UNIVERSITÄTSKLINIKUM HAMBURG-EPPENDORF
Institut für Pathologie Prof. Dr. med. Guido Sauter
Gewebearray-basierte immunhistochemische Untersuchung
von synovialen Biopsien
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin an der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg.
vorgelegt von: Felicitas Enneking
aus Lohne Hamburg 2014
Angenommen von der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg am:
10.07.2015
Veröffentlichung mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät der Universität Hamburg am:
Ergänzt
Prüfungsausschuss, der/die Vorsitzende:
Prof. Dr. Guido Sauter
Prüfungsausschuss, zweite/r Gutachter/in:
Prof. Dr. Andreas Niemeier
Prüfungsausschuss, dritte/r Gutachter/in:
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ... 3
Abbildungsverzeichnis ... 6
Tabellenverzeichnis ... 7
1. Einleitung ... 9
1.1. Einführung in die Pathognomie der drei Krankheitsbilder ... 11
1.2. Forschungsüberblick ... 11
1.3. Fragestellung/Hypothesen ... 18
2. Material und Methoden ... 20
2.1. Material- und Stichprobenbeschreibung ... 20
2.2. Patientenkollektiv ... 21 2.3 Histologie ... 23 2.4. Immunhistochemie ... 25 2.4.1. CD3 ... 25 2.4.2. CD8 ... 26 2.4.3. CD20 ... 27 2.4.4. CD25 ... 27
2.4.5. FoxP3 ... 28
2.5. TMA- Herstellung ... 29
2.6. Statistische Auswertung ... 30
3. Resultate ... 32
3.1. Mittelwerte der Zellzahlen der einzelnen Marker nach Gruppe ... 32
3.2. Tests auf Alters- und Geschlechtsabhängigkeit der Zellzahlen bzw. Expressionen ... 43
4. Diskussion ... 48
4.1. Die Eignung des TMA-Verfahrens zur Diagnostik ... 48
4.2. Limitationen dieser Studie und Ausblick ... 54
5. Zusammenfassung ... 55 6. Literaturverzeichnis ... 56 7. Abkürzungsverzeichnis ... 60 8. Danksagung ... 61 9. Lebenslauf ... 62 Anhang 1 ... 63 Anhang 2 ... 66 Anhang 3 ... 69
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Fertiger TMA mit unterschiedlichem Durchmesser ... 10
Abbildung 2: Schema möglicher Interaktionen im synovialen Gewebe (aus: Lundy et al. 2007) ... 17
Abbildung 3: Geschlechtsverteilung in den Studienkollektiven ... 21
Abbildung 4: Altersverteilung über das gesamte Patientenkollektiv ... 22
Abbildung 5: Fertiger TMA mit Auswertungsbogen ... 30
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Gruppenspezifische Mittelwerte und Streuungen der drei unterschiedlichen Färbeverfahren nach Gruppen. ... 33 Tabelle 2: Mittelwerte und Standardabweichungen der Zellzahlen nach Gruppen .... 34 Tabelle 3: Signifikanztests zwischen Markern und allen Krankheitsbildern ... 36 Tabelle 4: Paarvergleich der Zellzahlen zwischen low grade- RA und high grade -RA ... 37 Tabelle 5: Paarvergleich der Zellzahlen zwischen low grade- RA und RA mit Granulom ... 38 Tabelle 6: Paarvergleich der Zellzahlen zwischen low grade- RA und CPPD ... 38 Tabelle 7: Paarvergleich der Zellzahlen zwischen low grade- RA und PSA ... 39 Tabelle 8: Paarvergleich der Zellzahlen zwischen high grade- RA und RA mit Granulom ... 40 Tabelle 9: Paarvergleich der Zellzahlen zwischen high grade- RA und CPPD ... 40 Tabelle 10: Paarvergleich der Zellzahlen zwischen high grade- RA und PSA ... 41 Tabelle 11: Paarvergleich der Zellzahlen zwischen RA mit Granulom und CPPD .... 42 Tabelle 12: Paarvergleich der Zellzahlen zwischen RA mit Granulom und PSA ... 42 Tabelle 13: Paarvergleich der Zellzahlen zwischen CPPD und PSA ... 43
Tabelle 14: Ergebnisse der semiparametrischen Korrelationsanalyse nach Spearman ... 46
1. Einleitung
Im histologischen Bild der Synovialitis ist ein großes Spektrum entzündlicher Erkrankungen erkennbar (Krenn 2005). Ebenso vielfältig ist das Spektrum der daran beteiligten zellulären und humoralen Bestandteile des Immunsystems. In der Pathogenese teilweise noch unverstanden, kommt es bei vielen dieser Krankheitsbilder in diesem Bereich nicht nur zu klinischen, sondern auch zu pathophysiologischen Überschneidungen.
Mit dieser Arbeit soll überprüft werden, ob sich beim Studium von chronisch entzündlichen Infiltraten der Synovia mittels der Tissue Micro Array- Technik die
Subpopulationen von entzündlichen Zellelementen statistisch signifikant
unterscheiden lassen. Das Mikroarray Verfahren ermöglicht eine histologische high throughput- Analyse von bis zu 1000 unterschiedlichen Gewebeproben auf einem Objektträger unter standardisierten Bedingungen. In der Tumordiagnostik ist das TMA- Verfahren bereits seit Jahren anerkannt (Simon et al. 2010). Im Vergleich mit den zellreichen monoklonalen Tumorinfiltraten ist das zelluläre Bild der Synovialitiden dagegen weit vielfältiger. Große Areale von Nekrosen im Gewebe und in den Granulomen bei der Rheumatoiden Arthritis sowie eine lokal sehr variable Ausbreitung der Entzündungszellen erschweren die Diagnostik. Um diesem Umstand Rechnung zu tragen und um größere Gewebsabschnitte als beim Studium von Tumorgewebe untersuchen zu können, habe ich in meiner Arbeit eine Stanze mit einem Durchmesser von 2,0 mm verwendet. Die bisher in der Tumordiagnostik angewendete Stanze hat hingegen einen Durchmesser von 0,6mm.
Abbildung 1: Fertiger TMA mit unterschiedlichem Durchmesser der Stanze
Die zentrale Hypothese dieser Arbeit besagt, dass die Tissue Mikroarray- Technologie eine geeignete Methode zur Analyse der Pathogenese von nicht neoplastischen, chronisch entzündlichen Gelenkerkrankungen ist. Unter Einsatz von durchschnittlich 2.0 mm großen Punktionszylindern müssten sich innerhalb dieser entzündlichen Infiltrate daher statistisch signifikante Unterschiede nachweisen lassen.
Die in dieser Arbeit verwendeten Synovialisproben stammen von Patientendaten aus dem Archiv der Osteopathologie in Form von Gewebeblöcken, die den Krankheitsbildern Rheumatoider Arthritis, Psoriasis-Arthritis und der Calcium-pyrophosphatdihydrat- Ablagerungserkrankung CPPD zuzuordnen sind. Bestandteil dieser Arbeit ist auch das Darstellen und Aufschlüsseln der aktuellen Kenntnisse
über die pathologischen Mechanismen der drei hier untersuchten Krankheitsbilder. Durch die Mikroarray-Methode konnten insgesamt 126 Gewebeproben der
beschriebenen Krankheitsbilder auf einem Objektiv vereint werden. Ziel dieser Arbeit soll zum einen sein, den Nutzen und die Validität der Mikroarray- Technik im Bereich
nicht maligner Erkrankungen zu veranschaulichen.
Zum anderen sollen Zusammenhänge und Unterschiede in der Immunpathologie der einzelnen Krankheitsbilder dargestellt und damit ein Beitrag zum weiteren Verständnis der Differentialdiagnostik und evtl. zur zukünftigen Therapie von entzündlichen Synovialitiden geliefert werden.
1.1. Einführung in die Pathognomie der drei Krankheitsbilder
Bei der Rheumatoiden Arthritis, einer chronisch entzündlichen Autoimmun-erkrankung, ist die chronische Synovialitis typisch. Die Prävalenz liegt bei 1% der Erwachsenen und im Verhältnis von Frauen zu Männern bei 3:1 (Herold 2013). Die genauen Mechanismen, durch die eine rheumatoide Synovialitis ausgelöst wird, sind ungeklärt. Dennoch existieren Theorien zum Ablauf der dabei beteiligten immunologischen Vorgänge.
Demnach werden sowohl antigenspezifische als auch antigenunspezifische Vorgänge diskutiert. Im Zentrum dieser Theorien steht die Ausbildung sogenannter autoreaktiver T-Lymphozyten. Die frühen Mechanismen, durch die die spezifische T- und B-Zell Toleranz gebrochen wird, sind wenig festgelegt, treten aber, wahrscheinlich durch fehlerhafte Selektion im Thymus oder in der Peripherie, auf einer systemregulatorischen Ebene auf (McInnes und Schett 2007). Ein Mechanismus der antigenunspezifischen Aktivierung läuft über „Pathogen associated-molecular-patterns“, die über die entsprechenden Rezeptoren (pathogen recognition receptors) der Effektoren die angeborene Immunantwort aktivieren.
Dabei spielen insbesondere die B-Zellen durch ihre Antigen präsentierenden Eigenschaften eine gesonderte Rolle (Nüßlein 2004).
Die aus den obigen Vorgängen resultierende Autoimmunität, welche sich in der Produktion von Antikörpern gegen IgG oder dem „cyclic citrullinated peptide“ manifestiert, geht dem klinisch messbaren Anfang der entzündlichen Arthritis um Jahre voraus (McInnes 2007 und Firestein 2003). Auf der Basis dieser so im Verlauf der Jahre persistierenden Autoimmunität führt ein untergeordneter Prozess in den Gelenken dann zur Manifestation der synovialen Entzündung und damit zur klinischen Auffälligkeit. Der ausschlaggebende Anstoß für den Beginn der artikulären Phase ist unbekannt, beinhaltet aber wahrscheinlich biochemische Faktoren, neuro-immunologische Interaktionen und eine veränderte Durchblutung in den betroffenen Gelenken. Umweltfaktoren haben ebenfalls einen Effekt auf die Induktion, auf das Ausmaß und den Grad der Progression der Erkrankung. Obwohl zahlreiche infektiöse Organismen in Verdacht stehen, ergeben aktuelle Studien, dass insbesondere das Rauchen als ein wichtiger Faktor für die Entwicklung der Erkrankung in HLA-DR 4 positiven Individuen von Bedeutung wirkt (McInnes und Schett 2007).
Neuste Erkenntnisse besagen, dass in der Krankheitsentstehung Zytokine einen weiten Bereich der entzündlichen Prozesse in der Krankheitsentstehung regulieren (McInnes und Schett 2007). Ein Ungleichgewicht zwischen pro- und anti- entzündlicher Zytokinaktivität begünstigt die Induktion von Autoimmunität sowie die Progredienz chronischer Entzündung und die darauf folgende Gelenkdestruktion. Einen wichtigen Bestandteil zur Erhaltung dieses Gleichgewichts stellen die regulatorischen T-Zellen dar (McInnes und Schett 2007). Diese sind eine
Subpopulation der T-Zellen, der eine besondere Bedeutung bei der immunmodulatorischen Regulation bei diverseren Erkrankungen zukommt. Sie werden für eine regulatorische Effektorfunktion verantwortlich gemacht und anhand
der Oberflächenmarker CD4+CD25+ identifiziert.
Ungefähr 0,05 % der gesamten Bevölkerung ist von einer Psoriasis-Arthritis betroffen und 6-20 % der Patienten mit einer Psoriasis entwickeln eine chronisch entzündliche Arthritis (PSA). Unterschiede in den Verläufen der PSA zu anderen entzündlichen Arthritiden wie der RA sind kaum festgestellt worden. (Hueber und McInnes 2007). „Die Calciumpyrophosphatdihydrat-Kristallarthropathie (CPPD) ist durch Ablagerung von Calciumpyrophosphatdihydrat (CPPD)- Kristallen in Fasern- und hyalinen Knorpeln, Gelenkkapseln und periartikulären Weichteilstrukturen gekennzeichnet und mit einem vielfältigen klinischen Spektrum entzündlicher, degenerativer und gelegentlich destruktiver Gelenk- und Wirbelsäulenmanifestationen einschließlich neurologischer Komplikationen und seltener tumorartiger Weichteilverkalkungen assoziiert.“ (Schneider und Schneider 2004). Grundlage dieser Erkrankung ist eine genetische und erworbene Dysregulation im Pyrophosphatstoffwechsel der Knorpelzelle (Schneider und Schneider 2004, Keitel 1993). Es kommt zu einer Entzündungsreaktion: „CPPD crystals can induce a vigorous inflammatory response in the joint, inducing the release of catabolic cytokines and proteases from neutrophils and monocytes.“ (Landis und Haskard 2001). „Intrasynovial werden die mit Immunglobulinen, Komplementfaktoren und von weiteren Proteinen besetzten CPPD-Kristalle von polymorphkernigen Leukozyten und Monozyten phagozytiert. Nach der Endozytose und dem Abbau der Proteinhülle führt die membranolytische Eigenschaft der Kristalle zur Zerstörung der Phagolysosomen und zu der Freigabe
lysosomaler Enzyme und Zellautolyse. Die Aktivierung von multiplen Zytokinen des Gerinnungs-, Komplement-, Plasmin und Kininsystems folgt nach.“ (Schneider und Schneider 2004).
Zusammenfassend ist die RA sowie die Psoriasis-Arthritis eine Autoimmunkrankheit, die sich durch eine akute bis chronisch systemische und lokale Entzündungsreaktion im Bereich des synovialen Gewebes manifestiert und unbehandelt zu Knochen- und Knorpelschäden führt. Während der synovialen Entzündung spielen viele Einflussgrößen wie Neoangiogenese, zelluläre Hyperplasie und ein massiver Einstrom von entzündlichen Zellen wie T- und B- Zellen, Fibroblasten, Makrophagen und dendritischer Zellen ein Rolle, die in ihrer Interaktion teils unverstanden sind
(Mauri C, Carter N. 2009). Das Gleichgewicht immunsupressiver und
pro-entzündlicher Elemente steht in einer fragilen Beziehung zwischen Toleranz und
Autoimmunität. Eine Schlüsselrolle kommt dabei den CD4+CD25+ T-Zellen mit ihrer
regulatorischen Effektorfunktion zu.
Im Gegensatz dazu präsentiert sich die CPPD als eine Ablagerungserkrankung mit zugrundeliegender Stoffwechselerkrankung. Dabei führt eine natürliche Reaktion des Immunsystems als Antwort auf die CPPD-Kristalle zu einer akuten Entzündung. Eine Autoimmunbeteiligung ist in der Pathogenese bisher nicht bekannt.
1.2. Forschungsüberblick
Konventionelle histologische Gewebeuntersuchungen brauchen viel Zeit und haben eine geringe Kapazität. Daher sind alternative Methoden attraktiv: “Tissue micro array (TMA) has high throughput and uniform reaction conditions and it ensures reagent conservation and reduced damage to donor tissue blocks” (Kjaer-Frifeldt und Lindebjerg 2012).
Die klonale Expansion von Immunzellen, insbesondere von CD4-Zellen, ist ein charakteristischer Befund bei Patienten mit Rheumatoider Arthritis und sie tritt unregelmässig auch bei Patienten mit Psoriasis-Arthritis auf (Schmid et al. 1996). Bereits im Jahre 1996 wurden erhöhte CD4-Zellzahlen diagnostiziert und Studien zur genaueren Subgruppenbestimmung durchgeführt. Untersuchungsmethoden zur Quantifizierung waren dabei DNA-basierte Untersuchungsverfahren wie die PCR (Schmid et al. 1996). Immunhistochemische Untersuchungsmethoden als Grundlage wissenschaftlicher Studien über entzündliche Synovialitiden sind jedoch selten (Pawlowska 2009). Insbesondere weisen solche Studien relativ kleine Fallzahlen auf. So etwa in der Studie von Kennedy et. al.. Sie bezogen dabei 4 Patienten mit OA und 11 Patienten mit RA in die histologische Analyse mit ein (Pawlowska 2009, Kennedy et al. 1998). In der Studie von Sakkas untersuchten die Autoren ebenfalls histologisch die Anzahl von Zellen in der Synovialmembran von RA-Patienten sowie Patienten mit Osteoarthritis. Sie verwandten dabei einzelne Slides, differenzierten jedoch nicht zwischen CD4- und CD8-Zellen und arbeiteten ebenfalls nur mit einer kleinen Fallzahl (Sakkas et al. 1998, Pawlowska 2009). In der synovialen Membran von Patienten mit RA und OA untersuchten Pawlowska et al. im Jahre 2009 die Verteilung von CD4- und CD8- Zellen, indem sie eine Flußzytometrie durchführten,
jedoch auch nur mit einer kleinen Probengroße von 22. Dort blieben die Ergebnisse teils ohne statistische Signifikanz, was nach Angaben der Autoren zum Teil auf die kleine Untersuchungsgruppe zurückzuführen war.
T-Zellen, insbesondere CD4-Zellen und CD8- Zellen, übernehmen bei autoimmuner Entzündung eine zentrale Rolle in der Vermittlung immunmodulatorischer Prozesse.
Als Subgruppen der CD4-Zellen spielen CD4+CD25+-Zellen mit regulatorischen
Fähigkeiten eine besondere Rolle (Skapenko et al. 2005). Bereits vor 30 Jahren wurde über defekte Supressor- oder regulatorische T-Zellen bei Patienten und in Tierversuchen mit entzündlicher Arthritis berichtet (Kayashima 1976, Strelkauskas
1978). Seit neustem ist das Interesse an Treg -Zellen an der Pathogenese und der
Therapie der Erkrankung stärker geworden. Dies ist zum einen auf das genauere Verstehen der Funktionsweise der T-Zellen zum anderen auf die Einführung molekularer Marker wie dem Oberflächenmarker CD25 (Interleukin 2-Rezeptor α) sowie dem Transkriptionsfaktor Forkhead box P3 (FoxP3) zurück zu führen, dem
eine Schlüsselrolle bei der Entwicklung und Funktion von Treg -Zellen zukommt (Peng
2007, Ziegler 2006). Die Subpopulation der Treg -Zellen steht in einem empfindlichen
Gleichgewicht mit weiteren T-Zellen, die genauer als T-Effektor Zellen bekannt sind. Die Hypothesen gehen dahin, dass eine Störung dieses Gleichgewichts in Autoimmunität resultiert bzw. durch diese begünstigt wird.
Abbildung 1 zeigt ein Modell der vermuteten Zusammenhänge unter Berücksichtigung der T-Zellrezeptor-Interaktionen:
Abbildung 2: Schema möglicher Interaktionen im synovialen Gewebe (aus: Lundy et al. 2007)
Empirisch konnte in einer Studie mit 44 RA-Patienten, bei denen die Verteilung der
Treg -Zellen im synovialen Gewebe sowie im Blut als auch im synovialen Serum
gemessen wurde, ein lokales Ungleichgewicht von TH1 und Treg -Zellen
nachgewiesen werden (Behrens et al. 2007). Als Ursache dieses Ungleichgewichtes
wird oftmals ein Defekt in den Treg -Zellen beschrieben. In einer in vivo- Studie, die
den Effekt des Funktionsverlustes des Fox-P3 Gens testete, konnte die klinische
Mäusen, die aufgrund der Produktion hoher Level von pathologischen Antikörpern eine Arthritis entwickelten, reagierten diejenigen Mäuse, die wegen ihrer Mutation
keine Treg -Zellen entwickeln konnten, mit einer schneller fortschreitenden und
aggressiveren Arthritis. Die Erkrankung weitete sich außerdem auf Gelenke aus, die
vorher nicht betroffen waren. Dieses Ergebnis deutet an, dass Treg -Zellen eine Rolle
in verschiedenen Stadien der durch Antikörper vermittelten Arthritis spielen können.
Treg -Zellen können auch die autoimmune Phase der Erkrankung einschränken. Auch
der Schweregrad und das Ausmaß der Entzündung der betroffenen Gelenke
scheinen vom Gleichgewicht bestimmter Treg -Zellen abzuhängen (Nguyen et al.
2007).
1.3. Fragestellung/Hypothesen
Ziel dieser Studie war es, anhand des TMA-Verfahrens, das sehr viele Proben gleichzeitig analysieren kann, die Zahl der unterschiedlichen T-Zellen im synovialen Gewebe bei Patienten mit Rheumatoider Arthritis, Psoriasis-Arthritis sowie mit einer nicht autoimmunologisch bedingten CPPD zu bestimmen.
Dabei weist die Mehrzahl der Studien darauf hin, dass die Anzahl der verschiedenen
T-Zell-Subgruppen (CD4+CD25+, CD8+CD25+) in den autoimmun bedingten
Krankheitsbildern gegenüber gesunden Kontrollen erhöht ist (Buckner 2010). Enge positive Zusammenhänge wurden zwischen der Anzahl von T-Zell-Subgruppen und von FoxP3-Expressionen in Abhängigkeit von dem Grad des Verlaufs bestimmter Autoimmunerkrankungen vorgefunden. So wurden bei Patienten mit der milden Verlaufsform einer juvenilen idiopathischen Arthritis eine höhere Anzahl an
CD4+CD25+- T-Zellen als bei Patienten mit einer schwereren Verlaufsform
vorgefunden. Das Gleiche sah man bei der Expression von
FoxP3-Transkriptionsfaktoren. Eine hohe Anzahl an Treg -Zellen ging mit einer milderen
Verlaufsform der Arthritis einher (Oh et al. 2010).
Daher sollte in dieser Studie bei den autoimmun bedingten Krankheitsbildern der RA
und der Psoriasis-Arthritis ein signifikant höherer Anteil an Treg -Zellen im synovialen
Gewebe nachweisbar sein und zwar in Abhängigkeit von der Chronizität bzw. der
Aktivierung der Erkrankung. Die Anzahl der untersuchten Treg -Zellen sollte im nicht
autoimmunologisch begründeten Krankheitsbild der CPPD dagegen geringer ausfallen. Zudem sollte mit dem hier verwendeten Verfahren der TMA auch eine
signifikant positive Korrelation zwischen den untersuchten Treg -Zellen und dem
FoxP3-Marker gefunden werden. Das würde auch die Validität des hier verwendeten Verfahrens des TMA als immunologischen Nachweis unterstützen.
2. Material und Methoden
2.1. Material- und Stichprobenbeschreibung
Die Patientendaten stammen aus dem Archiv des Osteopathologischen Instituts des Universitätsklinikums Hamburg Eppendorf. In der Osteopathologie wurden seit 1995 bis zum Beginn dieser Arbeit ca. 60000 Fälle bearbeitet. Um eine geeignete Auswahl an Biopsien treffen zu können, wurden aus der Datenbank ca. 3000 Fälle mit der Diagnose einer Synovialitis und der Zusatzdiagnose der Arthritis herausgefiltert. Aus diesem Bestand suchte ich aus praktikablen Gründen 400 Gewebeproben in Form von Gewebeblöcken zufällig heraus. Um die Diagnosen der undifferenzierten Arthritiden zu bestätigen, wurden diese Fälle histologisch neu beurteilt und nach Klinik, tatsächlicher Diagnose, Verwendbarkeit (d.h. Größe der Gewebestücke), nach dem Grad der chronischen Entzündung sowie dem Vorhandensein von Granulomen untersucht und auf eine Anzahl von 126 Fälle reduziert (vgl. 3.2). Die zu stanzenden Areale wählte ich zu jedem Fall aus jeweils einem Paraffinblock aus. Nach der kriteriengeleiteten Auswahl kam es zur Reduktion um weitere 9 Proben mit anderer Hauptdiagnose. Danach fertigte ich den Mikroarray an. Nach der Durchführung des praktischen Teils wurde beim Stanzen in vier Fällen rein nekrotisches Material getroffen. Diese Proben berücksichtigte ich in der endgültigen Auswertung nicht.
2.2. Das Patientenkollektiv
Insgesamt wurden in dieser Studie 113 Fälle ausgewertet. Dabei wurde das Patientenkollektiv in Patienten mit Rheumatoider Arthritis (RA), mit (CPPD) und mit (PSA) unterteilt. Die Geschlechterverteilung beträgt dabei in der RA -Gruppe 76 weibliche und 37 männliche Patienten. Somit entspricht sie etwa der in der Fachliteratur angegebenen durchschnittlichen Prävalenz der RA bei Frauen und Männern im Verhältnis von 3:1 (Herold, 2005) In der Gruppe der CPPD ergibt sich ein Quotient von w:m= 1.75. Aktuellsten Studien zufolge bietet die CPPD keine geschlechtsspezifische Präferenz der unter 60 jährigen, erst im 7. und 8. Lebensjahrzehnt kommt sie 2-7 mal häufiger bei Frauen vor als bei Männern (Schneider und Schneider 2004). Bei der PSA ergab sich in meinem Patientenkollektiv ein Quotient von w:m= 2:1. Abbildung 2 zeigt die Geschlechtsverteilung nach Subgruppen.
0 20 40 60 80 RA PSA CPPD w m
Abbildung 2: Geschlechtsverteilung in den Studienkollektiven
Das durchschnittliche Alter der Patienten der hier verwendeten Fälle betrug 57 (56,76) Jahre. Die PSA- Gruppe war mit einem Durchschnittsalter von 48 (47,8)
Jahren die jüngste, gefolgt von dem RA-Kollektiv mit 56 (55,91) Jahren. Die CPPD wies den höchsten Altersdurchschnitt mit 66 (65,50) Jahren auf. Abbildung 3 zeigt die Altersverteilung über alle Diagnosen.
Abbildung 3: Altersverteilung über das gesamte Patientenkollektiv
Bestandteil eines jeden TMA sind Kontrollen in Form unterschiedlichster Gewebeproben aus sämtlichen Organen des Körpers in doppelter Ausführung. Insbesondere bei den in dieser Arbeit verwendeten Markern, die das Immunsystem betreffen, sind Proben des Lymphatischen Systems, dem Thymus, der Milz und des Knochenmarks obligat. Gleichzeitig gibt es auch Negativproben.
Durch das für den jeweiligen Marker spezifische Anreicherungsmuster in den Organen kann so der Erfolg einer Färbung beurteilt werden.
In vier Gewebeproben des TMA wurde beim Stanzen nekrotisches Material getroffen. Dabei handelte es sich um zellfreies abgestorbenes Gewebe. Dementsprechend sind die Marker für alle Zellen negativ, so dass diese Proben aus der Analyse ausgeschlossen wurden. Bei einer RA-Probe konnte der CD20- Marker aufgrund eines Artefaktes nicht bestimmt werden. Auch dieser Wert wurde aus der Wertung ausgeschlossen.
2.3 Histologie
Histologisch ist die Rheumatoide Arthritis durch Vasoproliferation und Hyperämie gekennzeichnet. Im Stroma befinden sich perivaskuläre Infiltrate mit Lymphozyten und Plasmazellen. Die synoviale Deckzellschicht ist hyperplastisch. Rheumaknoten sind typisch und für eine RA beweisend. Diese weisen einen typischen dreischichtigen Aufbau auf, der aus einer zentralen fibrinoiden Nekrose scharf, begrenzt von mehrschichtig, palisadenförmig angeordneten Epitheloidzellen besteht
(Hough, A J 1989).
Das histologische Bild der Psoriasis-Arthritis zeigt ödematöse Papillen und stark erweiterte Kapillaren sowie lymphohistozytäre Infiltrate und Para-/Hyperkeratosen. Für die histologische Diagnose einer CPPD ist die Identifizierung eines CPPD-Kristalles beweisend (Behrens 2007, Keitel 1993). Dabei handelt es sich um Rhomben bzw. um Stäbchen mit rechteckigen Rändern, die meist eine Größe unter
5 mm haben. In der Polarisation sind die Kristalle schwach positiv und doppelbrechend.
Bei der klassischen Rheumatoiden Arthritis sind Rheumagranulome histo-pathologisch für das Vorliegen der Erkrankung beweisend. Solche Granulome, die als ein palisadenbildendes Granulom mit zentraler fibrinoider Nekrose definiert sind, werden etwa bei 20-30% der Erkrankten beobachtet (Knöß 2006).
Die histologische Aufarbeitung der Gewebeproben stellt ein wichtiges Basiselement dieser Arbeit dar. Zur standardisierten histopathologischen Untersuchung wurde zur Bewertung das histopathologische Graduierungsschema von Krenn und Morawietz in leicht abgewandelter Form als Grundlage herangezogen. Dieses ist für die Diagnostik rheumatischer und nicht-rheumatischer Gelenkerkrankungen geeignet. Dabei erfolgt die Beurteilung der Synovialmembran, indem die drei Kompartimente der Synovialitis, synoviales Stroma und leukozytäre Infiltrate in semiquantitativer Weise graduiert werden (Krenn et al. 2005).
Die Aktivität wurde nach der Anzahl der Aktivierung des Stromas und der Zelldichte eingeteilt. Insbesondere die neutrophilen Granulozyten pro Gesichtsfeld in vier Stufen. Null Granulozyten entsprachen dabei (0) keine, (1) entsprachen 1-10 Granulozyten einer diskreten, (2) entsprachen 10-20 Granulozyten einer leichten und (3) über 20 Granolozyten einer schweren aktiven Entzündung. Den Grad der Chronizität bestimmte ich über die Leukozytäre entzündliche Infiltration, wobei diese Veränderungen in nicht vorhanden (0), leichtgradig (1), mäßiggradig (2) und schwergradig (3) quantifiziert wurden. Im Weiteren beurteilte ich die Verbreiterung der synovialen Deckzellschicht. Um die unterschiedlichen Stadien der
Immunregulation mit einzubeziehen, subsummierte ich die oben aufgeführten Punkte im Grad der Synovialitis von 1 bis 3 in zwei Subgruppen: Chronizität und Aktivität, wobei 0 keiner, 1 einer geringgradigen, 2 einer mittelgradigen und 3 einer hochgradigen Aktivierung entspricht.
Weitere Kriterien bezogen sich auf das Vorhandensein einer Vaskulitis, auf den Grad der Vaskularisierung, der Lokalisation der Probeentnahme (soweit angegeben) sowie auf die letztendliche Größe des zum Stanzen ausgewählten Bereichs. Die Graduierung der Synovialisproben erfolgte an konventionell gefärbten HE-Paraffinschnittpräparaten.
2.4. Immunhistochemie
Für die immunhistochemische Untersuchung der TMAs verwandte ich fünf Antikörper: nämlich der Monoclonale Mouse Anti- Human CD3, der Monoclonale Mouse Anti- Human CD8 und der Monoclonale Mouse Anti- Human CD 20 von der Firma DakoCytomation Denmark A/S. Des Weiteren wurden der Human Monoclonale Mouse Anti CD 25 der Firma Novocastra und der Anti- Human FoxP3 Antikörper der Firma eBioscience angewandt. Die folgenden Unterpunkte stammen auszugsweise aus den Anwendungsrichtlinien der o.g. Firmen.
2.4.1. CD3
Der Antikörper markiert CD3-Komplex ist für die Identifizierung von T- Zellen von Nutzen. Der CD3-Komplex, bestehend aus sechs Polypeptiden, erscheint im medullären Thymozytenstadium auf der Zelloberfläche in enger Verbindung mit dem
T- Zellrezeptor, der den Teil der Ligandenbindung bildet. Das CD3- Molekül übernimmt die Funktion der Signalisierung, wodurch CD3 zu einem hochspezifischen Marker für T- Zellen wird. Es sind keine weiteren Zellen bekannt, die CD3 exprimieren.
Der Antikörper ist für die Markierung von Gewebsschnitten, die in Paraffin eingebettet sind, gut geeignet. Er wurde in einem Verdünnungsbereich von 1:25 - 1:50 eingesetzt. Eine Vorbehandlung der Gewebe durch eine zwanzigminütige hitzeinduzierte Epitopdemaskierung ist dabei erforderlich. Optimale Färbeergebnisse konnten durch die Behandlung der Gewebe in 10 mmol/L Tris-Puffer, 1 mmol/L EDTA, pH 9,0 gefolgt von 30 Minuten Inkubation mit dem primären Antikörper bei Raumtemperatur erreicht werden. Negativ-Kontrollen des Antikörpers wurden ausgeschlossen. Als Positivkontrollen wurden Lymphknoten verwendet. Vom
Antikörper markierte Zellen weisen eine Oberflächenfärbung und/oder
zytoplasmatische Färbung auf.
2.4.2. CD8
Der CD8+- Antikörper markiert zytotoxische Supressor-T-Zellen und ist nützlich für
die Identifikation dieser Zellen. Er kann bei einem Verdünnungsbereich von 1:50-1:100 eingesetzt werden. Eine Vorbehandlung der Gewebe durch hitzeinduzierte Epitopdemaskierung wurde mit der Target Retrieval Solution, pH 6.1 und einer darauf folgenden dreißigminütigen Inkubation des Antikörpers bei Raumtemperatur durchgeführt. Negativkontrollen des Antikörpers wurden wiederum ausgeschlossen. Als Positivkontrollen wurden Lymphknoten und Gewebe aus der Milz verwendet.
Durch den Antikörper markierte Zellen zeigten eine auf die Oberflächenmembran beschränkte Färbung.
2.4.3. CD20
CD20 ist ein transmembranes, nicht glykosiertes Protein, welches sich auf B-Zell-Vorstufen sowie auf reifen B-Zellen befindet. Bei der Differenzierung in Plasmazellen geht dieses Protein jedoch verloren. Der Antikörper sollte in einer Verdünnung von 1:200 – 1:400 verwendet werden. Eine Vorbehandlung der Gewebe durch eine zwanzigminütige hitzeinduzierte Epitopdemaskierung ist ebenfalls erforderlich. Optimale Ergebnisse werden in einer Target Retrieval Solution, pH 6.0 und einer dreißigminütigen Inkubation des Antikörpers bei Raumtemperatur erzielt. Vom Antikörper markierte Zellen zeigen eine Oberflächenfärbung auf der zyto-plasmatischen Seite der Zellen.
2.4.4. CD25
Das CD25- Antigen ist eine α-Untereinheit des Interleukin 2- Rezeptors. Werden T-Zellen aktiviert, führt dies zu einer raschen Synthese des Interleukins 2, welches eine Subpopulation von T-Zellen mit einem High Affinity Rezeptor für IL-2 stimuliert. Diese Zellen proliferieren und erweitern die Population von T-Zellen mit Helfer-, Supressor- und Zytotoxischer Funktion. Die typische Verdünnung für die Immunhistochemie liegt zwischen 1:100-1:200. Eine hitzeinduzierte Epitopdemaskierung ist durchzuführen, gefolgt von einer 60 minütigen primären Antikörper Inkubation bei 25°C. Negativkontrollen des Antikörpers wurden weggelassen. Als positive Kontrolle wurden Lymphknoten verwendet. Durch den Antikörper markierte Zellen zeigen eine auf die Membran beschränkte Färbung.
2.4.5. FoxP3
Der Antikörper reagiert mit dem menschlichen FoxP3- Protein, auch bekannt als Forkhead Box P3, wobei keine Kreuzreaktivität zu anderen Proteinen bekannt ist.
Hohe FoxP3-Expressionen werden in CD4+CD25+- regulatorischen Zellen gefunden.
Daher werden diese Zellen über diesen Transkriptionsfaktor identifiziert. Für die immunhistochemische Färbung wurden die Gewebe 1h in Xylol gelagert und anschließend mit Ac pH 6,0 und einem TBS Puffer für 5 min behandelt, danach für 10 min mit einer 1% H2O2 -Methanol Lösung versetzt sowie erneut eine zweimalige Anwendung des TBS Puffers vorgenommen. Der Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:4050 für 2h bei 30°C inkubiert.
2.5. TMA- Herstellung
Bei der TMA-Technologie wird die gleichzeitige Analyse von bis zu 1000 Geweben auf einem einzigen Objektträger ermöglicht (Simon et al. 2010). Dafür werden Gewebszylinder aus bis zu Hunderten von primären Gewebsblöcken ausgestanzt und danach in einen leeren Empfängerblock eingefügt (siehe Abb. 3). Die Gewebszylinder haben typischerweise einen Durchmesser von 0.6 mm. Der schließlich fertige Empfängerblock mit den verschiedenen Geweben kann dann auf Objektträgern histologisch analysiert und mittels verschiedenster Färbungen immunhistochemisch untersucht werden. Diese Methode ermöglicht und beschleunigt die in Situ-Analyse von Geweben signifikant (Bubendorf et al. 1999). Die Auswertung des Micro Tissue Arrays erfolgt mikroskopisch. In mehreren Schritten werden die mit den einzelnen Markern angefärbten TMA ausgezählt. Die
Abb. 3 zeigt beispielhaft einen fertigen Schnitt. Infiltrate der CD3+, CD 8+, CD 25+, CD
20+ und FoxP3 -Zellen wurden eigenständig durch zwei Beobachter bei einer
Vergrößerung von x400 (high power field, HPF) mit einem Zeiss Axio Mikroskop gezählt. Die Ergebnisse der zwei unterschiedlichen Beobachter wurden gemittelt und als durchschnittliche Anzahl positiver Zellen bestimmt.
Abbildung 3: Fertiger TMA mit Auswertungsbogen
2.6. Statistische Auswertung
Die Unterschiede in der Verteilung von CD3+, CD8+, CD20+, CD25+ und FoxP3
zwischen den verschiedenen Patientengruppen wertete ich mit der Software SPSS v22 aus. Zur Überprüfung der Verteilungsunterschiede in der zentralen Tendenz bzw. des Mittelwertes verwandte ich den Kruskal-Wallis-H- Test. Die Signifikanzprüfung zwischen einzelnen Markern bzw. FoxP3-Expression wurde mit dem semiparametrischen Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. Zur Berechnung der
Zusammenhänge zwischen den einzelnen Markern zog ich den semiparametrischen Rangkorrelationskoeffizienten nach Spearman heran.
3. Resultate
Im Anhang 1 werden die Ergebnisse tabellarisch wieder gegeben. Von den n=126 Proben wurden n= 117 Proben mit den Diagnosen Rheumatoide Arthritis, Psoriasis-Arthritis und COPD direkt in die Auswertung einbezogen. Weitere Proben mit ähnlichen Diagnosen (n= 9) verwandte ich als zusätzliche Kontrollen. Für die weitere statistische Auswertung teilte ich diese 113 Fälle in 5 Gruppen auf. Die Proben der RA- Gruppe wurden dann in drei Subgruppen zwecks besserer Differenzierbarkeit und inhaltlicher Auswertbarkeit in RA- Low Grade und damit in Chronizität 0 und 1 (n=8), in RA- High Grade mit Chronizität 2 und 3 (n=27), sowie in RA mit Granulom in n=41 Fälle eingeteilt. Die vierte Gruppe bildet Proben mit PSA mit n=15 und die fünfte Gruppe CPPD-Patienten mit n=22 Fällen.
3.1. Mittelwerte der Zellzahlen der einzelnen Marker nach Gruppe
Tabelle 1 zeigt die Mittelwerte, die Standardabweichungen und die Minima bzw. Maxima der einzelnen Marker in den drei Subgruppen.
Es fällt auf, dass über alle drei Färbeverfahren die Mittelwerte der entsprechenden
Treg -Zellen in der RA- Gruppe, gefolgt von der PSA- Gruppe, am höchsten, die
mittleren Zellzahlen pro Stanze bei CPPD-Patienten am geringsten sind. Gleiches trifft auf die Standardabweichungen und die Spannbreiten zu. Inhaltlich ist dies gut vereinbar mit dem klinischen Spektrum der einzelnen Krankheitsbilder und einer höheren Variabilität der Entzündungsaktivität bei der Rheumatoiden Arthritis, welche bereits im Vorfeld zu einer weiteren Subklassifizierung der RA geführt hat. In
Tabelle 2 werden die Mittelwerte und Standardabweichungen nach RA-Subgruppen differenziert aufgeführt. 75 93,65 245,541 0 1400 15 73,13 95,803 0 300 22 12,23 26,671 0 120 112 74,91 206,161 0 1400 76 19,80 29,783 0 210 15 15,60 13,059 0 40 22 7,95 8,015 0 25 113 16,94 25,476 0 210 76 171,91 260,465 0 1550 15 96,53 127,015 0 470 22 39,27 44,089 0 140 113 136,08 225,239 0 1550 76 47,97 57,156 0 360 15 38,00 32,291 0 115 22 17,14 23,821 0 108 113 40,65 50,698 0 360 76 20,88 59,298 0 490 15 6,47 11,395 0 45 22 2,09 5,126 0 22 113 15,31 49,413 0 490 RA PSA CPPD Total RA PSA CPPD Total RA PSA CPPD Total RA PSA CPPD Total RA PSA CPPD Total CD_20 CD_25 CD_3 CD_8 FOX_P3
N Mean Std. Deviation Minimum Maximum
Tabelle 1: Gruppenspezifische Mittelwerte und Streuungen der drei unterschiedlichen Färbeverfahren nach Gruppen.
8 9,13 24,608 0 70 27 201,30 336,132 1 1400 40 37,90 162,142 0 1000 75 93,65 245,541 0 1400 8 3,88 5,890 0 17 27 19,93 27,794 0 105 41 22,83 33,088 0 210 76 19,80 29,783 0 210 8 78,63 72,985 2 215 27 231,93 322,923 7 1550 41 150,59 232,062 0 1320 76 171,91 260,465 0 1550 8 20,13 21,142 1 55 27 62,56 56,774 4 218 41 43,80 60,296 0 360 76 47,97 57,156 0 360 8 5,88 7,180 0 21 27 22,96 35,257 0 170 41 22,44 75,667 0 490 76 20,88 59,298 0 490 low grade high grade RA mit Granulom Total low grade high grade RA mit Granulom Total low grade high grade RA mit Granulom Total low grade high grade RA mit Granulom Total low grade high grade RA mit Granulom Total CD_20 CD_25 CD_3 CD_8 FOX_P3
N Mean Std. Deviation Minimum Maximum
Tabelle 2: Mittelwerte und Standardabweichungen der Zellzahlen nach Gruppen
Die differenzierte Analyse der RA- Proben ergibt im Einzelnen einen deutlichen Unterschied zwischen den Mittelwerten im Vergleich Low grade/high grade und den deutlich erhöhten Mittelwerten bei der High Grade- Gruppe, passend zu einem erhöhten inflammatorischen Prozess in Bezug auf aktive und chronische Immunvorgänge. Die Analyse der Subgruppe der RA mit Granulomen als Ausdruck einer längeren Krankheitsdauer und Schwere weist bis auf eine erhöhte Anzahl der
CD25+-markierten Zellen insgesamt kleinere Treg -Zellzahlen auf.
Abbildung 4 auf der folgenden Seite veranschaulicht die Mittelwerte über alle fünf Subgruppen.
CPPD PSA RA mit Granulom high grade low grade Synovialitiden / Subgruppen 250 200 150 100 50 0 Mi tt elw ert e C D_ 20 CPPD PSA RA mit Granulom high grade low grade Synovialitiden / Subgruppen 250 200 150 100 50 0 Mi tt elw ert e C D_ 3 CPPD PSA RA mit Granulom high grade low grade Synovialitiden / Subgruppen 70 60 50 40 30 20 10 0 Mi tt elw ert e CD _8 CPPD PSA RA mit Granulom high grade low grade Synovialitiden / Subgruppen 25 20 15 10 5 0 Mi tt elw ert e C D_ 25 CPPD PSA RA mit Granulom high grade low grade Synovialitiden / Subgruppen 25 20 15 10 5 0 Mi tt elw ert e F OX _P 3
Um die Unterschiede in den Gruppen als bedeutsam und somit nicht als zufällig interpretieren zu können, wäre ein angemessener Signifikanztest anzuwenden gewesen. Der Test meiner Wahl ist dabei der F-Test innerhalb der einfaktoriellen Anova. Die Anwendungsvoraussetzungen der Normalverteilungsannahme hierfür wurden graphisch und mittels dem Shapiro-Wilk Test überprüft. Das Ergebnis ist, dass von einer Normalverteilung der Beobachtungsdaten nicht ausgegangen werden kann (vgl. Anhang 2 mit den Plots gegen die Normalverteilung). Deshalb wurde die globale Signifikanzprüfung der Gruppenunterschiede mit dem Kruskal-Wallis-H- Test durchgeführt (Janssen und Laatz 2005).
Die Rangsummenunterschiede in den fünf Subgruppen zeigen für alle einbezogenen Marker ein statistisch hoch signifikantes Ergebnis (vgl. Tabelle 3). Das bedeutet, dass die Krankheitsbilder global unterschiedliche Verteilungen der einzelnen Marker aufweisen. 40,206 18,318 19,302 18,944 25,605 4 4 4 4 4 ,000 ,001 ,001 ,001 ,000 Chi-Square df Asymp. Sig. CD_20 CD_25 CD_3 CD_8 FOX_P3
In den Paarvergleichen zwischen low grade- RA und high grade- RA ergeben sich die nachfolgenden Ergebnisse. Verwendet werden die semiparametrischen Mann-Whitney U- bzw. Wilcoxon W-Tests (vgl. Tabelle 4).
CD_20 CD_25 CD_3 CD_8 fox_p3
Mann-Whitney U 23,000 48,500 67,500 46,500 74,000
Wilcoxon W 59,000 84,500 103,500 82,500 110,000
Z -3,349 -2,345 -1,592 -2,416 -1,343
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
,000(a) ,017(a) ,113(a) ,013(a) ,192(a)
Tabelle 4: Paarvergleich der Zellzahlen zwischen low grade- RA und high grade -RA
Signifikante Unterschiede ergeben sich im Vergleich der Subgruppen low grade- RA und high grade -RA zwischen den Zellzahlen für die CD20+ - bzw. CD 25+ -Zellen und CD 8+ -Zellen.
CD_20 CD_25 CD_3 CD_8 fox_p3
Mann-Whitney U 154,000 45,500 128,000 108,000 110,500
Wilcoxon W 190,000 81,500 164,000 144,000 146,500
Z -,191 -3,213 -,974 -1,516 -1,452
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
,881(a) ,001(a) ,344(a) ,135(a) ,150(a)
Tabelle 5: Paarvergleich der Zellzahlen zwischen low grade- RA und RA mit Granulom
Die Subgruppen der low grade- RA und der RA mit Granulom unterscheiden sich
statistisch hoch signifikant in der Anzahl der CD25+ - Marker (Tabelle 5).
CD_20 CD_25 CD_3 CD_8 fox_p3
Mann-Whitney U 79,500 52,500 57,500 77,000 48,000
Wilcoxon W 115,500 88,500 310,500 330,000 301,000
Z -,450 -1,676 -1,432 -,517 -2,080
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
,696(a) ,097(a) ,156(a) ,629(a) ,063(a)
Im Vergleich zwischen low grade- RA und CPPD lassen sich keine statistisch bedeutsamen Unterschiede in den mittleren Rangsummen nachweisen (Tabelle 6).
CD_20 CD_25 CD_3 CD_8 fox_p3
Mann-Whitney U 22,500 20,500 56,000 41,000 53,500
Wilcoxon W 58,500 56,500 176,000 77,000 173,500
Z -2,472 -2,565 -,258 -1,227 -,427
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]
,013(a) ,008(a) ,825(a) ,238(a) ,681(a)
Tabelle 7: Paarvergleich der Zellzahlen zwischen low grade- RA und PSA
Es ergaben sich statistisch signifikante Unterschiede in der Verteilung der CD20+
bzw. CD25- Zellen zwischen low grade-RA und der Psoriasis-Arthritis (PSA), wie in Tabelle 7 dargestellt.
CD_20 CD_25 CD_3 CD_8 fox_p3
Mann-Whitney U 151,500 428,000 454,500 417,000 506,500
Wilcoxon W 971,500 806,000 1315,500 1278,000 1367,500
Z -5,119 -1,575 -1,242 -1,711 -,590
Asymp. Sig. (2-tailed) ,000 ,115 ,214 ,087 ,555
Tabelle 8: Paarvergleich der Zellzahlen zwischen high grade- RA und RA mit Granulom
Hier zeigten sich statistisch signifikante Unterschiede auf dem konventionellen
Niveau der Vertrauenswahrscheinlichkeit von 95% in der Verteilung der CD20+
-Zellzahlen zwischen den Subgruppen der high grade- RA und der RA mit Granulom (vgl. Tabelle 8).
CD_20 CD_25 CD_3 CD_8 fox_p3
Mann-Whitney U 84,000 228,000 105,000 108,500 110,000
Wilcoxon W 337,000 481,000 358,000 361,500 363,000
Z -4,333 -1,392 -3,861 -3,790 -3,897
Asymp. Sig. (2-tailed) ,000 ,164 ,000 ,000 ,000
Tabelle 9: Paarvergleich der Zellzahlen zwischen high grade- RA und CPPD
Im Vergleich zwischen high grade- RA und der Patientengruppe der CPPD ergaben sich für alle Marker bzw. für die FoxP3-Expression statistisch hochsignifikante
Unterschiede in den mittleren Rangsummen der Zellzahlen. Lediglich bei CD25+
-Zellen wurde der Verteilungsunterschied statistisch nicht bedeutsam (Tabelle 9)
CD_20 CD_25 CD_3 CD_8 fox_p3
Mann-Whitney U 153,500 175,500 127,500 154,000 130,000
Wilcoxon W 273,500 553,500 247,500 274,000 250,000
Z -1,287 -,710 -1,969 -1,273 -1,918
Asymp. Sig. (2-tailed) ,198 ,478 ,049 ,203 ,055
Tabelle 10: Paarvergleich der Zellzahlen zwischen high grade- RA und PSA
Hier konnte bis auf die Verteilung der Anzahl Zellen kein statistisch signifikanter
Unterschied außer für den CD3+-Marker ermittelt werden. Der Verteilungsunterschied
zwischen der high grade-RA und der PSA in Bezug auf die FoxP3-Expression lag dabei sehr nahe an der Grenze der konventionellen Irrtumswahrscheinlichkeit von 5% (Tabelle 10).
CD_20 CD_25 CD_3 CD_8 fox_p3
Mann-Whitney U 419,500 232,000 204,000 236,000 132,500
Wilcoxon W 1239,500 485,000 457,000 489,000 385,500
Z -,344 -3,162 -3,563 -3,102 -4,654
Asymp. Sig. (2-tailed) ,731 ,002 ,000 ,002 ,000
Tabelle 11: Paarvergleich der Zellzahlen zwischen RA mit Granulom und CPPD
Im abschließenden Vergleich zwischen den Patientengruppen der RA mit Granulom und der CPPD wurden statistisch hochsignifikante Unterschiede in allen betrachteten
Zellzahlen außer bei den CD20+- Zellen nachgewiesen (Tabelle 11)
CD_20 CD_25 CD_3 CD_8 fox_p3
Mann-Whitney U 143,000 260,500 229,000 301,500 200,500
Wilcoxon W 963,000 380,500 349,000 1162,500 320,500
Z -3,185 -,871 -1,453 -,111 -1,986
Asymp. Sig. (2-tailed) ,001 ,384 ,146 ,912 ,047
Tabelle 12: Paarvergleich der Zellzahlen zwischen RA mit Granulom und PSA
Im Vergleich der Subgruppen zwischen RA mit Granulom und der PSA zeigten sich
T-Zellen und der FoxP3-Expression (Tabelle 12).
CD_20 CD_25 CD_3 CD_8 fox_p3
Mann-Whitney U 84,500 95,500 126,000 92,500 102,000
Wilcoxon W 337,500 348,500 379,000 345,500 355,000
Z -2,598 -2,155 -1,207 -2,245 -2,127
Asymp. Sig. (2-tailed) ,009 ,031 ,227 ,025 ,033
Tabelle 13: Paarvergleich der Zellzahlen zwischen CPPD und PSA
Im abschließenden Vergleich zwischen den Patientengruppen der CPPD und jenen
der PSA ergaben sich bis auf die Anzahl der CD3+-Zellen keine statistisch
signifikanten Unterschiede bei allen einbezogenen Markern bzw. der FoxP3-Expression (Tabelle 13).
3.2. Tests auf Alters- und Geschlechtsabhängigkeit der Zellzahlen bzw.
der Expressionen
Dann ging ich der Frage nach, ob die dargestellten Ergebnisse alters- bzw. geschlechtsabhängig seien. Dazu berechnete ich zunächst Rangkorrelationen nach Spearman zwischen den einzelnen Markern bzw. der FoxP3-Expression je nach
Subgruppe. Die Ergebnisse zeigt Anhang 3. Bis auf CD20+, CD25+ sowie FoxP3 in
der low grade- RA-Gruppe ergaben sich keine statistisch signifikanten Zusammenhänge zwischen den einzelnen Markern und dem Alter.
Dann wurde geprüft, ob die einzelnen Marker geschlechtsspezifisch ausgeprägt waren, wiederum getrennt nach Diagnose. Zur Analyse verwandte ich den semiparametrischen Mann-Whitney-U-Test. Es ergab sich im weitesten Sinne keine Abhängigkeit der Ausprägung der Marker bzw. der FoxP3-Expression vom Geschlecht. Signifikante Unterschiede wurden jedoch zwischen FoxP3 und Geschlecht bei den Diagnosen der low-grade- RA (p= .03) und RA mit Granulom (p= .04) berechnet. Dabei wiesen Frauen im Mittel höhere Marker Ausprägungen auf.
Der Marker CD8+ war bei Frauen mit Diagnose der CPPD im Mittel gegenüber
männlichen Patienten erhöht (24,14 zu 4,87). In der Gruppe der RA mit Granulom
konnten bei Frauen tendenziell mehr CD+-Marker in den Synovaliden festgestellt
werden (25,8 zu 13,7, p= .07).
3.3. Zusammenhang zwischen den einzelnen Markern und der
FoxP3-Expression
Den Zusammenhang zwischen CD3+, CD8+, CD20+, CD25+ und FoxP3-Zellen mass
ich mit dem Spearman‘schen Rangkorrelationskoeffizienten, der Werte von minus 1 bis plus 1 annehmen kann. Ein Wert von plus 1 kennzeichnet einen perfekten
positiven Zusammenhang. Das heisst beispielsweise, wenn CD3+ ansteigt, dann
Korrelationen Diagnose CD_20 CD_25 CD_3 CD_8 fox_p3 RA_LG Spearman-Rho CD_20 Korrelationskoeffizient 1,000 ,580 ,409 ,464 ,690 Sig. (2-seitig) . ,132 ,314 ,247 ,058 N 8 8 8 8 8 CD_25 Korrelationskoeffizient ,580 1,000 ,259 ,927** ,819* Sig. (2-seitig) ,132 . ,535 ,001 ,013 N 8 8 8 8 8 CD_3 Korrelationskoeffizient ,409 ,259 1,000 ,333 ,554 Sig. (2-seitig) ,314 ,535 . ,420 ,154 N 8 8 8 8 8 CD_8 Korrelationskoeffizient ,464 ,927** ,333 1,000 ,723* Sig. (2-seitig) ,247 ,001 ,420 . ,043 N 8 8 8 8 8 fox_p3 Korrelationskoeffizient ,690 ,819* ,554 ,723* 1,000 Sig. (2-seitig) ,058 ,013 ,154 ,043 . N 8 8 8 8 8 RA_HG Spearman-Rho CD_20 Korrelationskoeffizient 1,000 ,825** ,751** ,728** ,742** Sig. (2-seitig) . ,000 ,000 ,000 ,000 N 27 27 27 27 27 CD_25 Korrelationskoeffizient ,825** 1,000 ,784** ,703** ,680** Sig. (2-seitig) ,000 . ,000 ,000 ,000 N 27 27 27 27 27 CD_3 Korrelationskoeffizient ,751** ,784** 1,000 ,853** ,650** Sig. (2-seitig) ,000 ,000 . ,000 ,000 N 27 27 27 27 27 CD_8 Korrelationskoeffizient ,728** ,703** ,853** 1,000 ,557** Sig. (2-seitig) ,000 ,000 ,000 . ,003 N 27 27 27 27 27 fox_p3 Korrelationskoeffizient ,742** ,680** ,650** ,557** 1,000 Sig. (2-seitig) ,000 ,000 ,000 ,003 . N 27 27 27 27 27 RA+ G Spearman-Rho CD_20 Korrelationskoeffizient 1,000 ,279 ,305 ,300 ,303 Sig. (2-seitig) . ,081 ,055 ,060 ,057 N 40 40 40 40 40 CD_25 Korrelationskoeffizient ,279 1,000 ,594** ,528** ,452** Sig. (2-seitig) ,081 . ,000 ,000 ,003 N 40 41 41 41 41 CD_3 Korrelationskoeffizient ,305 ,594 ** 1,000 ,864** ,707**
N 40 41 41 41 41 CD_8 Korrelationskoeffizient ,300 ,528** ,864** 1,000 ,559** Sig. (2-seitig) ,060 ,000 ,000 . ,000 N 40 41 41 41 41 fox_p3 Korrelationskoeffizient ,303 ,452** ,707** ,559** 1,000 Sig. (2-seitig) ,057 ,003 ,000 ,000 . N 40 41 41 41 41 CPPD Spearman-Rho CD_20 Korrelationskoeffizient 1,000 ,355 ,670** ,434* ,617** Sig. (2-seitig) . ,105 ,001 ,044 ,002 N 22 22 22 22 22 CD_25 Korrelationskoeffizient ,355 1,000 ,700** ,438* ,529* Sig. (2-seitig) ,105 . ,000 ,042 ,011 N 22 22 22 22 22 CD_3 Korrelationskoeffizient ,670** ,700** 1,000 ,776** ,658** Sig. (2-seitig) ,001 ,000 . ,000 ,001 N 22 22 22 22 22 CD_8 Korrelationskoeffizient ,434* ,438* ,776** 1,000 ,347 Sig. (2-seitig) ,044 ,042 ,000 . ,113 N 22 22 22 22 22 fox_p3 Korrelationskoeffizient ,617** ,529* ,658** ,347 1,000 Sig. (2-seitig) ,002 ,011 ,001 ,113 . N 22 22 22 22 22 PSA Spearman-Rho CD_20 Korrelationskoeffizient 1,000 ,809** ,800** ,777** ,848** Sig. (2-seitig) . ,000 ,000 ,001 ,000 N 15 15 15 15 15 CD_25 Korrelationskoeffizient ,809** 1,000 ,770** ,618* ,764** Sig. (2-seitig) ,000 . ,001 ,014 ,001 N 15 15 15 15 15 CD_3 Korrelationskoeffizient ,800** ,770** 1,000 ,655** ,819** Sig. (2-seitig) ,000 ,001 . ,008 ,000 N 15 15 15 15 15 CD_8 Korrelationskoeffizient ,777** ,618* ,655** 1,000 ,705** Sig. (2-seitig) ,001 ,014 ,008 . ,003 N 15 15 15 15 15 fox_p3 Korrelationskoeffizient ,848** ,764** ,819** ,705** 1,000 Sig. (2-seitig) ,000 ,001 ,000 ,003 . N 15 15 15 15 15
**. Die Korrelation ist auf dem 0,01 Niveau signifikant (zweiseitig). *. Die Korrelation ist auf dem 0,05 Niveau signifikant (zweiseitig).
Die Tabelle 14 zeigt die Ergebnisse der semiparametrischen Korrelationsanalyse nach Spearman. Bis auf die low grade- RA-Gruppe ergaben sich hohe Korrelationen
zwischen CD3+ und FoxP3, die jeweils statistisch signifikant waren. Die höchste
Korrelation mit r=.85 wurde dabei in der PSA-Gruppe nachgewiesen. ´
Alle betrachteten Marker korrelierten in den Subgruppen der high grade- RA, der RA mit Granulom sowie der PSA signifikant mit der FoxP3-Expression. Einzig in der
CPPD-Gruppe konnte keine signifikante Korrelation zwischen CD8+ und der
FoxP3-Expression nachgewiesen werden.
Die höchste Korrelation insgesamt ergab sich zwischen CD25+ und CD 8+ in der low
grade- RA-Subgruppe (r= .93). Die niedrigsten Korrelationen zwischen CD25+ und
den anderen betrachteten Markern wurden für die Gruppen der RA mit Granulom bzw. der CPPD berechnet.
4. Diskussion
4.1. Die Eignung des TMA-Verfahrens zur Diagnostik
In dieser Arbeit berichte ich zum ersten Mal über die Anwendung des Micro Tissue Array-Verfahrens (TMA) im Zusammenhang mit entzündlichen Gewebs-erkrankungen. Im Zentrum steht dabei das Verteilungsmuster unterschiedlicher immunmodulatorischer T-Zellen. Diese Zellen wurden anhand unterschiedlicher Färbungen in ihrer Abhängigkeit von der Histopathologie verschiedener Gelenkerkrankungen und deren Grad des Entzündungsgeschehens quantitativ bestimmt.
Die Aussagen über die Präsenz von speziellen Zelltypen im Bereich der Synovialitiden sind deshalb besonders relevant, als spezielle Zellen potentielle Ziele für eine selektive medikamentöse Therapie zur Immunregulation darstellen können (Young et al. 1984). Aktuelle experimentelle Studien stützen sich zumeist auf die Flußzytometrie als Untersuchungsmethode. Diese gilt als Goldstandard zur
Identifizierung vom Treg -Zellmarkern.
Während das TMA-Verfahren in der Tumordiagnostik bereits seit Jahren anerkannt ist (Simon et al. 2014), hat es im Bereich entzündlicher Gelenkerkrankungen noch keine Anwendung gefunden. Der hier dargestellte Versuch mit einer histologischen high throughput- Analyse von unterschiedlichen Gewebeproben auf einem Objektträger unter standardisierten Bedingungen ermöglicht eine hochwertige, schnelle immunhistologische Gewebsanalyse.
Im Bereich der Tumorerkennung gibt es jedoch auch Befunde, die auf Schwachpunkte des TMA-Verfahrens hinweisen: “The weakness of the TMA technique becomes very clear with increasing heterogeneity. ... They lost 13% during processing and 13% did not contain tumour cells. ” (Kjaer-Frifeldt und Lindebjerg, 2012).
In meiner Studie habe ich bei der Stanze einen größeren Durchmesser von 2,0 mm gewählt. Während der Durchführung kam es zu keinem Probenverlust. Die technischen und histologischen Besonderheiten der verschiedenen Krankheitsbilder berücksichtigend, bestätigt meine Datenanalyse einen statistisch signifikanten Unterschied im Bereich der Immunzellverteilung und bietet damit Einsicht in das Verteilungsmuster insbesondere der regulatorischen T-Zellen.
Regulatorische T-Zellen spielen in vielen Autoimmunerkrankungen eine immunsupprimierende Rolle und nehmen dabei potentiell Einfluss auf den Verlauf entzündlicher Gelenkerkrankungen (Nguyen et al. 2007)). Immunreaktionen können durch sie verhindert oder gar abgeschaltet werden. Fehlen sie, entstehen durch überschießende Immunreaktionen schwere Autoimmunerkrankungen (Polansky und Huehn 2007). Seit die regulatorischen T-Zellen entdeckt wurden, gilt der forkhead/winged helix Tanskriptionsfaktor FoxP3 als spezifischer Marker zu deren Identifizierung (Polansky und Huehn 2007, Khattri et al. 2003). Er ist sowohl für die suppressorische Kapazität als auch für die Zugehörigkeit zur T-regulatorischen Linie
essenziell. Unter den Treg- Zellen gibt es eine Subgruppe CD4 positiver T Zellen.
Bereits 1996 konnten durch Schmid und Goronzy erhöhte CD4-Zellzahlen nachgewiesen werden (Schmid et al. 1996). Die genauere Phänotypisierung gelang jedoch nur teilweise.
Eine weitere Studie zeigte, dass die Anzahl von Treg -Zellen positiv mit geringerer
Krankheitsaktivität korreliert war. Dort wurden Treg -Zellen und der
Transkriptions-faktor forkhead box 3 (FoxP3) mittels Flusszytometrie bestimmt (Lanlan et al. 2013).
Bei experimentell erzeugter Arthritis führte die Entfernung von Treg -Zellen zur
Beschleunigung des Erkrankungseintritts (Morgan et al. 2003). Ebenso bewirkte die
Genmanipulation bei Mäusen, resultierend aus Abwesenheit von Treg -Zellen, einen
schnelleren Verlauf und eine stärkere Ausprägung der entzündlichen Arthritis (Nguyen et al. 2007). Beim Menschen konnten die Präsenz und die Vermehrung von regulatorischen T-Zellen in entzündeten Gelenken von Patienten mit RA, aber auch bei Patienten mit Spondylarthropathie und Patienten mit JIA nachgewiesen werden (Cao et al. 2006). Auch in anderen Studien mit Arthritispatienten wurden diese Zellen identifiziert (van Amelsfort et al. 2004, Ehrenstein 2003). Fraglich ist, ob sich die Präsenz dieser Zellen in unterschiedlichen Krankheitsbildern der Arthritis unterscheidet und ob sich diese Präsenz auf gewisse Stadien der Krankheitsbilder beschränkt.
In meiner Studie bestätigte sich die erhöhte Anzahl von regulatorischen T-Zellen im
Synovialgewebe. Es stellten sich die höchsten Mittelwerten der Treg- Zellen im
Bereich der High Grade- RA dar, gefolgt von der RA mit Granulom und schließlich der Psoriasis-Arthritis. Das deckt sich mit bisherigen Befunden (Sarkar und Fox 2007, Frank Behrens et al. 2007). Deutlich wird, dass mit zunehmendem Grad an aktiver Inflammation auch die Zahl der regulatorischen Zellen im synovialen Gewebe ansteigt.
grade- RA und PSA bewies, dass sich die Muster der immunologischen Verteilungen
gemessen an der Zellanzahl von CD3+, CD25+ und FoxP3-Expressionen ähneln.
Zwischen der high grade- RA und der PSA-Gruppe zeigten sich dagegen statistisch
signifikante Unterschiede bei CD20+-Zellen und der FoxP3-Expression. Die höchsten
Zellzahlen wurden bis auf den CD25+-Marker jeweils in der high-Grade-RA
vorgefunden, dem Krankheitsbild mit der aktivsten und akutesten Inflammation. Im differenzierten Vergleich zwischen den geringgradigen und stärker entzündlichen Krankheitsbildern ergaben sich Häufigkeitsunterschiede insbesondere bei den
CD20+, CD25+ sowie den CD8+ -Zellen. Diese waren jeweils in der high
grade-Gruppe häufiger vorzufinden.
Die CPPD hingegen repräsentiert eine Patientengruppe mit einer Arthritis, die auf einem anderen Pathomechanismus bzw. immunologischen Entzündungsmuster gründet. Wie man in der hier vorgestellten Analyse deutlich sieht, sind die entsprechenden Zellzahlen im Vergleich zu den autoimmun bedingten Krankheitsbildern unseres Patientenkollektivs erwartungsgemäß sehr niedrig. Das stützt die These einer nicht autoimmun-getriggerten Entzündungsreaktion. Diese Kausalität ist jedoch abhängig vom Grad der Inflammation. So konnten für die low grade-RA und für die Gruppe der CPPD-Patienten keine statistisch signifikanten Unterschiede in der Anzahl der betrachteten Marker bzw. der FoxP3-Expression nachgewiesen werden.
Weiterhin konnte ich nachweisen, dass die Verteilungsunterschiede zwischen den einzelnen Patientengruppen im weiten Sinne weder geschlechts- noch altersabhängig sind.
Ebenfalls erwartungsgemäß ist die hohe, statistisch signifikante Korrelation der
Verteilung zwischen FoxP3 und CD25+ -Zellen. Diese Korrelation resultiert aus der
Tatsache, dass CD4+CD25+-Zellen den Transkriptionsfaktor FoxP3 exprimieren (Oh
et al. 2010, Polansky und Huehn 2007). Die FoxP3-Exprimierung ist bei der
Differenzierung und Funktionsweise von Treg -Zellen notwendig und bedeutsam
(Ngyuen et al. 2007). Verminderte FoxP3-Expression beeinflusste unter anderem die Fähigkeit der Treg -Zellen die Proliferation von Effektor-T-Zellen und die
Zytokinin-Ausschüttung zu unterdrücken (Boissier et al. 2009).
Höhere Korrelationen zwischen CD4+CD25+ -regulatorischen T-Zellen und FoxP3
wurden dabei in den vergleichsweise mild verlaufenden Verlaufsformen der juvenilen ideopathischen Athritis gegenüber aktiv inflammatorischen Krankheitsbildern gefunden (de Kleer et al. 2004). Auch in meiner Studie wurde die höchste Korrelation
von FoxP3 und CD25+- Markern in der low grade- RA- Patientengruppe gemessen
(r= .82), gefolgt von der PSA-Gruppe mit r= .76. Die RA-Gruppe mit deutlich aktiverem Entzündungsgeschehen (high grade) wies dagegen lediglich einen Rangkorrelationskoeffizienten von r= .68 auf.
B- Zellen sind bei der Rheumatoiden Arthritis zum einen durch ihr Antikörperprofil und ihre Antigen präsentierende Funktion zum andern durch ihre lokale Zytokinabgabe bekannt (Nüßlein 2004). Das nutzt auch die Therapie der RA mit
Rituximab, einem B-Zell zerstörenden CD-20+ - Antikörper, der deutliche Effektivität
zeigt (Nüßlein 2004). Die Resultate bestätigen diesen Befund, in dem sich die Anzahl
an CD 20+ -Zellen mit einem Mittelwert von 201 (SD= 30) in der high grade -RA
deutlich erhöht zeigt und einen statistisch signifikanten Unterschied zur Häufigkeit in den anderen Gruppen aufweist. Eine Ausnahme ist die PSA-Patientengruppe, die
ebenfalls aktive entzündliche Prozesse kennzeichnet.
Damit stimmt auch die Beobachtung überein, dass bei nicht aktiver, chronischer Entzündung wie im Stadium der Granulombildung (RA mit Granulom) kein
überdurchschnittlich hohes Vorkommen der CD 20+- Zellen im Vergleich zur CPPD
vorliegt. Das kann zusätzlich als ein Hinweis für die Sensitivität des Testungsverfahrens interpretiert werden. Vergleicht man dieses Ergebnis mit dem
Vorkommen von CD 8+- Zellen mit der RA im Stadium der Granulombildung, dann
zeigt sich hier ein deutlich erhöhter Wert an CD 20+- Zellen im Vergleich zur CPPD.
Das passt zur Beobachtung von Mc Innes und Schett, die eine erhöhte Anzahl von CD8-positiven T-Zellen im Bereich der Germinal Center beschrieben haben, ohne das jedoch auf eine genaue inhaltliche immunmodulatorische Funktion zurückführen zu können.
Somit ist nach meinen Befunden aus der TMA-Analyse die entzündliche Rheumatoide Arthritis mit der erhöhten Entwicklung von B- Zellen assoziiert, was die Beobachtungen von Hueber und Mc Innes bestätigt (Hueber und McInnes 2007). Damit sind die hier vorgelegten Befunde, die mittels TMA-Analyse gewonnen wurden, gut vereinbar mit den bisherigen Ergebnissen, die zumeist auf der Flußzytometrie gründen.
Die Rolle der B-Zellen bei der Psoriasis ist jedoch nicht eindeutig geklärt. Weitere Untersuchungen bzgl. des Vorkommens aktiver B- Zellen im synovialen Kompartiment der PSA zwecks Entdeckung möglicher weiterer Therapieziele wurden eingefordert. Meine Ergebnisse zeigen kein gehäuftes Vorkommen von CD 20-positiven Zellen in den synovialen Biopsien von PA-Patienten; mit einem Mittelwert
von 73,1 hebt sich dieser kaum von den anderen Gruppen ab, so dass die Bedeutung der B-Zellen im Bereich der Psoriasis Arthritis eher zurücktritt.
4.2. Limitationen dieser Studie und Ausblick
Zum einen ist die bislang nicht automatisierbare Zellzählung im hier verwendeten Verfahren anfällig für Beobachtungsfehler und abhängig von der Güte der menschlichen Beobachtungskraft. Das betrifft auch den Grad der Übereinstimmung zwischen den Beobachtern. Zum anderen konnten in dieser Studie die Ergebnisse aus den beobachteten Subgruppen nicht mit einer gesunden Kontrollgruppe verglichen werden. Dazu kommt, dass der Vergleich mit anderen Studien, die vorwiegend auf Grundlage der Flußzytometrie erstellt wurden, nur in relativen Größenordnungen möglich ist, da sich die Maße für die Zellanzahlen unterscheiden. Trotzdem konnte ich in meiner Studie bedeutsame und aus den bisherigen Befunden erwartete Zusammenhänge replizieren, was für das TMA-Verfahren und seine Reliabilität spricht. Auch die im Vergleich zu anderen Studien relativ hohen Patientenzahlen sprechen für die Gültigkeit meiner Ergebnisse.
Vielleicht wird es in absehbarer Zeit nicht möglich sein, vollkommen standardisierte Messergebnisse im Rahmen einer der TMA erzielen zu können, da diese Technik noch individuelle Beurteilungen erfordert. Die TMA-Technologie stellt jedoch eine valide und vor allem schnelle und preiswerte Untersuchungsmethode dar, die zudem den Vorteil aufweist, sehr viele Proben gleichzeitig analysieren zu können.
5. Zusammenfassung
Die Detektion unterschiedlicher immunmodulatorischer Zellen aus verschiedenen Gewebeproben und deren Auswertung anhand des Micro Tissue Array- Verfahrens hat sich als sensitiv und reliabel herausgestellt. Die ermittelten statistisch
signifikanten Unterschiede in der Verteilung der CD3+, CD 8+, CD 25+, CD 20+ und
FoxP3 -Zellen konnten sinnvoll analysiert werden. Es lies sich ein Zusammenhang sowohl zum histopathologischen Befund als auch zur Pathogenese der hier untersuchten Erkrankungen herstellen.
Ich konnte aufzeigen, dass das Vorkommen von speziellen Zelltypen im Zusammenhang mit dem Grad der Entzündung der hier untersuchten Erkrankungen steht und Deckungsgleich mit dem derzeitigen Kenntnisstand in der Forschung ist. Damit stellt das TMA ein geeignetes Verfahren zur Detektion spezifischer Zellmuster und der folgenden Entwicklung potentieller Ziele für eine selektive Medikamentöse Therapie zur Immunregulation dar.
6. Literaturverzeichnis
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