mit 2.5 eq. EDC und 5 eq. HOAt in absolutem CH2Cl2 suspendiert. Die Reaktionsmischung wird im Eisbad gerührt und über Nacht auf RT erwärmt. Nach 16 h wird der Ansatz mit CHCl3 auf doppeltes Volumen verdünnt und je dreimal mit 1 M HCl-Lösung, ges. NaHCO3-Lösung und Wasser extrahiert. Die org. Phase wird über Na2SO4 getrocknet, filtriert und einrotiert. Die weitere Reinigung des Produktes erfolgt durch Säulenchromatographie.
8.2.1.2 Benzylester (Bzl) –Abspaltung AV2262
Das an der Carboxylfunktion geschützte Peptid wird unter N2-Schutz je nach Löslichkeit in absolutem MeOH (20 ml/mmol Peptid) oder DMF (20 ml/mmol Peptid) gelöst und mit Palladium auf Aktivkohle (Pd-C, 160 mg/mmol Peptid) versetzt. Mittels Hydrierballon wird der Ansatz unter H2-Atmosphäre gesetzt und 2 – 24 h bei RT gerührt, wobei das Ende der Reaktion durch DC-Kontrolle ermittelt wird. Zur Abtrennung des Katalysators wird Kieselgur zugegeben und filtriert. Das Lösungsmittel wird über eine Kühlfalle abgezogen. Der erhaltene Feststoff wird in CH2Cl2 gelöst und bis zur beginnenden Trübung mit PE 40/60 versetzt. Die vollständige Fällung erfolgt über Nacht im Kühlschrank. Das entschützte Peptid wird abgesaugt und im ÖV getrocknet. Das Produkt wird in der Regel ohne weitere Reinigung und Charakterisierung umgesetzt.
261 a) D. L. Boger, M. W. Ledeboer, M. Kume, M. Searcey, Q. Jin, J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 11375;
b) L. A. Carpino, A. El-Faham, F. Albericio, J. Org. Chem. 1995, 11, 3561.
262 S. Gangwar, G. Pauletti, T. Siahaan, V. Stella, R. Borchardt, J. Org. Chem. 1997, 5, 1356.
8.2.1.3 Abspaltung der tert.-Butyloxycarbonyl (Boc) -Schutzgruppe AV3263
Das Boc-geschützte Peptid wird unter Eiskühlung in HCl-gesättigtem EtOAc (80 ml/mmol Peptid) gelöst und 15 min gerührt. Anschließend wird das Eisbad entfernt und solange bei RT gerührt bis kein Edukt mehr vorliegt (DC-Kontrolle). Während der Reaktion beginnt das Produkt im Normalfall als Feststoff auszufallen. Zur vollständigen Fällung wird der Ansatz nach beendeter Reaktion mit PE 40/60 auf dreifaches Volumen verdünnt. Der Niederschlag wird abgesaugt und intensiv mit eiskaltem EtOAc gewaschen. Zur weiteren Reinigung wird das Produkt in wenig siedendem MeOH gelöst und bis zur beginnenden Trübung mit PE 40/60 versetzt. Nach Abkühlung auf RT und vervollständigter Fällung im Eisbad wird das entschützte Peptid abgesaugt und am ÖV getrocknet. Das Produkt wird in der Regel ohne weitere Reinigung und Charakterisierung umgesetzt.
8.2.1.4 Festphasensynthese von Peptiden nach der Fmoc–
Schutzgruppenstrategie AV4264
• Kupplung von Fmoc-geschütztem Glycin an Tritylchlorid-Polystyrol (TCP) -Harz265
1 g TCP–Harz (maximale Belegung ca. 1 mmol/g Harz)266 wird mit 535 mg (1.80 mmol) Fmoc-Gly-OH und 470 µl (349 mg, 2.70 mmol) DIEA in 10 ml CH2Cl2
suspendiert. Nach 5 min werden weitere 1.10 ml (816 mg, 6.31 mmol) DIEA zugesetzt und 12 h bei RT gerührt. Anschließend wird 1 ml MeOH zugegeben und weitere 60 min gerührt. Danach wird das Harz abgesaugt und nacheinander mit CH2Cl2, NMP und MeOH intensiv gewaschen. Nach Trocknen am ÖV wird der Belegungsgrad gravimetrisch nach folgender Formel bestimmt:
263 a) L. Tomasic, G. P. Lorenzi, Helv. Chim. Acta 1987, 70, 1012;
b) D. L. Boger, J. Zhou, Bioorg. Med. Chem. 1996, 10, 1597.
264 a) M. A. Dechantsreiter, E. Planker, B. Mathä, E. Lohof, G. Hölzemann, A. Jonczyk, S. L.
Goodman, H. Kessler, J. Med. Chem. 1999, 42, 3033;
b) G. B. Fields, R. L. Noble, Int. J. Pept. Protein Res. 1990, 35, 161.
265 K. Barlos, O. Chatzi, D. Gatos, G. Stavropoulos, Int. J. Pept. Protein Res. 1991, 37, 513.
266 Das Harz besitzt eine Korngröße von 100-200 mesh.
N = (m2– m1)·1000
(MGFmoc-Gly-OH– MGHCl)· m2
N = Harzbelegung [mmol/g]
MGFmoc-Gly-OH = 297.31 g/mol MGHCl = 36.46 g/mol
m2 = Harzgewicht nach der Belegung m1 = Harzgewicht vor der Belegung
• Peptid-Festphasensynthese
Die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe der harzgebundenen Aminosäure bzw. des harzgebundenen Peptids und die Kupplung einer weiteren Fmoc-Aminosäure erfolgt nach folgendem Schema:
Operation Reagentien (15 ml / g Harz) Zeit [min] Anzahl
1 Quellung NMP 30 1
2 Entschützen 20 % Piperidin in NMP 10 1
3 Waschen NMP 1 1
4 Entschützen 20 % Piperidin in NMP 20 1
5 Waschen NMP 1 10
6 Kuppeln Fmoc-AS, TBTU, HOBt, DIEA, NMP oder
Fmoc-AS, HATU, HOAt, Collidin, NMP
120 1
7 Waschen NMP 1 3
8 Kuppeln Fmoc-AS, TBTU, HOBt, DIEA, NMP oder
Fmoc-AS, HATU, HOAt, Collidin, NMP
90 1
9 Waschen NMP 1 5
10 Waschen CH2Cl2 1 5
11 Trocknen ÖV
Die Schritte 10 und 11 erfolgen nur, wenn die Peptid-Festphasensynthese für mehrere Tage unterbrochen wird oder beendet ist.
Die Kupplung der Fmoc-Aminosäuren erfolgt entweder mit TBTU oder HATU nach folgender Methode:267
Je 3 eq. Fmoc-Aminosäure , 3 eq. Kupplungsreagens (TBTU bzw. HATU), 3 eq.
Additiv (HOBt bzw. HOAt) und 8.4 eq. DIEA (bei TBTU) bzw. 30 eq. Collidin (bei HATU) werden in NMP gelöst, zum N-terminal entschützten Peptidyl-Harz gegeben und 120 bzw. 90 min geschüttelt.
• Peptidabspaltung vom TCP-Harz268
Das peptidbeladene TCP-Harz wird 30 min in CH2Cl2 gequollen. Anschließend wird eine Mischung aus CH2Cl2/HOAc/TFA = 4/1/1 (15 ml / g Harz) zugegeben und 90 min geschüttelt. Die Peptidabspaltung wird noch zweimal wiederholt und die vereinigten Filtrate unter mehrmaliger Zugabe von Toluol am Rotationsverdampfer bis zur Trockne eingeengt. Der erhaltene Feststoff wird in einer Mischung von MeOH/PE 40/60 = 1/1 suspendiert, intensiv im Ultraschallbad behandelt und abgesaugt. Das Produkt wird in der Regel ohne weitere Reinigung und Charakterisierung umgesetzt.
8.2.1.5 Standard-Peptidcyclisierung AV5261a, 269
Das vollständig entschützte lineare Peptid wird unter N2-Atmosphäre in einer Konzentration von 7·10-4 M in DMF gelöst, mit 1.5 eq. HATU, 1.5 eq. HOAt sowie 10 eq. Collidin versetzt und 20 h bei RT gerührt. Danach wird die Reaktion abgebrochen und das Lösungsmittel bei 50 °C über eine Kühlfalle abgezogen. Der zurückbleibende Rückstand wird in MeOH aufgeschlämmt, intensiv im Ultraschallbad behandelt und abgesaugt. Die Reinigung des Produktes erfolgt mittels semipräparativer HPLC.
267 Die Peptid-Festphasensynthesen werden in handelsüblichen 10 ml Einmalspritzen der Firma Braun mit eingelegten Filterplättchen der Firma Vetter durchgeführt.
268 Zur besseren Durchmischung wird die Peptidabspaltung in einem Rundkolben mit Magnetrührfisch durchgeführt.
269 A. Ehrlich, H.-U. Heyne, R. Winter, M. Beyermann, H. Haber, L. A. Carpino, M. Bienert, J. Org.
Chem. 1996, 61, 8831.