Tierärztliche Hochschule Hannover
Induktion der Lymphangiogenese:
Evaluation mikrochirurgischer Lymphrekonstruktionstechniken
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Rebecca Hadrian
aus Soest
Hannover 2016
Wissenschaftliche Betreuung: 1. Prof. Dr. Michael Fehr
Klinik für Kleintiere und Klinik für Heimtiere, Reptilien, Zier- und Wildvögel
Tierärztliche Hochschule Hannover
2. Prof. Dr. Daniel Palmes
Abteilung Chirurgische Forschung
Klinik für Allgemein- und Viszeralchirurgie Universitätsklinikum Münster
1. Gutachter: Prof. Dr. Michael Fehr
Gemeinsames Gutachten mit Prof. Dr. Daniel Palmes
2. Gutachter: Prof. Dr. Ralph Brehm Anatomisches Institut
Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 16.11.2016
Für meine Lieben
Teile dieser Arbeit wurden bereits auf folgenden Tagungen vorgestellt und veröffentlicht:
R.Hadrian, M.Fehr, L.Kebschull, D.Palmes
“Evaluation of microsurgical lymphatic reconstruction techniques”
58. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Phlebologie, Dresden, 07.-10.09.2016
R.Hadrian, M.Fehr, L.Kebschull, D.Palmes
“Evaluation of microsurgical lymphatic reconstruction techniques”
40. Jahreskongress der Deutschen Gesellschaft für Lymphologie, Hof 22.-24.09.2016
Hadrian, R., and Palmes, D. (2016). Animal Models of Secondary Lymphedema -New Approaches in the Search for Therapeutic Options. Lymphat. Res. Biol. accepted 07/2016, ahead of print.
Abkürzungsverzeichnis
CD-3 CD-3 Cluster of Differentiation 3
CD-19 CD-19 Cluster of Differentiation 19
DAPI 4′,6-Diamidin-2-phenylindol GBCAs Gadolinium based contrast agents
Gd Gadolinium
HE-Färbung Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Ki-67 Antigen für die Wachstumsfraktion einer Zellpopulation
KM Kontrastmittel
KPE Komplexe Physikalische Entstauungstherapie
LANUV Landesamts für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz
LEC Lymphendothelzelle
LL Lympho-lymphatische Anastomose
LLN Lympho-lymphonoduläre Anastomose LyTX Lymphgefäßtransplantation
LNTX Lymphknotentransplantation
Ln. Lymphknoten (Singular)
Lnn. Lymphknoten (Plural)
LYVE-1 Lymphatic Vessel Endothelial Hyaluronan Receptor MR/MRT Magnetresonanztomographie
N20/O2 Distickstoffmonoxid/Sauerstoff PAK primärer Antikörper
PBS Phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline) REM Rasterelektronenmikroskopie
RIPA Radioimmunoprecipitation assay buffer SAK Sekundärer Antikörper
SD Sprague –Dawley Ratte
sc. Subkutan
SI Signalintesität
Sk Skalierungsänderung
TRIC Translational Research Imaging Center
TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan VEGF-C Vascular Endothelial Growth Factor – C
VEGFR-3 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 3
VWF Von-Willebrand-Faktor
ZTE ZTE Zentrale Tierexperimentelle Einrichtung, Universitätsklinikum Münster
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ...9
2. Literaturübersicht ... 11
2.1 Anatomie und Physiologie des Lymphsystems ... 11
2.2 Erkrankungen des Lymphsystems ... 15
2.3 Tiermodelle in der Lymphforschung ... 18
2.4 Pharmakologische Lymphödemtherapie ... 20
2.5 Chirurgische Lymphödemtherapie ... 22
2.6 Bildgebende Methoden zur Darstellung des Lymphsystems ... 27
2.7 Marker zur funktionellen Überprüfung der Lymphrekonstruktion ... 31
2.8 Ziel der Studie ... 34
3. Material und Methoden ... 35
3.1 Versuchstiere ... 35
3.2 Ort der Versuchsdurchführung ... 36
3.3 Studiendesign ... 36
3.4 Versuchsdurchführung ... 37
3.5 MR-Lymphangiographie ... 43
3.6 Morphologische und molekularbiologische Parameter ... 46
3.7 Statistik ... 52
4. Ergebnisse ... 53
4.1 OP-Dauer ... 53
4.2 Adhäsionsscore ... 54
4.3 Signalintensitäten MRT ... 56
4.4 Makroskopische Durchgängigkeitsprüfung (Patentblau V) ... 60
4.5 Morphologische Unterschiede (HE) ... 64
4.6 Immunfluoreszenz ... 74
4.7 Western Blot ... 94
4.8 Rasterelektronenmikroskopie (REM) ... 96
5. Diskussion ... 97
5.1 Wissenschaftlicher Hintergrund ... 97
5.2 Experimentelle Methoden der chirurgischen Lymphrekonstruktion ... 97
5.3 Operationsdauer ... 98
5.4 Adhäsionsscore ... 98
5.5 Signalintensitäten im MRT ... 99
5.6 Durchgängigkeit der Rekonstruktion ... 100
5.7 Histologische Veränderungen ... 101
5.8 Klinische Relevanz und Perspektiven ... 104
5.9 Veterinärmedizinische Relevanz ... 105
5.10 Mögliche Limitationen dieser Arbeit ... 107
6. Schlussfolgerung ... 108
7. Zusammenfassung ... 110
8. Summary ... 112
9. Literaturverzeichnis ... 114
10. Anhang ... 121
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Einleitung 1. Einleitung
Die Lymphadenektomie im Rahmen einer Karzinomtherapie ist die häufigste Ursache für sekundäre Lymphödeme beim Menschen. Brustkrebs, als weltweit verbreitetstes Krebsleiden bei Frauen macht ein Viertel der Fälle aus (Torre et al., 2015). Obwohl die präventive Axilla Lymphknoten Resektion (ALND) durch die Sentinel Lymphknoten Biopsie weitgehend ersetzt wurde, ist die Inzidenz für sekundäre Lymphödeme aufgrund der großen Anzahl an Neuerkrankungen pro Jahr weiterhin ein immenses Problem (Sclafani and Baron, 2008;
Tvedskov, 2012). In der Tiermedizin kommt das sekundäre Lymphödem deutlich seltener vor, wird aber nach Mastektomie oder nach Infiltrierung von malignen Tumorzellen in Lymphgefäße beschrieben (Kang et al., 2007). Das sekundäre Lymphödem zeichnet sich durch massive Schwellung in der betroffenen Körperregion aus, die durch eine Stauung von eiweißreicher, lymphgefäßpflichtiger Flüssigkeit im Gewebe zustande kommt.
Pathophysiologisch besteht bei diesem Krankheitsbild ein unzureichender Lymphabtransport, verursacht durch ein Ungleichgewicht zwischen der abzutransportierenden Menge an Lymphflüssigkeit und der Transportkapazität und Anzahl der funktionsfähigen Lymphgefäße (Baumeister and Frick, 2003). Ein weiteres Problem des Lymphstaus ist die herabgesetzte Immunabwehr des betroffenen Areals, da ein wesentlicher Teil der Immunabwehr über die Lymphe und Lymphgefäße vermittelt wird (Hayes et al., 2011).
Aktuell gibt es keine klinisch etablierte und effektive Therapiemethode mit der das sekundäre Lymphödem ursächlich behandelt werden kann (Zheng et al., 2014). Der Goldstandard ist die rein symptomatische komplexe Entstauungstherapie (KPE) mit lebenslanger manueller Lymphdrainage, Kompressionstherapie, Bewegung und Hautpflege zur Volumenreduktion der betroffenen Gliedmaße (Cormier et al., 2012). Diese Therapiemöglichkeit stößt allerdings schnell an ihre Grenzen. Sie ist sehr zeit- und kostenintensiv und mit hoher Einschränkung der Lebensqualität verbunden (Cormier et al., 2012).
Im Tiermodell wurden verschiedenste pharmakologische und chirurgische Therapieansätze zur Verbesserung der Therapie des sekundären Lymphödems beschrieben. Ansätze der pharmakologischen Therapie sind etwa die lokale Applikation von lymphspezifischen Wachstumsfaktoren, wie der vascular endothelial growth factor C (VEGF-C)(Cheung et al., 2006; Jin et al., 2009; Tervala et al., 2015). Die Verabreichung von humanen Lymphendothelzellen (Kawai et al., 2014) oder Stammzellen, auch in Kombination mit VEGF-C (Zhou et al., 2011) resultieren ebenfalls in einer signifikanten Verbesserung des Lymphödems im Tiermodell. Die prokanzerogenen Effekte von pharmakologischen Therapieansätzen sind bisher nur bedingt erforscht, so dass diese Ansätze zurzeit im
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Einleitung klinischen Alltag noch keine Anwendung finden. Vielversprechende chirurgische Ansätze, wie die Lymphgefäßtransposition im Sinne einer lympho-lymphatischen Anastomose, die lympho-lymphonoduläre Anastomose (Wallmichrath et al., 2009), die Lymphknotentransplantation (Hadamitzky et al., 2009; Sommer et al., 2012), oder die autologe Lymphgefäßtransplantation sind im Tiermodell gut beschrieben und liefern erfolgreiche Ergebnisse in der klinischen Anwendung in der Humanmedizin (Baumeister et al., 2015; Becker et al., 2012). Zurzeit werden diese Techniken allerdings nur in einzelnen Zentren angewandt und haben aufgrund der Diskrepanz von Komplexität der Operation und nicht-kostendeckender Vergütung noch keinen Einzug in den klinischen Alltag gefunden.
Einen zusätzlicher Faktor ist auch die Unklarheit, welche der mikrochirurgischen Rekonstruktionstechniken des Lymphsystems die optimalste funktionelle Wiederherstellung des Lymphabflusses liefert.
Daher wurde die vorliegende Arbeit konzipiert, mit dem Ziel die Regenerationsfähigkeit des Lymphsystems nach Anwendung verschiedener Techniken der mikrochirurgischen Lymphabflussrekonstruktion in der Ratte zu vergleichen.
Verglichen wurden die lympho-lymphatische und lympho-lymphonoduläre Anastomose- Techniken und die Lymphgefäß- und Lymphknotentransplantation mit der Gruppe der Entfernung eines Lymphgefäßteils und der Ligatur eines Lymphgefäßes mit einer operativen Kontrollgruppe. Eine Überprüfung der Abflussrekonstruktion findet in dieser Studie zum einen makroskopisch mittels subkutaner Injektion des lymphophilen Farbstoffs Patentblau in die Gliedmaße statt. Zum anderen erfolgt die Überprüfung der Regeneration morphologisch über eine Gadolinium- gestützte MRT-Lymphangiographie direkt postoperativ, an Tag 7 und 21 nach der Operation. Somit können an unterschiedlichen Tagen des Heilungsverlaufes die Signalintensitäten im Lymphknoten vor und hinter der Rekonstruktion gemessen und so ein Rückschluss auf die Durchgängigkeit und den aktuellen Lymphabfluss gezogen werden.
Weiterhin werden funktionelle Parameter wie die Verteilung des lymphspezifschen VEGF-C, des Tight Junction Markers Claudin-5 sowie vitale T- und B-Lymphozyten in den Lymphknoten und die Wachstumsfraktion der Zellpopulation mittels Ki-67 untersucht. Das Ergebnis dieser Arbeit in Bezug auf die funktionell beste Wiederherstellung des Lymphabflusssystems könnte helfen, die Entscheidung über die chirurgische Technik erheblich vereinfachen und die Prognose des Lymphödems, sowie die Regeneration mittels Gadolinium-MRT besser beurteilen.
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Literaturübersicht 2. Literaturübersicht
Die wichtigste Informationsquelle für dieses Projekt war das Medline-Research-System PubMed, welches seit dem Jahr 1966 etabliert ist. Dies stellt die größte medizinische Literaturdatenbank weltweit dar und wurde von der U.S. National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) etabliert. In diesem Verzeichnis sind nahezu alle wichtigen Veröffentlichungen im medizinischen Bereich seit 1950 einzusehen. Es wurde primär nach Tiermodellen in der sekundären Lymphödemtherapie gesucht und der Schwerpunkt auf chirurgische Fragestellungen gelegt.
2.1 Anatomie und Physiologie des Lymphsystems 2.1.1 Lymphangiogenese
Die Lymphangiogenese ist ein komplexer Vorgang bei dem die Lymphgefäße im Wesentlichen aus dem venösen System entstehen. (Norrmén et al., 2011; Tammela and Alitalo, 2010). Initial entwickeln Blutendothelzellen (BECs) eine Lymphendothelzell-Identität (Stacker and Achen, 2009). In Mausembryos entwickeln sich mit Hilfe der Prox-1 Genexpression erste Lymphendothel-Vorläuferzellen aus einer Subpopulation der BECs nahe der anterioren kardialen Venenanlage an Embryonaltag 9,5 bis 10 (E 9,5 /E 10). Im Verlauf der embryonalen Lymphangiogenese ist Prox-1 auf allen Lymphendothel-Vorläuferzellen (LECs) zu finden. Diese LEC Vorläuferzellen migrieren durch Aktivierung von VEGF-C mit seinem spezifischen Rezeptor VEGFR-3 zu 8 primären Lymphsäcken, welche sich entlang der anterior-posterioren Achse des Embryos ausbilden. In dieser Phase migrieren LECs aus diesen Lymphsäcken und bilden ein primäres Lymphnetzwerk (E 14,5 – 16,5). Das primitive Lymphnetzwerk besteht aus 6 Anteilen und deren Vernetzungen (Kressin and Schnorr, 2011).
Der kraniale Lymphsack ist der Saccus lymphaticus jugularis von der Schädelbasis bis zur Vordergliedmaße, welcher auf Höhe des Venenwinkels (Vereinigung der V. jugularis externa und V. jugularis interna mit der V. subclavia) in das Venensystem mündet (Kressin and Schnorr, 2011). Weitere Anteile sind der Saccus lymphatics iliacus aus dem sich das Lymphsystem in der Lenden- und Darmbeingegend entwickelt, sowie der Saccus lymphaticus inguinalis in der Leistengegend bis zur Hintergliedmaße (Kressin and Schnorr, 2011). Die Cisterna chyli auf Hohe der Nebennierenanlage dient als abdominale Verbindung der Lymphbahnen (Kressin and Schnorr, 2011). Der Saccus lymphaticus retroperitonelais, aus dem die Darmlymphknoten hervorhegen verbindet den Saccus lymphaticus iliacus mit der Cisterna chyli (Kressin and Schnorr, 2011). Der Ductus thoracicus ist der letzte Anteil des primitiven Lymphsystems und verbindet sich aus seinen zwei Anteilen in der Entwicklung mit dem linken Venenwinkel (Kressin and Schnorr, 2011). Ab Embryonaltag 16,5 reifen die
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Literaturübersicht LECs heran und exprimieren den lymphspezifischen Hyaluron Rezeptor LYVE-1. Es differenzieren zwei verschiedene Arten von Lymphgefäßen aus dem primitiven Lymphnetzwerk und die Lymphknoten aus den Lymphsäcken. Zum einen die blind endenden Lymphkapillaren und zum andern Lymphkollektoren mit Lymphklappen für einen unidirektionalen Lymphtransport (Bazigou et al., 2014). Im adulten Gewebe findet Lymphangiogenese vorrangig während Entzündungsprozessen, Wundheilung oder Tumormetastasierung (Tammela and Alitalo, 2010) und primär durch Aussprossung aus existierenden Lymphgefäßen statt (Norrmén et al., 2011). Hauptverantwortlich für die Lymphangiogenese sind vor allem der Wachstumsfaktor VEGF-C und seine Rezeptoren VEGFR-2 und VEGFR-3 (Krebs et al., 2013). VEGFR-3 wird in der frühen Embryonalentwicklung zunächst von allen Endothelzellen exprimiert, aber im adulten Gewebe reduziert sich die Expression fast ausschließlich auf die Lymphendothelzellen, während VEGFR-2 als primärer Rezeptor auf den Blutendothelzellen für deren Wachstum zuständig ist (Krebs et al., 2013).
2.1.2 Vorkommen und Aufbau der Lymphgefäße
Lymphgefäße kommen typischerweise in allen vaskularisierten Geweben, außer dem Knochenmark und dem zentralnervösen System vor (Tammela and Alitalo, 2010). Besonders viele Lymphgefäße lassen sich neben dem fett-absorbierenden Dünndarm in Bereichen finden, die häufig in Kontakt zu körperfremden Antigenen stehen. Diese sind vor allem die Haut und muköse Schleimhäute (Tammela and Alitalo, 2010). Das Lymphsystem befördert eiweißreiche Flüssigkeit aus dem interstitiellen Gewebe von peripher nach zentral und bildet einen offenen Kreislauf. Den Anfang stellen die prälymphatischen Kanälchen dar, die aus den faser- und zellfreien Spalträumen des interstitiellen Bindegewebes gebildet werden. Diese sind 1-5 µm breit und bilden die erste Leitstruktur der Sammlung von Gewebsflüssigkeit. Als lymphatische Einrichtung folgen blind endende, aus einschichtigen Lymphendothelzellen (LEC) bestehende Lymphkapillaren ohne Basalmembran. Sie bilden ein Maschenwerk von 0,1 - 1 mm Abstand und besitzen einen Durchmesser von 50 – 70 µm (Földi and Földi, 2011).
Diese eichenblattförmigen LECs sind untereinander mit Tight junctions verbunden und verhindern aufgrund ihrer speziellen Form das Austreten von Lymphflüssigkeit ins Interstitium. Die Enden der lymphatischen Endothelzellen sind frei beweglich, und nur mittels Ankerfilamenten an der Basis dieser Enden mit der extrazellulären Matrix verbunden (Schulte-Merker et al., 2011). Bei geringerem interstitiellem Druck können Flüssigkeit, Makromoleküle und körpereigene Zellen aus dem Interstitium in die Lymphbahn eintreten
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Literaturübersicht und bei hohem interstitiellem Druck schützen Ankerfilamente die Lymphbahn vor einem Kollabieren der Lymphgefäße (Abb. 1).
Abb. 1: Aufbau einer Lymphkapillare, modifiziert nach (Schulte-Merker et al., 2011)
a) geringer interstitieller Druck b) hoher interstitieller Druck, Legende: ZO) Zona occludens;
AF) Ankerfilamente; LEC) Lymphendothelzelle; Z) körpereigene Zelle
Die Lymphflüssigkeit besteht aus Plasmaproteinen, Gewebswasser, Fettsäuren und körpereigenen Zellen und wird nach Aufnahme über Lymphkapillaren zu einschichtigen Lymphgefäßen, den Präkollektoren geleitet (Abb. 2).
Diese besitzen im Unterschied zu den Lymphkapillaren eine Basalmembran und sind lückenhaft mit glatten Muskelzellen umgeben. Diesen Präkollektoren folgen anschließend Lymphkollektoren, die mit Basalmembran, ebenfalls einschichtigen LECs und einem intakten Netz aus glatten Muskelzellen bestehen (Albrecht and Christofori, 2011). Der Aufbau der Kollektoren ähnelt sehr stark dem Aufbau der Blutgefäßwand. Auf der Innenseite befindet sich die Tunica intima, die vor allem aus Endothel und Basalmembran besteht. Nach extern folgt die Tunica media, mit einer Schicht aus glatter Muskulatur. Nach außen bildet die Tunica externa, aus lockerem Bindegewebe den Abschluss (Földi and Földi, 2011). Um einen Lymphrückfluss nach distal zu verhindern besitzen die Lymphpräkollektoren und -kollektoren vorwiegend zweiblättrige Klappen. Diese zeichnen sich durch ein Grundsubstanzgerüst mit aufliegenden lymphatischen Endothelzellen aus. Ein Klappensegment bildet eine funktionelle Einheit, das Lymphangion (Földi and Földi, 2011). Die Größe dieses funktionellen Anteils und damit der Abstand der Klappen untereinander beträgt ca. das Drei- bis Zehnfache des Gefäßdurchmessers (Földi and Földi, 2011). Zusätzlich findet ein unidirektionaler Lymphfluss mittels lymphatischen Muskelzellen (LMC) statt, die der Tunica externa der Lymphkollektoren aufgelagert sind (Bazigou et al., 2014). Den Lymphgefäßen zwischengeschaltet sind zahlreiche Lymphknoten mit ihren jeweils tributären Einzugsgebieten. Die Lymphe wird dann beim Säugetier über den Ductus thoracicus in den
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Literaturübersicht Venenwinkel (Zusammenfluss von Vena jugularis interna und Vena jugularis externa bzw.
Vena subclavia) (Budras, 2007) geleitet. So bilden Blut- und Lymphgefäßsystem einen Kreislauf, wodurch der Flüssigkeitsverlust aus dem Körper minimiert wird.
Abb.2: Das Lymphsystem, modifiziert nach (Földi and Földi, 2011)
2.1.3 Aufbau der Lymphknoten
Die Lymphknoten bei Mensch und Nager bestehen außen aus einer Kapsel mit hauptsächlich dicht gepackten Kollagenfasern, von der aus bindegewebige Trabekel ins Lymphknoteninnere ziehen. Durch diese Trabekel werden die Lymphknoten in Kompartimente geteilt, die funktionell auch verschiedene Einzugsgebiete haben können. Innerhalb der Kapsel lässt sich der Lymphknoten in Rinde und Mark einteilen, welche ein Grundgerüst aus retikulärem Bindegewebe haben. In der Rinde sind die Lymphozyten dicht gepackt während im innenliegenden Mark weniger Lymphozyten zu finden sind. Die afferenten Lymphgefäße schließen antihilär an den Lymphknoten an und gehen dann in den so genannten Randsinus über (Abb. 3). Die Lymphe fließt nachfolgend über den Radiärsinus (Intermediärsinus) entlang der Trabekel in den Marksinus (Földi und Földi, 2011). Am Hilus des Lymphknotens vereinigen sich der Marksinus und der Randsinus und führen die Lymphe als efferente Gefäße in Richtung Hauptsammelpunkt der Lymphe, dem Ductus thoracicus ab. Antihilär treten auch die Blutgefäße und Nerven zur Sauerstoffversorgung und Innervation der Lymphknoten ein, bilden ein Kapillarnetz nahe dem Randsinus und treten über den Hilus wieder aus. Dabei treten die vom B-Lymphozyten gebildeten Antikörper direkt in den Blutkreislauf ein (Földi and Földi, 2011).
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Literaturübersicht
Abb. 3: Aufbau eines humanen Lymphknotens modifiziert nach (Gong et al., 2013)
2.1.4 Aufgaben des Lymphsystems
90 % der interstitiellen Flüssigkeit wird über das venöse System zurücktransportiert. Der Rücktransport der restlichen Flüssigkeit findet zusammen mit den katabolischen Stoffwechselprodukten des Gewebes über das Lymphsystem statt (Albrecht and Christofori, 2011), so dass diesem eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase von Gewebsflüssigkeit zugeschrieben wird. Ferner ist die Absorption von Fettsäuren mittels Lymphgefäßen innerhalb der intestinalen Mikrovilli, die aus der Nahrung aufgenommen wurden (Tammela and Alitalo, 2010), eine essentielle Aufgabe des lymphatischen Systems.
Eine weitere wesentliche Aufgabe des Lymphsystems bei der Immunantwort ist der Transport von Immunzellen und die Interaktion der antigen-präsentierenden Zellen mit den Antigenen im Lymphknoten. Eine Dysfunktion oder ein Fehlen des Lymphsystems führt zu einem Volumenanstieg der Extremität und herabgesetzter Immunantwort (Tammela and Alitalo, 2010). In gesunden erwachsenen Menschen werden täglich ca. 1-2 Liter interstitieller Flüssigkeit (etwa 10-30 g Protein/Liter) in den venösen Kreislauf zurücktransportiert (Tammela and Alitalo, 2010).
2.2 Erkrankungen des Lymphsystems
In der Literatur sind zahlreiche Erkrankungen des Lymphsystems bei Mensch und Tier beschrieben. Die wichtigsten Ursachen und deren Folgen sind hier zusammengefasst:
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Literaturübersicht 2.2.1 Traumatisch / Iatrogene Schädigung
Eine Ruptur größerer Lymphgefäße oder des Ductus thoracicus führen in der Regel zu einem Chylothorax. Symptomatisch ist die milchige Konsistenz der Thoraxflüssigkeit, hervorgerufen durch die austretende Lymphflüssigkeit (Baumgärtner and Gruber, 2015).
Häufigste Ursache der Zusammenhangstrennung sind allerdings iatrogene Eingriffe wie etwa die diagnostische Lymphadenektomie oder der Einsatz der Lymphadenektomie als Karzinomtherapie bzw. Entfernung der Metastasen.
2.2.2 Obstruktionen und Lymphangiektasie
Obstruktionen der Lymphgefäße können extraluminal oder intraluminal bedingt sein.
Extraluminalen Prozessen liegen häufig starke Kompression von außen oder Umfangsvermehrung im Sinne eines Tumors oder Zyste zugrunde (Baumgärtner and Gruber, 2015). Intraluminale Obstruktionen, wie Verlegungen durch Tumormetastasen, welches im Hund beschrieben ist (Kang et al., 2007) oder Fibrose, können ebenfalls zu einem erheblichem Lymphstau führen.
Die weltweit häufigste infektiöse Erkrankung des Lymphsystems aufgrund einer intraluminalen Obstruktion ist die Filariose. Diese wird hauptsächlich hervorgerufen durch Nematoden der Gattung Onchocerca und Wucheria, die zu sekundären Lymphangitiden führen können. Lymphangiektasien, im Sinne einer pathologischen Erweiterung der Lymphgefäße, treten meist als eine Form des primären Lymphödems mit genetischer Komponente auf oder kommen in chronischen Stadien des sekundären Lymphödems vor wie etwa beim chronisch progessiven Lymphödem der Zugpferde (Affolter, 2013).
2.2.3 Entzündungen des Lymphsystems
Lymphangitiden können sich aufgrund von lokalen Entzündungsprozessen entwickeln oder systemisch auftreten. Beispiele sind die Aktinomykose des Rindes oder Tuberkulose, welche mit granulomatösen und abszedierenden Gewebsveränderungen einhergehen (Baumgärtner and Gruber, 2015).
2.2.4 Lymphödeme
Zahlreiche Erkrankungen des Lymphsystems äußern sich klinisch in einem Lymphödem.
Hierbei entsteht ein Ungleichgewicht der abzutransportierenden Menge an Lymphflüssigkeit, der Transportkapazität und Anzahl der funktionsfähigen Lymphgefäße äußert sich klinisch in einem Lymphödem (Hayes et al., 2011). In der Medizin werden diese in primäre und sekundäre Lymphödeme eingeteilt. Primäre Lymphödeme resultieren vor allem aus einer genetischen Entwicklungsstörung des Lymphsystems. Dieses Krankheitsbild äußert sich meist
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Literaturübersicht in kongenitaler Aplasie/Hypoplasie der peripheren Lymphgefäße bzw. Anomalitäten des Ductus thoracicus oder kongenitaler Veränderungen der Lymphgefäßklappen, die mit Insuffizienz und Megalymphgefäßen einhergehen kann (van der Walt et al., 2009). Das sekundäre Lymphödem kommt sowohl in der Human- als auch in der Tiermedizin wesentlich häufiger vor. Ursachen können wie oben aufgeführt Traumen, iatrogene Eingriffe wie Lymphadenektomie oder Strahlentherapie oder auch infektiöse Lymphgefäßverschlüsse sein.
Zudem ist das sekundäre Lymphödem auch bei Hunden nach Mastektomie beschrieben. In diesen Fällen waren periphere Lymphgefäße durch Tumormetastasen verlegt worden und es kam so zu einem sekundären Rückstau der Lymphe in die Gliedmaße (Kang et al., 2007). Das Hauptsymptom des sekundären Lymphödems ist eine in der Regel unilaterale Schwellung der betroffenen Gliedmaße, die durch eine Ansammlung von eiweißreicher Flüssigkeit im Gewebe zustande kommt (Cheville et al., 2003). Die Symptome des sekundären Lymphödems sind v.a. Schmerz sowie Schwere- und Druckgefühl der betroffenen Extremität. Die Einschränkungen im täglichen Leben (v.a. Feinmotorik und Bewegungsradius) können zu einer erheblichen physischen Morbidität führen (Hayes et al., 2011). Die tägliche Konfrontation mit der geschwollenen Gliedmaße kann zudem eine hohe psychische Belastung darstellen und mit Angstzuständen, Depression oder emotionalem Ungleichgewicht einhergehen (Fu and Kang, 2013). Das sekundäres Lymphödem scheint in einigen Studien auch einen negativen Einfluss auf die Gesamtletalität bei bestimmten Patientenpopulationen zu haben (Hayes et al., 2011).
2.2.5 Aktuelle Behandlungsmethoden von Lymphödemen
Aktuell gibt es noch keine effektive Therapiemethode mit der das sekundäre Lymphödem zufriedenstellend behandelt werden kann (Zheng et al., 2014). Der Goldstandard ist die rein symptomatische Komplexe Physikalische Entstauungstherapie (KPE). Hierbei handelt es sich um eine lebenslange Therapie mit Kombination aus Kompressionstherapie, manueller Lymphdrainage, Bewegung und Hautpflege in zwei Phasen (Cormier et al., 2012). In der ersten Phase findet eine Volumenreduktion durch hochfrequente manuelle Lymphdrainage, Kompressionsbestrumpfung und Bewegung statt. Die zweite Phase dient der Aufrechterhaltung des zuvor erzielten Volumens durch lebenslange Bestrumpfung der betroffenen Gliedmaße, Hautpflege zum Schutz vor Infektionen und physikalischer Bewegungstherapie. Trotz symptomatischer Therapie ist die Lebensqualität der Betroffenen je nach Ausprägung lebenslang eingeschränkt. Zusätzlich ist die Therapie sehr zeit- und kostenintensiv und kann mit partieller Berufsunfähigkeit einhergehen.
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Literaturübersicht 2.3 Tiermodelle in der Lymphforschung
Um die Therapie des sekundären Lymphödems zu verbessern wurde diese klinische Fragestellung zunächst auf verschiedenste Tiermodelle übertragen (Clodius and Wirth, 1974;
Danese et al., 1962; Shesol et al., 1979). Der bedeutendste Durchbruch in der Erforschung sekundärer Lymphödeme im Tiermodell gelang Olszewski et al. in Hunden (Olszewski et al., 1968). Die Neuerung im Vergleich zu den zuvor etablierten Methoden war die zirkumferentielle Exzision der Hintergliedmaße, um auch die tiefen Lymphgefäße zu erreichen, wodurch es gelang, stabile Lymphödeme im Tiermodell zu schaffen. Die Autoren setzten einen ca. 2 cm breiten zirkulären Haut- und Unterhautschnitt vom oberen Teil der Hintergliedmaße der Hunde. Nach Hämostase wurden die Faszien entlang dieses zirkulären Schnittes inzidiert, und auf einer Länge von 4 cm die femoralen Lymphbahnen mit dem umliegenden Gewebe entlang des femoralen Neurovaskulären Bündel entfernt. Auch das Periost des Femur wurde eingeschnitten und auf einer breite vom 1 cm zirkumferentiell entfernt. Die Hautenden wurden an die Muskel genäht und die entstandene Gewebelücke verblieb geöffnet zur sekundären Wundheilung (Olszewski et al., 1968).
2.3.1 Sekundäre Lymphödeme im Großtiermodell
Da der Lymphfluss primär von der Muskelaktivität, der Position des Körpers, den Atembewegungen und der Kapillarpermeabilität abhängt, wurden in der Lymphforschung auch Großtiermodelle etabliert, die den Gegebenheiten im humanen Gewebe ähnlicher sind.
Die chirurgische Entfernung eines oder mehrerer Lymphknoten (Lymphknotendissektion) ist die am besten etablierte Methode um ein sekundäres Lymphödem im Großtiermodell zu provozieren. Großtiere, im Besonderen Schweine und Schafe, weisen abgesehen von der anatomisch größeren Ähnlichkeit auch ein ähnlich geringeres Potential der endogenen lymphatischen Regeneration auf, so dass sich im Unterschied zum Nager die Lymphgefäße nicht selbstständig über eine große Defektstrecke regenerieren können. Während in den Anfängen der Lymphödemforschung Hunde als Modell weit verbreitet waren (Clodius and Wirth, 1974; Olszewski et al., 1968), werden heute primär Schafe oder Schweine verwendet.
Tobbia et al. konnten in einer Studie zeigen, dass in Schafen nach Entfernung des poplitealen Lymphknotens in Kombination mit der Ligatur der angrenzenden Gefäße ein Lymphödem für 16 Monate aufrechterhalten werden konnte (Tobbia et al., 2009). Ein ähnlicher Ansatz des operativen erzeugten Lymphödems wurde von Lähteenvuo et al. an Hintergliedmaßen von Schweinen etabliert (Honkonen et al., 2013; Lähteenvuo et al., 2011).
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Literaturübersicht 2.3.2 Das Kaninchenohrmodell für sekundäre Lymphödeme
Die Technik der zirkumferentiellen Exzision der Haut und Unterhaut wurde auch auf das Modell des Kaninchenohrs übertragen. In diesem Ansatz wird an der Kaninchenohrbasis ebenfalls eine zirkumferentielle Exzision der oberflächlichen und tiefen Lymphgefäße durchgeführt mit Belassen des neurovaskulären Bündels in diesem Bereich (Fu et al., 1998;
Kubo et al., 2010; Szuba et al., 2002; Yoon et al., 2003). Nach anfänglicher großzügiger Entfernung des Knorpels an der Kaninchenohrbasis beschrieben Fu et al. eine restriktive, Perichondrium sparende Technik mit Formung einer „Hautbrücke“ um das verbleibende neurovaskuläre Bündel (Fu et al., 1998). Um bei dieser gewebserhaltenden Methode dennoch ein stabiles Lymphödem zu schaffen, wird in diesem Modell die Wunde des exzidierten Knorpels an den Enden invers am verbleibenden Perichondrium vernäht. So konnten auch in diesem Modell stabile sekundäre Lymphödeme generiert werden (Szuba et al., 2002; Yoon et al., 2003).
2.3.3 Der kleine Nager als Modell für das sekundäre Lymphödem
Heutzutage findet die Lymphödemforschung, aufgrund von einfacherem Handling und Beschaffung bei ähnlich guten Ergebnissen, primär am kleinen Nager statt. Die zirkumferentielle Exzision der gesamten Dicke der Haut und Unterhaut erreicht die oberflächlichen und tiefen Lymphgefäße, wobei das neurovaskuläre Bündel erhalten bleibt.
Die meist verwendeten Ansätze am kleinen Nager sind an der Hintergliedmaße (Cheung et al., 2006; Zhou et al., 2011) oder am Schwanz (Avraham et al., 2009; Ongstad et al., 2010; Pan et al., 2006). Zunächst erfolgt eine Blaufärbung der Hauptlymphgefäße mittels lymphophilen Farbstoffen wie Methylen Blau oder Patentblau (Cheung et al., 2006) durch peripher subkutane/intrakutane Injektion. Anschließend werden die Lymphgefäße entweder reseziert, ligiert oder kauterisiert, um die Durchgängigkeit in diesem Bereich zu stoppen und so den Lymphabfluss aus der Gliedmaße zu behindern (Cheung et al., 2006). In manchen Ansätzen wird zusätzlich eine Lymphknotendissektion durchgeführt, um ein stabiles Lymphödem zu generieren (Zhou et al., 2011).
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Literaturübersicht 2.4 Pharmakologische Lymphödemtherapie
Das sekundäre Lymphödem birgt nach wie vor noch Unklarheiten in seiner molekularbiologischen Entstehungsweise. Daher wird in der Literatur auf verschiedenste Weise versucht, pharmakologische Ansatzpunkte zur Reduktion der Ödematisierung im Tiermodell zu finden.
2.4.1 VEGF-C und Signalwege
Der Vascular Endothelial Growth Factor-C (VEGF-C) ist nach bisherigem Wissenstand zusammen mit seinem Tyrosinkinase Rezeptor VEGFR-3 der bedeutendste Wachstumsfaktor für die Lymphangiogenese (Abb. 4) (Alitalo et al., 2005; Hadrian and Palmes, 2016; Lohela et al., 2009; Sweat et al., 2014).
Abb. 4: Signalwege der Angiogenese und Lymphangiogenese modifiziert nach (Hadrian and Palmes, 2016), Legende: rote Zellkerne) Blutgefäßendothelzellen; gelbe Zellkerne) Lymphgefäßendothelzellen;
rot und gelbe Zellkerne) Blut- und Lymphgefäßendothelzellen
In Veröffentlichungen, in denen VEGF-C im Tiermodell inhibiert wurde, konnte signifikant weniger sekundäre Lymphangiogenese nach iatrogenem Lymphödem nachgewiesen werden (Krishnan et al., 2003). Wurde allerdings VEGF-C in die Nähe des Lymphdefekts verbracht, konnte schon mit einmaliger Applikation eine signifikante Verbesserung der Lymphangiogenese gezeigt werden (Cheung et al., 2006; Sommer et al., 2012; Szuba et al., 2002). Diese positiven Effekte konnten im Kaninchenohrmodell (Yoon et al., 2003), als auch im kleinen Nager (Cheung et al., 2006; Jin et al., 2009; Sommer et al., 2012) gezeigt werden.
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Literaturübersicht 2.4.2 Stammzellen in der Lymphödemtherapie
Auch aus dem Knochenmark isolierte Stammzellen wurden im iatrogenen Lymphödemmodell der Ratte nach zirkumferentieller Exzision und Lymphknotenresektion zur Therapie des iatrogenen Lymphödems im Tiermodell verwendet (Zhou et al., 2011). Nach Injektion der Stammzellen in die exzidierte und bestrahlte Hintergliedmaße zeigten die Ergebnisse, dass die reine Stammzelltherapie eine geringgradige Verbesserung brachte und die Kombination mit VEGF-C eine signifikante Verbesserung bewirkte. Einen ähnlichen Ansatz wählten Hwang et al. im Lymphödemmodell der Maus indem sie Stammzellen aus Fettzellen generierten und diese postoperativ subkutan in die ödematöse Hintergliedmaße applizierten. Das beste Ergebnis konnte in Kombination mit VEGF-C nach 4 Wochen Heilungsphase erzielt werden (Hwang et al., 2011). Auch die Transplantation von humanen Lymphendothelzellen ins Tier zeigte eine erhebliche Verbesserung des sekundären Lymphödems (Kawai et al., 2014).
2.4.3 VEGF-C unabhängige Ansätze in der Lymphödemtherapie
Jeong et al. berichten von einem erhöhten Hyaluronsäure-Spiegel in der ödematösen Gliedmaße bei sekundärem Lymphödem, welche zu einem verlangsamten Zelltransport und zu einer erhöhten pro-inflammatorischen Zytokinausschüttung führen können (Jeong et al., 2013). Im Mausmodell zeigte die Applikation von Hyaluronidase im iatrogenen Lymphödem eine Verringerung des Ödems und eine Erhöhung an lymphspezifischen Faktoren VEGFR-3 und LYVE-1 (Jeong et al., 2013). Auch die Applikation von Hyaluronidase-Gel konnte das Ausmaß des sekundären Lymphödems im Modell signifikant reduzieren (Nekoroski et al., 2014). Auch lymphunspezifische Wachstumsfaktoren wie HGF (Hepatocyte Growth Factor) wurden im Lymphödem-Tiermodell eingesetzt und zeigten eine Abnahme der Ödematisierung der Gliedmaße unabhängig vom VEGF-C Signalweg (Saito et al., 2006).
Zusammenfassend sind die pharmakologischen Ansätze der sekundären Lymphödemtherapie vor allem in Hinsicht auf den Einsatz des lymphspezifischen Wachstumsfaktors VEGF-C vielversprechend. Aber auch VEGF-C unabhängige Therapien wie die Applikation von Hyaluronidase oder lymphunspezifischen Wachstumsfaktoren verbessern im Tiermodell die Ödematisierung der Gliedmaße nach induziertem Lymphödem. Bisher konnte sich dennoch kein pharmakologischer Ansatz über den tierexperimentellen Einsatz hinaus etablieren.
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Literaturübersicht 2.5 Chirurgische Lymphödemtherapie
Die chirurgischen Ansätze der Lymphödemtherapie lassen sich in exzisionale Techniken, deviierende Techniken und rekonstruktive Techniken einteilen (Abb. 5).
Abb. 5: Chirurgische Therapieformen des Lymphödems, modifiziert nach (Hadrian and Palmes, 2016)
2.5.1 Exzisionale Techniken
Als symptomatisch-chirurgische Therapie steht die Entfernung von subkutanem, fibrotischem Gewebe zur Verfügung. Diese kann entweder als reine Gewebeexzision oder als so genannte
„Liposuktion“ durchgeführt werden. Die Technik der Gewebsexzision im Sinne der Charles Technik (van der Walt et al., 2009) besteht aus einer radikalen Exzision des betroffenen Gewebes mit nachfolgender Hauttransplantation, um den Defektbereich adäquat zu verschließen. Aufgrund der Radikalität und des hohes Risikos von großflächiger Narbenbildung und chronischen Wunden bzw. verzögerter Wundheilung sollte diese Technik allerdings nur in Ausnahmefällen wie dem höchsten Stadium des Lymphödems (Stadium V Elephantiasis) angewendet werden (Wallmichrath et al., 2012a; van der Walt et al., 2009). Die Liposuktion, als zweite exzisionale Technik, ist eine Absaugung von überschüssigem Fettgewebe, welches sich in der ödematösen Gliedmaße angesammelt hat. Lange Zeit als Methode der Wahl zur Volumenreduktion angesehen, führt die Liposuktion jedoch häufig zu Komplikationen, wie Hämatomen, Hautnekrosen, tiefe Venenthrombosen, Narbenbildung, Zerstörung von verbliebenem Lymphgewebe, verringerter Beweglichkeit und der Persistenz des Lymphödems (Cormier et al., 2012). Dennoch hat die Liposuktion ihre Berechtigung in der Therapie von chronischen Lymphödemen mit Gewebsveränderungen. Diese Form einer stark ausgeprägten Fibrose und Fettakkumulation ist häufig durch die komplexe Entstauungstherapie (KPE) allein nicht zu bewältigen (Brorson, 2015). Die durch die Liposuktion erzielte Volumenreduktion wirkt sich sehr positiv auf die Lebensqualität der
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Literaturübersicht Patienten aus. Trotzdem muss weiterhin eine lebenslange Kompressionsbestrumpfung getragen werden, da diese Technik den Lymphabfluß nicht wiederherstellt und es andernfalls zu hohen Rückfallquoten in der Volumenausprägung der Gliedmaße kommt (Brorson, 2015).
2.5.2 Deviierende Techniken
Unter deviierenden Techniken werden Operationsmethoden zusammengefasst, die Abflüsse der Lymphe schaffen, welche physiologischerweise im Lymphabflusssystem nicht an diesen Orten vorkommen.
2.5.2.1 Flap-Transfer
Unter Flap-Transfer versteht man die Verpflanzung eines gestielten oder frei-transplantierten Gewebelappens aus einem gesunden Körperareal in den Bereich des sekundären Lymphödems (Mehrara et al., 2011). So wurden zum Bespiel vaskularisierte Pedikel des M.
rektus abdominis in das kaudale Abflussgebiet im kleinen Nager als mukokutaner Flap verlagert (Slavin et al., 1997). Ebenso konnte in LYVE-1 knockout Mäusen lymphatische Regeneration nach Gewebe-Flaps gezeigt werden. Die im Transplantat enthaltenen Lymphgefäße waren nach einer Heilungsphase von 6 Wochen an die Empfängergefäße angeschlossen und zeigten eine nahezu vollständige Regeneration (Yan et al., 2011).
Aufgrund der Tatsache, dass der Gewebetransfer mit beinhaltenden Lymphknoten eine bessere Regeneration zeigt, als ohne Lymphknoten, ist aus dieser Methode im Tiermodell die vaskularisierte Lymphknoten-Transplantation abgeleitet worden (Cheng et al., 2014).
2.5.2.2 Lympho-venöse Anastomose
Die lympho-venöse Anastomose ist ebenfalls eine deviierende Technik, da die einzigen obligatorischen Anschlussstellen vom Lymphsystem ans Blutgefäßsystem die subklavikulären Venenwinkel sind. Das Lymphgefäß wird bei dieser Methode der Lymphabflussrekonstruktion meist End-zu-Seit an eine gleichkalibrige Vene angeschlossen, um so den Lymphabfluss wiederherzustellen (Campisi et al., 2006; Wallmichrath et al., 2012a). Im Tiermodell wurden auch verschiedene Techniken der lympho-venösen Rekonstruktionen untersucht und miteinander verglichen. So gibt es Tiermodelle, in denen Lymphrekonstruktionen im Sinne einer lympho-venösen Anastomose mit einer Veneninterposition als Lymphgefäßüberbrückung verglichen wurde (Boccardo et al., 2013;
Campisi et al., 2011). Das Hauptproblem dieser Methode ist der hohe venöse Blutdruck gegen den der Lymphabfluss aufrechterhalten werden muss und die Gefahr der Thrombenbildung durch Blutkoagulation (Wallmichrath et al., 2009).
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Literaturübersicht 2.5.3 Rekonstruktive Techniken
2.5.3.1 Lympho-lymphatische Anastomose
Bei der lympho-lymphatischen Anastomose wird das zu rekonstruierende Lymphgefäß mit End-zu-End oder End-zu-Seit Anastomose an ein anderes intaktes Lymphgefäß angeschlossen. Diese Technik findet in der Humanmedizin meist als Transposition Anwendung. Nach Lymphadenektomie im Bereich der Leiste können z.B. intakte Lymphgefäße der Gegenseite getunnelt an gestaute Lymphgefäße der gegenüberliegenden Seite angeschlossen werden (Abb. 6). Der Abfluss beider Beine in dem Bereich wird dann über eine Körperseite geführt (Baumeister et al., 2015; Wallmichrath et al., 2012a).
Abb. 6: Lymphgefäßtransposition Oberschenkel, modifiziert nach (Baumeister et al., 2015)
2.5.3.2 Lympho-lymphonoduläre Anastomose
Bei der lympho-lymphonodulären Anastomose, wird das wiederherzustellende Lymphgefäß End-zu-Seit an einen nahegelegenen Lymphknoten angeschlossen. Im Rattenmodell konnten Wallmichrath et al. zeigen, dass der Anteil des effektiven Lymphflusses nach lympho- lymphonodulärer Rekonstruktion bei 100% lag, wohingegen die endogene Regeneration nach Durchtrennung des Lymphgefäßes ohne Anastomose nur 25 % ausmachte (Wallmichrath et al., 2012b). Der Vorteil dieser Technik ist der chirurgisch relativ einfache Anschluss von kleinen Lymphgefäßen an die inzidierte Lymphgefäßkapsel, im Vergleich zur chirurgisch anspruchsvolleren lympho-lymphatischen Anastomose. In der Humanmedizin ist dies oft ein Problem im Bereich der Hals- und Ohrlymphgefäße nach Lymphgefäßtransplantation bei Brustkrebs zur Überbrückung der Axillarregion.
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Literaturübersicht 2.5.3.3 Lymphgefäßtransplantation
Die Lymphgefäßtransplantation kommt vor allem dann in Betracht, wenn keine naheliegende physiologische Rekonstruktion möglich ist, wie z.B. durch zu große Entfernung der anatomischen Strukturen. Ein Beispiel für eine in der Humanmedizin angewandte Technik ist die Transplantation von drei bis vier peripheren Beinlymphgefäßen End-zu-End zwischen zwei bestehende Lymphgefäße der Axilla, wie etwa nach Axilla-Lymphknotendissektion (Baumeister et al., 2015; Wallmichrath et al., 2012a). Die Transplantation von autologen, peripheren Lymphgefäßen des gesunden Beins in die ödematöse Gliedmaße wird auch bei der Therapie von Genital- und Prostatakarzinomen angewandt (Baumeister et al., 2015).
2.5.3.4 Lymphknotentransfer/-transplantation
Eine weitere Technik ist der Lymphknotentransfer, bei dem ein oder mehrere Lymphknoten aus einen anderem Gebiet in die Defektstelle verbracht werden. Die Lymphknoten können als Teil einer Lappenplastik transplantiert werden, oder alternativ können auch einzelne oder mehrere Lymphknoten avaskulär transplantiert werden. Auch die vaskuläre Lymphknotentransplantation mit Anschluss der arteriellen und venösen Gefäße wurde durch Becker et al. beschrieben (Becker et al., 2006). Die Technik wurde vor der Anwendung in der Humanmedizin am Rattenmodell erprobt, bei dem der zervikale Lymphknotentransfer mit 5-6 Lymphknoten im Nacken vielversprechende Erfolge zeigte (Uygur et al., 2013). Auch im Großtiermodell konnte durch diese Methode eine lymphatische Regeneration nach vaskulärem Lymphknotentransfer, vor allem in der Kombination mit zusätzlicher lokaler Applikation von VEGF-C, zeigen (Lähteenvuo et al., 2011). In der Humanmedizin wird diese Methode mit guten Ergebnissen von einzelnen Gruppen vor allem bei jungen Patienten mit sekundärem Lymphödem angewendet (Becker et al., 2006, 2012). Bei der Methode der vaskulären Lymphknotentransplantation ist, ähnlich den Gewebeflaps, die Länge des vaskulären Pedikels entscheidend. Zusätzlich ist der Anschluss der arteriellen und venösen Gefäße zeitaufwendig und erfordert ein hohes Maß an mikrochirurgischem Geschick.
Chirurgisch einfacher ist die avaskuläre Transplantation von Lymphknoten und deren Fragmenten, die zu einer Lymphgefäßregeneration mit neuen Abflusswegen führen kann (Hadamitzky et al., 2009; Sommer et al., 2012). Nach avaskulärer Lymphknotentransplantation konnten vitale T- und B-Zellen im Transplantat, und so die funktionelle Regeneration des Lymphknotens nachgewiesen werden (Aschen et al., 2014;
Sommer et al., 2012). Diese Ergebnisse zeigen, dass sich auch avaskulär transplantierte Lymphknoten erneut vaskulär anschließen und wahrscheinlich ihre ursprüngliche Funktion
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Literaturübersicht aufnehmen. Auch die additive lokale Applikation von Platelet–Rich Plasma (PRP) (Hadamitzky et al., 2009) oder VEGF-C (Sommer et al., 2012; Tammela et al., 2007) zeigte eine Verbesserung der Lymphknotenregeneration. Auch die Transplantation von Lymphknoten-Fragmenten zeigte eine verbesserte Regeneration des Lymphabflusses, da aus einem Lymphknoten viele Regenerationsursprünge geschaffen werden konnten (Hadamitzky et al., 2009; Tammela et al., 2007). Der Vorteil des avaskulären Lymphknotentransfers ist die Möglichkeit der Überbrückung anatomisch weit auseinanderliegender Bereiche, da kein vaskuläres Pedikel benötigt wird. Dennoch ist es in dem Bereich des Lymphknotentransfers bzw. der Lymphknotentransplantation noch unklar, ob Lymphknoten in ihrer Gesamtheit oder als Fragmente transplantiert werden sollten, oder welche Teile des Lymphknotens am wichtigsten für die funktionelle Regeneration nach Rekonstruktion sind. In der Literatur sind sowohl im Tiermodell, als auch in der humanen Anwendung die rekonstruktiven Techniken am vielversprechendsten, da sie im Unterscheid zu den exzisionalen Techniken den Abfluss wiederherstellen und den besten OP-Erfolg im Sinne einer Reduzierung des Lymphödems mit den wenigsten Risiken für den Patienten verbunden sind (Baumeister et al., 2015). Mit Hilfe dieser Techniken kann es gelingen, den lymphatischen Abfluss so wiederherzustellen, dass betroffene Patienten keine Kompressionstherapie mehr benötigen. Zudem werden in den rekonstruktiven Techniken ausschließlich autologe Anteile des Lymphsystems verwendet, um die Abstoßung der autologen Lymphgefäße/ Lymphknoten zu verhindern (Baumeister et al., 2015).
2.5.4 Mögliche Komplikationen einer chirurgischen Therapie
Bei einigen Fällen der Lymphgefäßrekonstruktion kam es in der Vergangenheit neben den Abflussstörungen und daraus resultierender Volumenzunahme zu histologischen Umbauprozessen wie z.B: Fibrose oder Lipodystrophie, Lymphfisteln, Wundheilungsstörungen, Cellulitis und Elefantiasis (Mehrara et al., 2011). Eine Langzeitstudie nach Lymphgefäßtransplantation von Baumeister et al. konnten jedoch zeigen, dass auch bei einer Nachbeobachtungszeit von 10 Jahren eine signifikante Volumenreduktion aufrechterhalten werden konnte (Baumeister et al., 2015).
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Literaturübersicht 2.6 Bildgebende Methoden zur Darstellung des Lymphsystems
Zur Diagnosefindung und Einschätzung der Ausprägung eines Lymphödems ist die Lymphangiographie unerlässlich. Im Folgenden werden die gängigsten Methoden zur Sichtbarmachung des Lymphgefäßsystems aufgeführt.
2.6.1 Makroskopische Lymphangiographie mittels Patentblau
Die Darstellung mit Patentblau V als lymphophiler Farbstoff ist in der Literatur im Tiermodell hinreichend bekannt (Lähteenvuo et al., 2011; Oashi et al., 2012; Saito et al., 2006; Sommer et al., 2012). Die Injektion erfolgt subkutan in die Dorsalfläche der Hintergliedmaße zwischen erster und zweiter Zehe. Nach 1-5 Minuten ist der Triphenylmethanfarbstoff (siehe Anhang) über die Lymphgefäße abtransportiert und kann im Operationsgebiet in den Lymphgefäßen und Lymphknoten makroskopisch gesehen werden. Durch Bewegen der Gliedmaße über eine Minute kann die Sichtbarkeit in kürzerer Zeit erreicht werden. Diese Methode wird präoperativ zur Darstellung der Lymphgefäße und Kollateralen und postoperativ am Tag der Organentnahme zur makroskopischen Überprüfung der Durchgängigkeit der Anastomose eingesetzt. Auch in der Humanmedizin findet Patentblau Anwendung in der perioperativen Färbung von Sentinel-Lymphknoten z.B. bei Brustkrebstherapie (Malur et al., 2001).
2.6.2 Lymphszintigrapie
Der Goldstandard der nicht invasiven Darstellung des funktionellen Lymphsystems ist die Lymphszintigraphie. In dieser Methode wird ein radioaktiver Marker (meist Technetium 99) in ähnlicher Weise wie das Patentblau intradermal zwischen die ersten beiden Zehen appliziert. Die Detektion des Lymphflusses erfolgt in dieser Methode mittels Gamma- Kamera, die die Menge des radioaktiven Materials in einem Bereich des Lymphsystems misst (Notohamiprodjo et al., 2009; Weiss et al., 2014). Diese Technik bietet eine gute Möglichkeit Rückflüsse von radioaktivem Marker im Sinne einer Abflussstörung zu detektieren und so Rückschlüsse auf die Funktionalität des Lymphgefäßsystems zu geben. Nachteile der Lymphszintigraphie sind jedoch, dass keine klare Aussage über die morphologische Korrelation zum umliegenden Gewebe geliefert werden kann und die Eindringtiefe durch das Gewebe limitiert ist. Ferner ist der Patient bei dieser Darstellung des Lymphsystems einer radioaktiven Ionisierung des Gewebes ausgesetzt und die räumliche und zeitliche Auflösung ist gering. Dadurch lässt sich auch die Beobachtung erklären, dass in der Lymphszintigrapie die Lymphknoten gut dargestellt werden können, aber die Lymphgefäße zum Teil schwer sichtbar sind (Notohamiprodjo et al., 2012).
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Literaturübersicht 2.6.3 MRT Lymphangiographie
MRT Prinzip
Die Magnetresonanztomographie funktioniert im Unterschied zur Lymphszintigraphie ohne radioaktive Marker und ohne ionisierende Strahlung wie im CT oder Röntgen. Vielmehr stellt es ein Schnittbildverfahren dar, welches den Kernspin von Wasserstoffprotonen ausnutzt.
Jedes Proton besitzt einen Spin, der vereinfacht als Eigenrotation dargestellt werden kann, und eine positive elektrische Ladung besitzt. Durch die sich rotierende elektrische Ladung besitzt das Proton somit ein magnetisches Moment, welches von externen Magnetfeldern und elektromagnetischen Wellen beeinflusst werden kann. Befindet sich nun ein Proton in einem externen Magnetfeld (gemessen in Tesla), so richtet sich sein Spin in Richtung (parallel) oder gegen die Richtung (anti-parallel) des externen Magnetfeldes aus. Dabei rotiert es (Präzessionsbewegung) mit einer bestimmten Geschwindigkeit (Präzessionsgeschwindigkeit) um die Achse des externen Magnetfeldes (präzedieren). Die Geschwindigkeit der Bewegung steigt mit der Feldstärke des externen Magneten an. Die parallele Ausrichtung der Spins ist energetisch günstiger, als die antiparallele Ausrichtung, wodurch ein Besetzungsunterschied zu Gunsten der parallelen Ausrichtung entsteht. Dieser Besetzungsunterschied führt zu einer Gesamtmagnetisierung in Richtung des Magnetfeldes (longitudinale Magnetisierung). Je höher nun die Magnetfeldstärke des externen Magnetes ist, umso größer ist dieser Besetzungsunterschied und umso größer wird somit auch die Gesamtmagnetisierung (Weishaupt et al., 2013).
Regt ein externer Hochfrequenzimpuls nun das Gewebe mit der gleichen Frequenz an wie die Präzessionsfrequenz der Spins (Lamorfrequenz), so wird die Magnetisierung langsam in die Transversalebene ausgelenkt. Die Auslenkung der Magnetisierung ist abhängig von der Einstrahldauer des Impulses (Pulsdauer) und der Pulsleistung. Findet die Auslenkung in einem Winkel von 90° statt, so wird die Gesamtmagnetisierung vollständig in die Transversalebene gekippt und das maximale MRT Signal kann ausgelesen werden. Diese Transversalmagnetisierung ist so lange existent, wie der HF-Puls eingeschaltet ist, da die Spins in der Zeit alle in “Phase“ rotieren, also alle Vektoren die gleiche Ausrichtung haben.
Durch die Präzessionsbewegung der Gesamtmagnetisierung im externen Magnetfeld wird so eine Spannung induziert, die mittels Empfängerspule detektiert werden kann (Weishaupt et al., 2013).
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Literaturübersicht Wird nun der Hochfrequenzimpuls abgeschaltet, laufen die beschriebenen Prozesse rückwärts.
Die longitudinale Magnetisierung nimmt wieder zu, weil die Gesamtmagnetisierung zurück ins thermische Gleichgewicht (longitudinale Ausrichtung) relaxiert. Die Zeitkonstante, in der die longitudinale Magnetisierung wieder auf das Ausgangsniveau ansteigt heißt longitudinale Relaxation T1, die sich mit Stärke des Magnetfeldes verlängert. Die transversale Magnetisierung nimmt bei fehlendem Puls wieder ab, da die Spins durch Spin-Spin Wechselwirkungen dephasieren (Spinausrichtung asynchron). Die Zeit in der die transversale Magnetisierung wieder abnimmt nennt man transversale Relaxationszeit T2 (Weishaupt et al., 2013). Zwischen zwei Anregungspulsen liegt die Repetitionszeit TR und die Zeit zwischen Anregungspuls und Messung des Signals ist die Echozeit TE. Bei der Aufnahme eines MRT Bildes sind diese beiden Parameter hauptverantwortlich für den Gewebekontrast. Da verschiedene Gewebe unterschiedliche Relaxationszeiten (T1) haben um in den Ausgangszustand der longitudinalen Relaxation zurückzukehren, kann über die Variation der Repetitonszeit TR dieser Effekt verstärkt werden. So generieren Gewebe mit kurzem T1 (schnelle Relaxation) bei kurzer Repetitonszeit TR ein helleres Signal, als Gewebe mit langem T1, da bei der nächsten Anregung wieder mehr Longitudinalmagnetiserung für die Akquisition zur Verfügung steht. Hierbei spricht man von T1-gewichteten Aufnahmen. Wird TR allerdings zu lang gewählt verringert sich der Bildkontrast zwischen unterschiedlichen Geweben und wird als ähnlicher Grauwert im Bild dargestellt (Abb. 7). Analog dazu verhält es sich mit der Variation der Echozeit auf T2 gewichteten Bildern.
Abb. 7: T1-gewichtete MRT Bildgebung, modifiziert nach (Weishaupt et al., 2013)
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Literaturübersicht Gadolinium Magnetresonanz Lymphangiographie (MRL)
Um einen deutlicheren Unterschied in den Geweben zu sehen, sind Kontrastmittel mit paramagnetischen Bestandteilen gebräuchlich, welche die Relaxationszeiten verändern (Scott, 2013). Gadolinium-gestützte Kontrastmittel (GBCAs) verkürzen die T1 und T2 Relaxationszeiten im umliegenden Gewebe aufgrund des Anteils an paramagnetischen Partikeln. Der Grund für diese stark paramagnetische Eigenschaft sind 7 ungepaarte Elektronen in den äußeren Schalen des Gadoliniums (Weishaupt et al., 2013). In welcher Höhe diese Kontrastmittel die Relaxationszeiten verändern, ist abhängig von der Konzentration des Agens im Gewebe, der Feldstärke des Magnetfeldes und dem relativen Verhältnis von T1 und T2 Relaxation. In T1 gewichteten Darstellungen (kurzes TR, siehe Abb. 7) führt die Verkürzung der T1 und der T2 Zeiten zu einer zusätzlichen Signalerhöhung des umliegenden Gewebes und somit zur helleren Darstellung im MRT Bild.
Unkomplexiertes Gadolinium ist aufgrund seiner Ähnlichkeit zum Ionendurchmesser von Kalzium hochtoxisch. Durch den Austausch von Gd mit Kalzium blockiert es wichtige physiologische Prozesse wie die Zellatmung, Muskelaktivität und Blutgerinnung. Durch Komplexierung des Gadoliniums mit einem Chelat-Liganden entsteht ein stabiler, wasserlöslicher Komplex, welcher eine gute vaskulär/interstitielle Verteilung mit renaler Elimination aufweist (Weishaupt et al., 2013).
Als Kontrastmittel wird in diesem Projekt daher komplexiertes Gadolinium (Gd) in T1 gewichtetem MRT Bild verwendet, welches im klinischen Alltag in der Humanmedizin meist intravenös verabreicht und zur Angiographie verwendet wird (Shokrollahi, 2013). Gd-basierte Kontrastmittel eignen sich auch gut für die MRT-Lymphangiographie, da sie nach intradermaler bzw. subkutaner Applikation hauptsächlich über den Lymphweg abtransportiert werden und nur ein geringer Teil über Blutkapillaren ins venöse System gelangt. So sammelt sich das in dieser Studie verwendete Gadobutrol (Gd-DO3–butrol) bei subkutaner Injektion in die Gliedmaße in den dortigen Lymphgefäßen und führt zu einer exakten morphologischen Darstellung derselben (Fink et al., 2002).
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Literaturübersicht 2.7 Marker zur funktionellen Überprüfung der Lymphrekonstruktion
Zur funktionellen Überprüfung der Lymphrekonstruktion wurden folgende Marker ausgewählt, welche mittels Immunfluoreszenz oder Western Blot nachgewiesen wurden.
2.7.1 VEGF-C
Die endothelialen Wachstumsfaktoren (engl. vascular endothelial growth factor - VEGF) spielen sowohl in der Angiogenese, als auch in der Lymphangiogenese eine bedeutende Rolle (Lohela et al., 2009). Die Stimulierung des VEGFR-2 (engl. vascular endothelial growth factor receptor–2) Rezeptors durch VEGF ist ein relevanter Faktor der Angiogenese, wohingegen in der Lymphangiogenese die VEGF-C/ VEGF-D Interaktion mit dem Tyrosinkinase Rezeptor VEGFR-3 von außerordentlicher Bedeutung ist (Lohela et al., 2009) (siehe Abb. 4). VEGF-C und VEGF-D werden schon sehr früh in der embryonalen Entwicklung von den lymphatischen Endothelzellen exprimiert (E12.5 in Mäusen) (Baluk and McDonald, 2008). In VEGF-C Knock-out Mäusen konnte kein Lymphsystem ausgebildet werden, da dieser Wachstumsfaktor maßgeblich für das Aussprossen der Lymphgefäßendothel-Vorläuferzellen aus den Blutendothelzellen verantwortlich ist (Karkkainen et al., 2001). Auch ein Fehlen seines Rezeptors VEGF-R 3 resultiert im Mausmodell in einer hochgradig gestörten Bildung des Lymphsystems in bis zu 70 % der Fälle (Karkkainen et al., 2001). In Abwesenheit von VEGF-D entwickelt sich das Lymphsystem im Mausembryo hingegen physiologisch (Lohela et al., 2009). Bei Überexpression von VEGF-C, VEGF-D oder VEGFR-3 wird die Lymphangiogenese stark begünstigt (Tab. 1).
2.7.2 LYVE-1
Der Hyaluronrezeptor des Lymphendothels (engl. lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor - LYVE-1) ist ein transmembranes Glykoprotein, welches spezifisch von lymphatischen Endothelzellen produziert wird (Banerji et al., 1999). LYVE-1 ist homolog dem blutgefäßspezifischen Hyaluronrezeptor CD-44 und übernimmt wahrscheinlich eine ähnliche Funktion im Lymphgefäßendothel. In der Interaktion mit Hyaluronsäure spielt dieser Rezeptor eine herausragende Rolle in der Homöostase und auch speziell in der Wundheilung (Banerji et al., 1999). Die Ausbildung des Proteins findet auf der gesamten luminalen und extraluminalen Oberfläche der lymphatischen Endothelzellen statt (Baluk and McDonald, 2008). LYVE-1 ist im adulten Organismus in intakten Lymphgefäßen kaum nachweisbar. Im Rahmen der Lymphgefäßregeneration z.B. nach traumatischer Schädigung, kommt es im Regenerationsgebiet zu einer erhöhten Expression, primär in den initialen Lymphkapillaren
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Literaturübersicht (Alitalo et al., 2005; Baluk and McDonald, 2008). Daher wird LYVE-1 in zahlreichen Publikationen als Lymphgefäßmarker verwendet (Oashi et al., 2012; Ongstad et al., 2010) (Tab. 1).
2.7.3 Claudin 5
Tight Junctions sind die Grundlage einer undurchlässigen Verbindung zwischen Epithelzellen und spielen eine wichtige Rolle in der Gewebehomöostase. Hauptbestandteile dieser Zell- Zellkontakte sind Membranproteine wie Occludine und Claudine (Coyne et al., 2003). In Lymphkapillaren sind Tight Junctions nicht kontinuierlich ausgebildet, während Lymphkollektoren wie Blutgefäße durchgehende Zell-Zell-Verbindungen dieser Art aufweisen (Baluk et al., 2007). Claudin-5 kann mittels gut etablierter Verfahren nachgewiesen werden und dient in dieser Arbeit als Nachweis der funktionellen Regeneration der Zell- Zellkontakte im Lymphgefäß (Tab. 1).
2.7.4 Von-Willebrand-Faktor
Das Protein Von-Willebrand-Faktor (VWF) wird von Endothelzellen und Megakaryozyten synthetisiert und in den Weibel-Palade-Körperchen der Endothelzellen gespeichert. Er besitzt eine Schlüsselrolle in der Hämostase (Castaman, 2011; Michaux et al., 2006; Ruggeri, 1997).
Zum einen ist die Anwesenheit dieses Faktors essenziell für die Adhäsion der Thrombozyten an das Subendothelium, für die Thrombozyt-Thrombozyt-Interaktionen und die Aggregation der Thrombozyten in den Gefäßen (Castaman, 2011). Zum anderen ist der VWF ein Plamatransportprotein für Blutgerinnungsfaktor VIII und schützt diesen vor frühzeitiger Degradation. (Castaman, 2011). Von-Willebrand-Faktor (VWF) Antikörper werden daher oft zur Darstellung von Blutgefäßendothelien verwendet (Tab. 1).
2.7.5 Ki67
Das Protein Ki-67 fungiert als Indikator der Proliferationsaktivität. Während Ki-67 in der Interphase nur im Nucleus detektiert werden kann, wird es in der Mitosephase an der Oberfläche der Chromosomen exprimiert. Ki-67 kann in allen aktiven Phasen des Zellzyklus (G1, S, G2, und Mitosephase) detektiert werden, wohingegen es in der G0 Phase nicht exprimiert wird. Ki-67-positive Zellen fungieren daher als Marker der proliferativen Fraktion der Zellpopulation (Scholzen and Gerdes, 2000). Auch in der Lymphforschung kann Ki-67 nachgewiesen werden (Yoon et al., 2003), um den Anteil der proliferierenden lymphatischen Endothelzellen zu bestimmen (Tab. 1).
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Literaturübersicht 2.7.6 CD-3
Cluster of Differentation (CD) sind Gruppen verschiedener Oberflächenmerkmale von Zellen.
T-Lymphozyten erkennen Antigene mit Hilfe ihres T-Zellrezeptorkomplexes (TCR) an der Zelloberfläche. In diesem Komplex lassen sich zusätzlich zu variablen Anteilen CD-3 Proteine als feste Bestandteile der Antigenbindung am TCR charakterisieren (Gil et al., 2011).
Es wird angenommen, dass CD-3 delta eine wichtige Rolle in der Zelldifferenzierung und Reifung von T-Zellen spielt (Lam et al., 2014). CD-3 kann aufgrund dieser Eigenschaften stellvertretend für vitale T-Zellen detektiert werden (Tab. 1).
2.7.7 CD-19
CD-19, als ein Glykoprotein der Immunglobulin Familie ist ein wichtiger Biomarker für B- Zellen und follikuläre dendritische Zellen (Wang et al., 2012). CD-19 fungiert im Rezeptorkomplex auf der Oberfläche von B-Zellen als Faktor für die Zelldifferenzierung und Reifung von B-Lymphozyten (Wang et al., 2012). Die Expression von CD-19 in reifen B- Zellen ist 3-fach erhöht gegenüber unreifen B-Zellen und spielt eine Schlüsselrolle in der Antigen-unabhängigen Entwicklung und Immunglobulin-induzierter Aktivierung von B- Zellen (Wang et al., 2012). In CD-19-knockout-Mäusen ist eine herabgesetzte Bildung von sekundären Follikeln, Keimzentren und eine reduzierte Effektivität der humoralen Immunität nachgewiesen (Wang et al., 2012). Daher kann CD-19 als spezifischer Biomarker stellvertretend für die Detektion von vitalen B-Zellen eingesetzt werden (Tab. 1).
Tab.1 : Verwendete Antikörper
Marker Wirt Spezifität Literatur
VEGF-C ms Lymphgefäß – und
Blutgefäßmarker
(Baluk and McDonald, 2008; Karkkainen et al., 2001; Lohela et al., 2009) LYVE-1 rb Lymphspezifischer Hyaluron
Rezeptor
(Alitalo et al., 2005; Baluk and McDonald, 2008; Banerji et al., 1999)
Claudin- 5 rb Tight Junctions Marker von Endothelzellen
(Baluk et al., 2007; Coyne et al., 2003;
Moll et al., 2009)
VWF rb Blutendothelmarker (Michaux et al., 2006; Ruggeri, 1997) Ki-67 rb Wachstumsfraktion einer
Zellpolulation
(Scholzen and Gerdes, 2000; Yoon et al., 2003)
CD 3 ms Marker für T–Zellen (Gil et al., 2011; Lam et al., 2014)
CD 19 rb Marker für B-Zellen (Wang et al., 2012)
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Literaturübersicht 2.8 Ziel der Studie
Die konservative, symptomatische Therapie des sekundären Lymphödems mittels komplexer Entstauungstherapie (KPE) liefert derzeit keine klinisch zufriedenstellenden Ergebnisse im Sinne der Regeneration des Lymphdefekts (Zheng et al., 2014). Die chirurgische Therapie wie etwa die Rekonstruktion bzw. Transplantation von Lymphgefäßen und Lymphknoten stellt eine vielversprechende Methode zur Behandlung des sekundären Lymphödems mit gutem Langzeiterfolg dar (Baumeister et al., 2015). Unklar ist jedoch, welche Technik der Lymphrekonstruktion bzw. -transplantation die beste funktionale Wiederherstellung erbringt.
Diese Arbeit vergleicht die morphologische und funktionelle Regeneration des Lymphsystems nach verschiedenen mikrochirurgischen Lymphabflussrekonstruktionstechniken. Eine Auswertung der Funktionalität der Rekonstruktion wird über Gadolinium - MRT im Heilungsverlauf vorgenommen, wodurch in vivo Rückschlüsse auf den Lymphabfluss in einem bestimmten Gebiet gezogen bzw. ein möglicher Lymphstau ermittelt werden kann. Die verschiedenen Auswertungsverfahren zusammen sollen ein klares Bild über die beste Technik der chirurgischen Wiederherstellung des Lymphabflusses liefern und so die Grundlagen schaffen, chirurgische Rekonstruktion flächendeckender einzusetzen und so die Regeneration des Lymphdefektes bei sekundärem Lymphödem zu verbessern. Zusätzlich lässt sich durch die Funktionalitätsdarstellung mit dem Gadolinium-MRT der Erfolg einer mikrochirurgischen Rekonstruktion objektiv darstellen und der Heilungsverlauf besser beurteilen.
2.8.1 Hypothesen der Studie:
1.) Die untersuchten chirurgischen Lymphrekonstruktionstechniken unterscheiden sich hinsichtlich der funktionellen Wiederherstellung des Lymphabflusses.
2.) Die histomorphologische Regeneration nach Lymphrekonstruktion unterscheidet sich in den unterschiedlichen Gruppen und zu den unterschiedlichen Endzeitpunkten.
3.) Die Funktionalitätsdarstellung des Lymphsystems mittels nicht-invasivem Gadolinium–
MRT ist der invasiven Darstellung mit Patentblau gleichwertig.
2.8.2 Messmethoden
1. Vergleich der OP Zeiten der unterschiedlichen Rekonstruktionstechniken 2. Funktionelle Überprüfung des Lymphsystems mittels Gadolinium-MRT in vivo
3. Überprüfung der Durchgängigkeit des Lymphgefäßes mit Patentblau bei Versuchsende 4. Bewertung der histomorphologischen Regeneration des Lymphsystems mit HE-Färbung 5. Auswertung molekularbiologischer Parameter mittels Immunfluoreszenz & Western-Blot 6. Auswertung der morphologischen Regeneration mittels Rasterelektronenmikroskopie
