Aktivierung fieberrelevanter ZNS-Strukturen nach Injektion von FSL-1

3.4.1 Nukleäre Translokation des Transkriptionsfaktors STAT3 nach systemischer Stimulation von Meerschweinchen mit FSL-1

Für diese Versuchsreihe wurden insgesamt fünf Tiere eingesetzt. Drei von ihnen wurde FSL-1 in einer Dosierung von 100 µg/kg i.a. injiziert und die Tiere dann nach 120 Minuten perfundiert und die Gehirne entnommen. Als Kontrolle dienten zwei weitere Tiere, denen 1 ml/kg PBS injiziert wurde. Um sicherzustellen, dass die FSL-1 behandelten Tiere Fieber bekamen, wurde im Zeitraum von -120 bis +120 Minuten, also bis zum Zeitpunkt der Perfusion, mit Hilfe der intraperitonealen Sender (2.1.4) die Körperkerntemperatur aufgezeichnet (nicht dargestellt). Außerdem wurde von den Tieren vor der Perfusion noch eine Blutprobe zur Ermittlung des aktuellen IL-6-Spiegels genommen. Die Fieberkurven und gemessenen IL-6-Werte entsprachen den in 3.1.1.1.1 bzw. 3.1.1.2.2 beschriebenen Ergebnissen. Anhand der durchgeführten Immunhistochemie sollte nun gezeigt werden, ob das im Blut zirkulierende IL-6 zur Aktivierung von Zellen über den Transkriptionsfaktor

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STAT3 und damit möglicherweise zur Entstehung von Fieber beiträgt. Die Regionen, denen in dieser Hinsicht besonders viel Beachtung geschenkt wurde, waren die in 1.8.2.1 beschriebenen CVOs, denen eine Blut-Hirn-Schranke fehlt. Hierzu zählen das Organum vasculosum laminae terminalis (OVLT), das Subfornicalorgan (SFO) und die Area postrema (AP), weil diese Regionen verglichen mit den Kontrollgruppen die stärksten nukleären Translokationen von STAT3 aufwiesen. Es wurden auch weitere Strukturen wie etwa der Plexus chorioideus, die Eminentia mediana oder der Nucleus arcuatus analysiert, allerdings gab es dort nur eine sehr schwache und undeutliche Expression von nukleären STAT3 Signalen. Daher wurden sie im Weiteren nicht berücksichtigt. In Abbildung 39 sind in einem schematischen Querschnitt durch das Gehirn diese Strukturen zu lokalisieren. Zudem konzentrierte sich die Auswertung der STAT3-Signale auf Endothelien, die natürlich im gesamten Gehirn zu finden waren. Auch bei den Kontrolltieren fanden sich vor allen Dingen in den Meningen und im Endothel des Cortex immer einige wenige zytoplasmatische und nukleäre STAT3-Signale.

Abbildung 39: Die Abbildung zeigt einen schematischen Querschnitt des Gehirns. Die rot gekennzeichneten Areale gehören in die Gruppe der CVOs, die bis auf das Subcommissural-Organ (SCO), keine Blut-Hirn-Schranke besitzen. (ME-Median Eminence, PIN-Pineal Gland, SFO-Subfornicalorgan, OVLT-Organum vasculosum laminae terminalis, AP-Area postrema, NL-Neurohypophyse)

Die Teilergebnisse der Immunhistochemie sind in Abbildung 40 dargestellt. Es handelt sich um die drei oben beschriebenen Regionen in verschiedenen Vergrößerungen. In der linken

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Spalte befinden sich Bilder der Gehirnschnitte von Kontrolltieren, die PBS i.a. erhielten, in der rechten Spalte Bilder von Gehirnschnitten der Tiere, die mit FSL-1 i.a. stimuliert waren.

Im direkten Vergleich ist deutlich zu erkennen, dass die Applikation von PBS keine oder nur sehr wenige nukleäre STAT3-Translokationen hervorrief. Die Applikation von FSL-1 i.a.

hingegen resultierte in einer Zunahme der STAT3-positiven Zellkerne, das gilt insbesondere für die AP und das OVLT. Während die Verteilung der Signale im OVLT und SFO eher homogen war, fanden sie sich in der AP vor allem in den Randbereichen. Von allen CVOs fand sich im SFO die niedrigste Dichte an STAT3 positiven Zellkernen.

PBS

FSL-1

Abbildung 40: Dargestellt sind hier die drei sensorischen CVO´s: OVLT, SFO und AP. Die linke Spalte zeigt die genannten Areale nach der Kontrollinjektion mit PBS. Als Marker wurden

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eingesetzt (von oben nach unten:) NeuN, GFAP und wiederum GFAP. In der rechten Spalte sind diese Regionen 120 Minuten nach Stimulation der Tiere mit FSL-1 i.a. gezeigt. Hier wurden von oben nach unten folgende Marker verwendet: vW, wiederum vW und GFAP. Es lässt sich erkennen, dass es bei den stimulierten Tieren deutliche STAT3-Signale (rot) in den CVO´s auftraten, während bei den Kontrolltieren sehr wenige bis gar keine STAT3-Signale zu erkennen waren. Am ehesten fanden sich Signale im OVLT und in der AP. Blau gefärbt sind die Zellkerne, grün sind die Endothelzellen, Neurone, bzw. Astrozyten.

Zusammenfassend kann man sagen, dass die nukleäre STAT3-Translokation in den CVOs des Meerschweinchens im Zusammenhang mit den zirkulierenden Konzentrationen an IL-6 zu stehen scheint, d.h. die Translokation erfolgte korrespondierend zu den ansteigenden IL-6-Werten nach Stimulation mit FSL-1 i.a.

3.4.2 Kolokalisation der nukleären STAT3 Translokation mit verschiedenen zellulären Phänotypen

Um zu ermitteln, welche verschiedenen Zelltypen durch FSL-1 induziertes IL-6 zu einer nukleären STAT3-Translokation angeregt werden, wurde der immunhistchemische Nachweis der Kolokalisation nukleärer STAT3-Signale mit Markerproteinen verschiedener Gehirnzellphänotypen durchgeführt.

3.4.2.1 vW positive Endothelzellen

Endotheliale STAT3 Signale konnten im ganzen Gehirn nachgewiesen werden. Abbildung 41 zeigt oben links einen mittels Immunfluoreszenz angefärbten Schnitt im Bereich des Cortex.

Hier wurde ein Endothel angeschnitten, in dem man durch die Übereinanderlagerung der Aufnahmen eine Kolokalisation der STAT3-Signale in den Zellkernen von Endothelzellen erkennen kann. Die roten Signale in den blau gefärbten Zellkernen der grünen Endothelzellen sind besonders auf der 100fachen Vergrößerung gut erkennbar. Das Gehirnendothel scheint also eine erste und bedeutende Zielstruktur des durch FSL-1 induzierten IL-6 zu sein. Auch in Endothelzellen im Bereich der CVOs waren nukleäre STAT3-Signale nachweisbar.

Exemplarisch ist dies für das OVLT in Abbildung 41 dargestellt.

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145 3.4.2.2 GFAP –positive Astrozyten

Obwohl es auch im Cortex eine beträchtliche Zahl an Astrozyten gibt, gab es scheinbar nur in den CVOs Kolokaliationen mit STAT3-Signalen. Im Cortex schienen hauptsächlich die Endothelzellen Angriffspunkt für FSL-1 induziertes IL-6 und der damit verbundenen Aktivierung von STAT3 zu sein. Astrozytäre Kolokalisationen waren generell viel seltener zu finden als endotheliale. In Abbildung 41 sind vereinzelte aktivierte Astrozyten in den CVOs (hier: OVLT und AP) zu erkennen.

Abbildung 41: Die beide oberen Abbildungen zeigen die Kolokalisation von nukleären (Zellkerne=blau, DAPI) STAT3-Signalen (rot) mit dem endothelialen Marker vW (grün) 120 Minuten nach Stimulation der Tiere mit FSL-1 i.a. Das linke Bild zeigt ein Endothel aus dem Cortex, das rechte ein Endothel aus dem OVLT. Die beiden unteren Abbildungen zeigen die Kolokalisationen von nukleären STAT3-Signalen mit dem astrozytären Marker GFAP (grün).

Das linke Bild zeigt das OVLT, das rechte die AP.

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146 3.4.2.3 NeuN-positive Zellen

Um zu überprüfen, ob in den sensorischen CVOs auch Neurone über den STAT3-Signalweg nach i.a. Injektion von FSL-1 aktiviert werden, wurden Kolokalisationsstudien von STAT3 mit dem neuronalen Zellmarker NeuN durchgeführt.

Der verwendete neuronale Marker griff aber leider bei den verwendeten Versuchstieren nicht in den CVOs (daher sind diese Bilder nicht dargestellt). In anderen Regionen konnten allerdings Neurone mit dem Marker nachwiesen werden (siehe Abbildung 40). Studien an Ratten und Mäusen belegen eindeutig die Anwesenheit dieser Zellen in den entsprechenden Regionen. Warum sie also nur dort beim Meerschweinchen nicht markiert wurden, bleibt zunächst offen. Daher konnte in der vorliegenden Studie auch keine Aussage über eine eventuelle Lokalisation von nukleären STAT3-Signalen in Neuronen gemacht werden, umgekehrt ist es natürlich nicht auszuschließen, dass es solche gibt.

3.5 Toleranzerscheinungen gegenüber wiederholter Stimulation mit FSL-1 und