Beurteilung von Immunglobulin A und Tau-Protein
im kaninen Liquor cerebrospinalis als diagnostische Hilfsmittel in der klinischen Neurologie
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Andrea Rörig Remscheid
Hannover 2012
Wissenschaftliche Betreuung:
1. PD Dr. med. vet. Veronika Stein, PhD, Klinik für Kleintiere 2. Univ.-Prof. Dr. med. vet. Andrea Tipold, Klinik für Kleintiere
1. Gutachter: PD Dr. med. vet. Veronika Stein, PhD
2. Gutachter: Prof. Dr. med. vet. Marion Hewicker-Trautwein
Tag der mündlichen Prüfung: 5. November 2012
Meinen Eltern
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Meinen Eltern
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Teile der vorliegenden Dissertation wurden bereits auf folgenden Tagungen vorgestellt:
Rörig, A., Maiolini, A., Carlson, R., Tipold, A.:
Evaluierung eines „microsphere-based immunfluorescence assay“ zur Bestimmung von IgA im Liquor cerebrospinalis und Serum des Hundes
20. Jahrestagung der Fachgruppe „Innere Medizin und Klinische Laboratoriumsdiagnostik“, Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft, e.V.
(DVG), Gießen, 03.02.-04.02.2012
Rörig, A., Carlson, R., Tipold, A., Stein, V.M.:
Cerebrospinal fluid tau protein as a prognostic biomarker for recovery in canine intervertebral disk disease
25th Annual Symposium of the European Society (ESVN) and European College (ECVN) of Veterinary Neurology, “Epilepsy”
Ghent, Belgien, 14.09.-15.09.2012
Rörig, A., Carlson, R., Tipold, A.:
Evaluation of a microsphere-based immunofluorescence assay for the determination of immunoglobulin A concentrations in cerebrospinal fluid of dogs
2. MATERIAL UND METHODEN... 15
2.1. IgA – Microsphere-based immunofluorescence assay ... 15
2.1.1. Patientenmaterial ... 15
2.1.2. Material ... 17
2.1.3. Methode ... 21
2.1.4. Statistische Auswertung - Methodenvergleich... 28
2.2. Messung von Tau-Protein im Liquor cerebrospinalis ... 30
2.2.1. Patientenmaterial und Datenerhebung... 30
2.2.2. Liquorentnahme ... 33
2.2.3. Material ... 34
2.2.4. Messung des Tau-Proteins ... 36
2.2.5. Statistische Auswertung ... 40
3. ERGEBNISSE... 41
3.1. Measurement of IgA in canine CSF using MIA ... 41
3.2. CSF Tau in dogs with IVDH... 43
4. ÜBERGREIFENDE DISKUSSION ... 67
5. ZUSAMMENFASSUNG ... 78
6. SUMMARY... 81
7. ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ... 83
8. ABBILDUNGS- UND TABELLENVERZEICHNIS ... 85
9. LITERATURVERZEICHNIS ... 86
1. Einleitung und Literaturübersicht
Der Liquor cerebrospinalis (CSF) ist eine klare, farblose, zellarme Flüssigkeit, die das zentrale Nervensystem (ZNS) umgibt, es schützt und versorgt. Des Weiteren dient der Liquor dem Transport von neuroendokrinen Substanzen und Neurotransmittern sowie der Aufrechthaltung eines gleichmäßigen intrakraniellen Drucks. Auch eine exkretorische Funktion wird der Gehirnrückenmarksflüssigkeit zugesprochen (TIPOLD 2003; DE LAHUNTA 2009). Der Großteil des Liquors wird von den Plexus chorioidei in den Ventrikeln als Ultrafiltrat aus dem Blut gebildet. Die Produktionsrate variiert je nach Spezies und wird für den Hund mit 0,047 ml/min angegeben (DE LAHUNTA 2009).
Die Rückresorption des CSF in die Blutbahn erfolgt teils über arachnoidale Zotten, teils über leptomeningeale Gefäße, aber hauptsächlich aus dem Subarachnoidal- raum. Das gesamte Volumen des Liquor cerebrospinalis wird innerhalb eines Tages 3-5 mal produziert und resorbiert (JAGGY 2005; DE LAHUNTA 2009).
Die Liquorentnahme erfolgt unter Allgemeinanästhesie in der Regel subokzipital und seltener lumbal, da hier die Gefahr einer iatrogenen Blutkontamination höher ist (BAILEY u. HIGGINS 1985). Allerdings weisen lumbal gewonnene Proben bei der Diagnose von kaudal der zerebellomedullären Zisterne gelegenen Läsionen eine höhere Aussagekraft auf (THOMSON et al. 1989, 1990).
Pathologische Veränderungen im ZNS können die Zusammensetzung des Liquor cerebrospinalis beeinflussen, so dass die Liquoranalyse ein wichtiger Bestandteil der neurologischen Diagnostik ist. In der routinemäßigen Untersuchung wird neben Aussehen (Farbe, Durchsichtigkeit oder Trübung), Protein-, Glukose- und Zellgehalt auch das Differentialzellbild beurteilt. Die Liquoruntersuchung besitzt eine hohe Sensitivität aber niedrige Spezifität für die Diagnose einer Erkrankung. Nicht jede neurologische Erkrankung geht mit Veränderungen im Liquor einher (DI TERLIZZI u.
PLATT 2006). Trotzdem ist diese spezielle Untersuchung hilfreich, denn zusammen mit Signalement, Anamnese, Blutuntersuchung und Klinik kann sie die Diagnostik neurologischer Erkrankungen beim Hund effektiv unterstützen (TIPOLD et al. 1995;
ABATE et al. 1998).
In den letzten Jahrzehnten wurde das Spektrum der Liquoranalyse deutlich erweitert.
Mittels verschiedener Methoden können unter anderem Antikörper, Krankheits- erreger, Proteine, Enzyme und Neurotransmitter im Liquor bestimmt und für die Abklärung von Differentialdiagnosen interpretiert werden (TIPOLD et al. 1994;
OLBY et al. 1999; SCHATZBERG et al. 2003; LEVINE et al. 2006; KWON et al.
2010; LEVINE et al. 2010). So ist zum Beispiel die Messung des so genannten IgG- Index hilfreich, denn dieser erlaubt die Unterscheidung einer entzündlichen oder infektiösen Erkrankung des ZNS von anderen zentralnervösen Krankheiten (TIBBLING et al. 1977).
Die parallele Messung von Immunglobulin A (IgA) in Serum und Liquor cerebrospinalis ist ein wichtiges Hilfsmittel bei der Diagnose der steril-eitrigen Meningitis-Arteriitis (SRMA) des Hundes (MAIOLINI et al. 2012). Diese entzündliche Erkrankung des ZNS ist weit verbreitet und wird besonders bei jungen Hunden diagnostiziert (TIPOLD 1995; CIZINAUSKAS et al. 2000). Eine exzessive systemische und intrathekale IgA-Synthese, die sich in der gemeinsamen Erhöhung von IgA in Serum und Liquor widerspiegelt, ist neben den typischen klinischen Symptomen wie rezidivierendes Fieber, steife Kopf-Hals-Haltung und Schmerzhaftig- keit in der Halswirbelsäule, charakteristisch (TIPOLD u. JAGGY 1994;
CIZINAUSKAS et al. 2000).
Immunglobulin A ist das wichtigste Immunglobulin der epithelialen Immunabwehr und ist deshalb vor allem im Speichel, in der Tränenflüssigkeit sowie in den Sekreten des Gastrointestinal-, des Respirations- und des Urogenitaltraktes vorzufinden (TIPOLD et al. 1994; TIZARD 2009). Das kanine Immunglobulin A kann eine monomere oder dimere Form annehmen (DAY u. PENHALE 1988; TIZARD 2009). Der normale systemische IgA-Gehalt ist altersabhängig, wobei junge Hunde im Allgemeinen niedrigere Serumwerte besitzen (GLICKMAN et al. 1988; SCHREIBER et al. 1992;
GINEL et al. 1993). Die in der veterinärmedizinischen Literatur angegebenen Referenzwerte für den IgA-Gehalt im kaninen Serum sind uneinheitlich und schwanken zwischen 10,9 µg/ml und 1790 µg/ml (REYNOLDS u. JOHNSON 1970;
Physiologischerweise wird im ZNS die humorale Immunantwort durch Immunglobulin G dominiert (FELGENHAUER u. SCHÄDLICH 1987). Bei verschiedenen neurologischen Erkrankungen, vor allem bei Entzündungen und Tumoren, konnte jedoch eine zusätzliche starke Beteiligung von IgA nachgewiesen werden (BUDKA et al. 1985; FELGENHAUER u. SCHÄDLICH 1987; TIPOLD et al. 1994). Die genaue Funktion von IgA im ZNS ist bisher nicht bekannt (BUDKA et al. 1985; TIPOLD et al. 1994). WOO et al. (1993) vermuten, dass intrathekales IgA zum Schutz des ZNS Antigene neutralisiert und somit dem Erhalt der wichtigen neuronalen Funktionen dient. Da aber unterschiedliche Erkrankungen des Nervensystems mit einer Erhöhung der IgA-Konzentration einhergehen, ist zu vermuten, dass die IgA-Synthese nicht antigenspezifisch erfolgt (BUDKA et al. 1985).
Der erhöhte IgA-Gehalt im ZNS ist auf eine intrathekale IgA-Synthese zurückzuführen, denn aufgrund der dimeren Form erscheint das Passieren der Blut- Hirnschranke unwahrscheinlich (WOO et al. 1993; TIPOLD et al. 1994;
TIZARD 2009). Die Messung von IgA im Liquor kann daher auch einen Hinweis auf einen intrathekalen, primären oder sekundären Entzündungsprozess geben.
Zum Nachweis von Immunglobulin A wurde früher ein radial immunodiffusion assay (RID) angewendet, welcher auch als Basis für den heute üblichen Enzyme-linked- immunosorbent-assay (ELISA) diente (HEDDLE u. ROWLEY 1975; TIPOLD et al. 1994). Da der ELISA einige Nachteile mit sich bringt - so können zum Beispiel Einzelproben nur mit hohem zeitlichen Aufwand und Materialverbrauch analysiert werden - bedarf es einer alternativen Messmethode.
Die Durchflusszytometrie ist ein seit langem etabliertes labordiagnostisches Verfahren, mit dessen Hilfe verschiedene Eigenschaften von Zellen, wie Größe oder Komplexität, gemessen werden kann. Das Prinzip der Durchflusszytometrie besteht darin, dass die zu messenden Partikel in einem Flüssigkeitsstrom einzeln einen Laserstrahl passieren. Die durch diese Teilchen verursachte Lichtstreuung wird registriert. Zusätzlich können die Zellen mit Fluorochrom-konjugierten Antikörpern markiert werden; dies ermöglicht eine weitere Sortierung der Partikel. Die an den Detektoren gesammelten Signale werden in elektrische Signale umgewandelt,
digitalisiert und mittels geeigneter Softwareprogramme ausgewertet (JAROSZESKI u. RADCLIFF 1999).
Schon seit längerer Zeit ist diese Methode in ihrer Anwendung jedoch nicht mehr ausschließlich auf Zellen begrenzt, sondern kann für die Detektion jeglicher Art von Partikeln, einschließlich Mikrosphären, genutzt werden (JAROSZESKI u.
RADCLIFF 1999). Mikrosphären, auch „Beads“ genannt, sind im Durchmesser 5-20 µm kleine sphärische Gebilde, welche analog zum ELISA als Festphase für biochemische Nachweisreaktionen dienen können. Da die Stärke der Fluoreszenzintensität proportional zur Menge des zu messenden Analyten ist, können die Konzentrationen mittels mitgeführter Standardproben berechnet werden (WILSON u. WOTHERSPOON 1988).
Verschiedene Autoren konnten eine gute Übereinstimmung zwischen den Messergebnissen eines ELISA und eines “microsphere-based immunofluorescence assay“ (MIA) feststellen, insbesondere ein niedriger Intraassay-Variationskoeffizient und eine gute Linearität wurden beschrieben (MCHUGH et al. 1989; SYRJALA et al.
1991; KWITTKEN et al. 1994).
Humanes Immunglobulin G und E konnte mit Hilfe von Mikrosphären quantitativ bestimmt werden (LISI et al. 1982; KWITTKEN et al. 1994).
In der Veterinärmedizin hat sich dieses moderne Messverfahren bisher wenig etabliert. PAUL et al. (2005) nutzten die Technik zur Messung von Anti-Histon- Antikörpern im Serum von Hunden mit Verdacht auf Systemischen Lupus erythematodes, während BRESHEARS et al. (2010) die Detektion von Matrixmetalloproteinasen in kaninen Kreuzband-Zellkulturen mittels multiplexer Bead-Technologie beschreiben.
Die vorliegende Arbeit schildert die Entwicklung und Evaluierung eines „microsphere- based immunofluorescence assay“ zur Bestimmung von Immunglobulin A in Serum und Liquor cerebrospinalis des Hundes. Die beschriebene Entwicklungsarbeit soll die Grundlage bilden, dieses neue Messverfahren zur Bestimmung verschiedener Analyten im CSF einzusetzen.
In einer zweiten Studie wurde die Liquoranalyse eingesetzt, um die Prognosestellung bei Hunden mit Bandscheibenvorfällen zu ergänzen: in Zusammenhang mit einem Bandscheibenvorfall wird der Liquor cerebrospinalis zur Abklärung von Differential- diagnosen untersucht. Verschiedene Studien haben sich in den letzten Jahren auch mit einem möglichen prognostischen Wert der Liquoruntersuchung bei Bandscheibenvorfällen beschäftigt (THOMSON et al. 1989, 1990; OLBY et al. 1999;
WITSBERGER et al. 2009; SRUGO et al. 2011).
Bandscheibenvorfälle beim Hund sind eine häufig diagnostizierte neurologische Erkrankung in der Tiermedizin (FLUEHMANN et al. 2006). Die klinischen Erscheinungsformen sind vielfältig und reichen von Hyperästhesien bis hin zu Lähmungen der Gliedmaßen (JAGGY 2005). Eine chirurgische Therapie bewirkt in der Regel eine schnelle Behebung der schmerzhaften Zustände und gibt dem dekomprimierten Rückenmark die Möglichkeit zur Regeneration (COATES 2000;
DEWEY 2008).
Die Auswirkung eines Bandscheibenvorfalls auf das Rückenmark wird von mehreren Faktoren beeinflusst. Neben der Menge des vorgefallenen Materials spielen die Geschwindigkeit des Vorfalls und die Dauer der Kompression eine wichtige Rolle (KEARNEY et al. 1988; CARLSON et al. 2003).
Die Verletzung des Rückenmarks ist auf primäre und sekundäre Pathomechanismen zurückzuführen. Die primären Schäden sind Folge der direkten mechanischen Einwirkung auf das Nervengewebe, die sekundären Schäden entstehen aufgrund verschiedener pathophysiologischer Reaktionen (ANDERSON u. HALL 1993;
DUMONT et al. 2001). Letztgenannte beinhalten unter anderem Ischämie, Hypoxie, Elektrolytverschiebungen, das Auftreten freier Radikale, eine übermäßige Freisetzung des exzitatorischen Neurotransmitters Glutamat und einen anaeroben Stoffwechsel (ANDERSON u. HALL 1993; OLBY 1999; OLBY et al. 1999; DUMONT et al. 2001; HAUSMANN 2003).
Das Nervengewebe ist demnach einer Vielzahl schädigender Einflüsse ausgesetzt, welche schlussendlich zum Zelltod der Neuronen durch Nekrose oder Apoptose führen (ANDERSON u. HALL 1993; CROWE et al. 1997; LIU et al. 1997; DUMONT et al. 2001).
Die Schwere der Läsionen im Myelon wird mit Hilfe der Befunde der neurologischen Untersuchung und der bildgebenden Diagnostik wie der Magnetresonanz- tomographie (MRT) eingeschätzt. Bei plegischen Tieren ist die Frage nach der Prognose jedoch nicht immer ausreichend zu beantworten. Bei Tieren, die keinen Tiefenschmerz mehr aufweisen, besteht trotz der schwerwiegenden Schädigung eine Erholungschance von 43 bis 75% (YOVICH et al. 1994; DUVAL et al. 1996; OLBY et al. 2003; ITO et al. 2005; RUDDLE et al. 2006). Ein einfach zu bestimmender, verlässlicher prognostischer Faktor wäre eine große Hilfe für die Bewertung der Heilungschancen bei Hunden mit Bandscheibenvorfällen.
In der Humanmedizin sind in den letzten Jahren verschiedene Biomarker zur Beurteilung der Schwere von Rückenmarksschäden untersucht worden (BRISBY et al. 1999; GUÉZ et al. 2003; KWON et al. 2010). Als weiterer potentieller diagnostischer Marker könnte Tau-Protein dienen. Dieses Phosphoprotein ist hauptsächlich in Nervenzellen und dort vor allem in den Axonen zu finden (BINDER et al. 1985). Es unterstützt die Polymerisation von einzelnen Tubuli-Monomeren zu Mikrotubuli, weshalb es in die Gruppe der „microtubule-associated proteins (MAP)“
eingeordnet wurde (WEINGARTEN et al. 1975; BINDER et al. 1985). Mikrotubuli spielen eine wichtige Rolle in der Stabilisation der Zellform und in axonalen Transportvorgängen (DRUBIN 1986; BUEE et al. 2000).
Die Kompression und Traumatisierung des Myelon bei Bandscheibenvorfällen resultiert in Verlust von Neuronen und damit auch in der Freisetzung von intrazellulären Proteinen in den das Rückenmark umgebenden Liquor cerebrospinalis. Da Tau kein sekretorisches Protein ist, sind bei gesunden Menschen und Tieren nur niedrige Tau-Konzentrationen im Liquor cerebrospinalis zu erwarten, während erhöhte Werte auf eine Schädigung von neuronalem Gewebe hinweisen (MORI et al. 1995).
Humanes Tau-Protein besteht aus 352 bis 441 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 45 bis 65 kDa. Diese Spannweiten in Größe und Gewicht sind in den sechs verschiedenen Isoformen begründet. Diese Isoformen unterscheiden
Proteins (drei oder vier) sowie in dem Vorhandsein von Inserts (kein Insert, ein Insert, mehrere Inserts) am aminoterminalen Ende (GOEDERT et al. 1989a; GOEDERT et al. 1989b).
Erhöhte Tau-Protein-Konzentrationen im CSF sind beim Menschen zuerst im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen, wie der weithin bekannten Alzheimer Erkrankung beschrieben worden (BLENNOW et al. 1995; ANDREASEN et al. 1998). Bei dieser sogenannten Tauopathie steht besonders das abnormal hyperphosphorylierte Tau-Protein im Interesse der Forschung (GRUNDKE-IQBAL et al. 1986; BUEE et al. 2000).
Auch bei Patienten mit Multipler Sklerose, einer Erkrankung, die mit einer Demyelinisierung einhergeht, sind hohe Tau-Protein-Werte im CSF zu finden und diese stehen im Zusammenhang mit der Erkrankungsdauer (TERZI et al. 2007). Es konnte gezeigt werden, dass auch hier abnormal phosphoryliertes Tau an der Pathogenese beteiligt sein kann (ANDERSON et al. 2008).
In der tiermedizinischen Literatur ist bisher nur wenig über Tau-Protein berichtet worden. Lediglich die Expression von Tau-Protein im Gehirn alter Hunde und Katzen, sowie die Konzentration von Tau-Protein im Liquor cerebrospinalis bei Hunden mit Enzephalitis wurden untersucht (HEAD et al. 2005; PUGLIESE et al. 2006; TANAKA et al. 2011).
ZEMLAN et al. (1999) zeigten, dass erhöhte Tau-Protein-Werte im CSF von Menschen mit Schädelhirntrauma vorkommen. Des Weiteren konnten KWON et al. (2010) erhöhte Tau-Protein-Konzentrationen im Liquor cerebrospinalis von Menschen mit traumatisch bedingten Rückenmarksschäden nachweisen. In dieser Studie wurde ebenso wie in der Studie von TANAKA et al. (2011) ein ELISA genutzt, der das sogenannte „Total Tau“ also normales und phosphoryliertes Tau detektiert.
Aufgrund der oben genannten Informationen wurde die Hypothese aufgestellt, dass die Tau-Protein-Konzentration im CSF mit der Schwere der Schädigung des Rückenmarks bei Hunden mit Bandscheibenvorfall korreliert und somit eine Aussage über die Schwere der Läsion sowie über die Prognose des einzelnen Patienten erlaubt. Da bisher nicht bekannt ist, welche Form des Tau-Proteins bei Hunden mit
Bandscheibenvorfällen im CSF vorhanden sein könnte, wurde für die hier angeführte Studie ebenfalls ein ELISA zur Messung von „Total Tau“ verwendet.
Die vorliegende Arbeit ist in zwei Abschnitte gegliedert: Das Ziel der ersten Studie (Evaluation of a microsphere-based immunofluorescence assay for the determination of immunoglobulin A concentrations in cerebrospinal fluid of dogs) war, einen
„microsphere-based immunofluorescence assay“ zu entwickeln, um ein geeignetes Verfahren für die Untersuchung von CSF-Einzelproben zu erhalten, bei dem nur geringe Mengen an Probenmaterial benötigt werden. Der entwickelte MIA sollte mit einem etablierten ELISA verglichen werden.
In der zweiten Studie (Cerebrospinal fluid tau protein as a biomarker for severity of spinal cord injury in canine intervertebral disk herniation) wurde der Schweregrad der Schädigungen des Rückenmarks und der mögliche prognostische Wert der Konzentrationen von Tau-Protein im Liquor cerebrospinalis bei Hunden mit Bandscheibenvorfällen untersucht.
2. Material und Methoden
2.1. IgA – Microsphere-based immunofluorescence assay
In der vorliegenden Arbeit wurde in gepaarten Serum- und Liquorproben von Hunden die IgA-Konzentration mit der im Folgenden beschriebenen Methode („microsphere- based immunofluorescence assay“) bestimmt. Zusätzlich wurde der intrathekale und systemische IgA-Gehalt dieser Hunde mit Hilfe eines ELISA nach TIPOLD et al.
(1994) für Serum und Liquor cerebrospinalis sowie mit einem kommerziell erhältlichem ELISA (Immunology Consultants Laboratory, Inc., Portland, OR, USA) gemessen und mit den Ergebnissen des MIA verglichen.
2.1.1. Patientenmaterial
Von 44 Hunden, die in der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule in Hannover vorstellig waren, wurden gepaarte Serum- und Liquorproben in Allgemeinanästhesie entnommen und bis zur Messung bei -20°C aufbewahrt.
Die Patienten wurden entsprechend der im ELISA nach TIPOLD et al. (1994) gemessenen IgA-Konzentrationen in drei Gruppen eingeteilt:
- Gruppe 1: 17 Hunde mit normalen IgA-Konzentrationen
- Gruppe 2: 14 Hunde mit mittelgradig erhöhten IgA-Konzentrationen - Gruppe 3: 13 Hunde mit hochgradig erhöhten IgA-Konzentrationen
Eine Übersicht über Signalement und Erkrankungen der Hunde gibt Tabelle 1.
Die genauen klinischen Daten und Messwerte sind im Anhang tabellarisch dargestellt.
Rasse
(Anzahl der Hunde)
Mischling (8) Boxer (6)
Berner Sennenhund (4) Jack Russell Terrier (3) Weimaraner (2)
Deutscher Schäferhund (2) Golden Retriever (2)
Novia Scotia Duck Tolling Retriever Französischer Bullterrier
Zwergpinscher Cocker Spaniel Französischer Griffon Portugiesischer Hirtenhund Rhodesian Ridgeback Labrador Retriever Mops
Irish Setter Eurasier
Kleiner Münsterländer Border Collie
Katalanischer Hirtenhund Alter
Mittelwert Intervall
3,3
0,58 - 12,75 Geschlecht
(Anzahl der Hunde) Weiblich
Weiblich kastriert Männlich
Männlich kastriert
18 4 20 2 Diagnose
SRMA
Anfallsgeschehen Neoplasie
Meningoenzephalitis Diskopathie
sonstige
30 3 3 1 1 6
Tabelle 1: Signalement und Diagnose der Patienten im Überblick
2.1.2. Material
Geräte
- Reinstwasser-Aufbereitungssystem GenPure, Fa. TKA Thermo Fisher Scientific, Niederelbert
- Durchflusszytometer FACSCalibur™ mit Apple & Macintosh™ -Computer, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
- Mikrobiologische Sicherheitswerkbank HERAsafeKS, Fa. Thermo Fisher Scientific, Niederelbert
- Gefrierschrank Premium NoFrost, Fa. Liebherr, Ochsenhausen - Kühlschrank Comfort, Fa. Liebherr, Ochsenhausen
- Laborwaage LabStyle204, Fa. Mettler Toledo, Giessen - Magnetrührer mit Heizplatte, Typ MR 3001,
Fa. Heidolph, Schwabach
- Plattenrüttler Promax 1020, Fa. Heidolph, Schwabach
- Reagenzglasschüttler Reax control, Fa. Heidolph, Schwabach - Tischzentrifuge Rotina 35R, Fa. Hettich, Tuttlingen
- Wasserbad mit Einhängethermostat, Fa. Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach
- Plattformschüttler Polymax, 1040 Fa. Heidolph, Schwabach - Ultraschallbad Ultrasound-7-neutral (Art. 5356),
Fa. Roth, Karlsruhe
- Synergy 2 Multi-Detektions-Reader für Mikroplatten, Fa. BioTek Instruments, Bad Friedrichshall
Laborbedarf
- Polystyrolröhrchen 3,5 ml und 5 ml (Art.-Nr. 55.1579 bzw. 55.484.001), Fa. Sarstedt, Nümbrecht
- Immuno Platte Maxisorp F96-well (Best.-Nr. 75-0083), Fa. VWR, Darmstadt
- Einmalhandschuhe Novaglove® -Latex (Best.-Nr. 905451), Fa. NOBA Verbandsmittel, Wetter
- Glas-Pasteurpipetten, 150 ml (Best.-Nr. 612-1798), Fa. VWR, Darmstadt - Pipettenspitzen: 10 µl (kristall), (Best.-Nr. 702504), Fa. Brand, Wertheim
200 µl (gelb), (Best.-Nr. 613-0240), Fa. VWR, Darmstadt 1000 µl (blau), (Best.-Nr. 2100610), Fa. Ratiolab, Dreieich - Pipetten Transferpette® einstellbar (0,1-1000 µl), Fa. Brand, Wertheim - Pipettierhelfer accu-jet® pro, Fa. Brand, Wertheim
- Mehrfachdispenser Handy-step® (Best.-Nr. 705100), Fa. Brand, Wertheim - Präzisionsdispenserspitzen 5 ml, 25 ml (Best.-Nr. 702376, 702380),
Fa. Brand, Wertheim
- Eppendorf Safelock-Tubes, 1,5 ml (Best.-Nr. 0030121694), Fa. Eppendorf, Hamburg
- Bio-Spin Tris Columns (Best.-Nr.732-6231), Fa. Bio-Rad Laboratories, USA - Bechergläser, Fa. VWR, Darmstadt
- Polypropylenröhrchen mit Deckel, 2 ml (Art.-Nr. 72.694), Fa. Sarstedt, Nümbrecht - Reagenzröhrchen mit Verschluss, Polypropylen 15 ml (Best.-Nr. 62.554.001),
Fa. Sarstedt, Nümbrecht
Reagenzien, Chemikalien
- BSA, bovines Serumalbumin (Best.-Nr. A4503-50G), Fa. Sigma-Aldrich-Chemie, Steinheim
- Dimethylsulfoxid (DMSO) (Best.-Nr. D-5879), Fa. Sigma-Aldrich-Chemie, Steinheim
- Dithiothreitol (DTT) (Best.-Nr. 43815), Fa. Sigma-Aldrich-Chemie, Steinheim - Sulfosuccinimidyl 4-N-maleimidomethyl cyclohexane 1-carboxylate (Sulfo-SMCC)
(Best.-Nr. 22322), Fa. Pierce Thermo Fischer Scientific, Niederelbert - N-Ethylmaleinimid (NEM) (Best.-Nr. E1271),
Fa. Sigma-Aldrich-Chemie, Steinheim
- Tween 20 (Art.-Nr. 8.22184.0500), Fa. Merck, Darmstadt - o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid (OPD) (Best.-Nr. P8287),
Fa. Sigma-Aldrich-Chemie, Steinheim
- Perborat-Kapsel (Best.-Nr. P4922), Fa. Sigma- Aldrich-Chemie, Steinheim - FACSClean (Best.-Nr. 340345), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
- FACSRinse (Best.-Nr. 340346), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg - FACSFlow (Best.-Nr. 342003), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
- Functional Bead Conjugation Buffer Set, BD™ Cytometric Bead Array (CBA) (Best.-Nr. 558556), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
- Functional Beads A5 (Best.-Nr. 560031), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg - Coupling Buffer (Best.-Nr. 51-9004756), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg - Functional Bead Storage Buffer (Best.-Nr. 51-9004758),
Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
- Wash Buffer CBA (Best.-Nr. 51-9003797), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg - Canine IgA ELISA Kit (Best.-Nr. E-40),
Fa. ICL Laboratories Inc., Portland, OR, USA
Antikörper
- Ziege-gegen-kanines-IgA (Best.-Nr. A40-104A), Fa. Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX, USA
- F(ab´)2-Fragment-spezifisches R-Phycoerythrin (RPE)-konjugiertes F(ab´)2- Fragment Ziege-gegen-murines-IgG (Art.-Nr.115-116-072),
Fa. Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Suffolk, UK
- Esel-gegen-caprines-IgG, R-Phycoerythrin konjugiert (Art.-Nr. 705-116-147), Fa. Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Suffolk, UK
- Maus-gegen-kanines-IgA (Best.-Nr. MCA631), Fa. AbD Serotec, Oxford, UK
- Esel-gegen-murines-IgG, Peroxidase konjugiert (Art.-Nr. 715-035-151), Fa. Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Suffolk, UK
Puffer, Lösungen und Suspensionen
- Waschpuffer Beads: PBS (steril) 250ml
bovines Serumalbumin (BSA) 2,5 g Na-Acid (10%ig) 250 µl
- PBS, Phosphatgepufferte Salzlösung (pH 7,4): NaCl 137,0 mM KCl 2,7 mM Na2HPO4 8,1 mM KH2PO4 1,5 mM
Computer-Software
- Cell-Quest™-Software (für Apple & Macintosh™-Computer), Fa. Becton Dickinson, Heidelberg
- Flow Jo Version 7.6, ©Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA - Gen5™ Reader Control and Data Analysis Software,
Fa. BioTek Instruments, Bad Friedrichshall
- GraphPad Prism® Version 5.0, Fa. GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA)
2.1.3. Methode
Testprinzip des „Microsphere-based immunofluorescence assays“
Bei dem „Microsphere-based immunofluorescence assay“ (MIA) dienen mikroskopisch kleine Kügelchen (im Folgenden als Mikrosphären oder Beads bezeichnet) als Festphase für biochemische Nachweisreaktionen.
In dieser Studie wurden 7,5 µm große Mikrosphären aus Polystyrol der Firma Becton Dickinson genutzt.
Verschiedene Proteine wie zum Beispiel Antikörper können an die Oberfläche der Mikrosphären gekoppelt werden. Das Funktionsprinzip entspricht dem eines SANDWICH-ELISA (siehe Abb.1.).
Die mit dem primären Antikörper beschichteten Mikrosphären binden nach Zugabe des Patientenserums oder -liquors den darin enthaltenen Analyten (IgA). Es folgt die Bindung eines zweiten Antikörpers. Dieser kann entweder selbst fluoreszieren oder er wird mit einem dritten fluoreszierenden Antikörper markiert. Zwischen den einzelnen Schritten werden überschüssige Antikörper durch Waschvorgänge entfernt.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Funktionsprinzips eines MIA
Die Fluoreszenzintensität verhält sich proportional zur Konzentration des Analyten (IgA) in der Probe. Mit Hilfe einer Standardkurve können die IgA-Konzentrationen in den Patientenproben berechnet werden. Somit erlaubt der MIA eine quantitative Bestimmung von IgA.
Kopplung des Antikörpers an die Mikrosphären und Bestätigung der Konjugation Die Kopplung eines Ziege-gegen-kanines-IgA-Antikörpers mittels kovalenter Sulfo- SMCC-Bindung an die Oberfläche der Mikrosphären wurde nach Angaben des Herstellerprotokolls durchgeführt. Der genaue Ablauf ist im Anhang beschrieben.
Die Konjugation wurde als erfolgreich abgeschlossen angesehen, wenn die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der Probe mit dem Detektionsantikörper um mindestens 500 größer war als die MFI der Negativkontrolle.
Entwicklung einer Standardkurve
Um aus den gemessenen Fluoreszenzintensitäten die IgA-Konzentration berechnen zu können, wird eine Standardkurve benötigt. Diese sollte durch die Austestung verschiedener Verdünnungen des Detektionsantikörpers ermittelt werden. Es wurden die folgenden sechs Verdünnungsstufen eingesetzt:
• 1:200
• 1:100
• 1: 50
• 1: 10
• 1: 5
• 1: 2,5
Eine IgA-Serumpool-Probe mit einer Konzentration von 162 µg/ml diente der Erstellung einer Standardreihe mit den folgenden Konzentrationen:
• 162 ng/ml
• 20,25 ng/ml
• 10,13 ng/ml
• 5,07 ng/ml
• 2,54 ng/ml
• 1,27 ng/ml
• 0,64 ng/ml
• 0,32 ng/ml
• 0 ng/ml
Die Auswertung der im Durchflusszytometer gemessenen Fluoreszenzintensitäten erfolgte mit dem Analyseprogramm Flow Jo (Version 7.6, ©Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA). Die Erstellung einer mathematischen Funktion zur Beschreibung des Kurvenverlaufs erfolgte mit dem Programm GraphPad Prism® (Version 5.0, GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) mit der Vorgabe einer Kalibrierungskurve mit sigmoidalem Verlauf und vier Parametern. Die Bestimmung der idealen Standardkurve erfolgte zum einen durch die graphische Darstellung und Beurteilung der Fluoreszenzen bei den verschiedenen Verdünnungsstufen und zum anderen anhand der berechneten Kalibrierungskurven (vergleiche Abb. 2).
Der optimale Messbereich wurde als der Bereich der Kurve definiert, der den linearen Anstieg der Kurve umfasst. Nur dieser Bereich wurde später bei der Probenmessung zur Interpolation der Konzentrationen aus den Fluoreszenz- intensitäten genutzt.
0 1 2 0
500 1000 1500 2000
IgA (ng/ml)
fluorescence intensity
Abbildung 2: Standardkurve mit sigmoidalem Verlauf (IgA-Konzentrationen zwischen 0-162 ng/ml, Werte logarithmiert dargestellt)
Präzision und Reproduzierbarkeit der Methode
Für die Präzision einer Methode sind die Intraassay-Varianz und die Interassay- Varianz wichtige Kenngrößen, denn sie geben das Maß der analytischen Streuung wieder. Diese wird als Variationskoeffizient (CV%) angegeben. Die Intraassay- Varianz beschreibt dabei die Abweichungen innerhalb eines Messdurchlaufs, wohingegen die Interassay-Varianz die Messabweichung derselben Proben an mehreren aufeinanderfolgenden Tagen angibt.
Im Intraassay-Vergleich wurden die Variationskoeffizienten der Fluoreszenz- intensitäten (jede Probe wurde als Duplikat gemessen) der Proben an einem Tag berechnet und getrennt für Serum und Liquor cerebrospinalis als Median angegeben.
Für den Interassay-Vergleich wurden die IgA-Konzentrationen der gleichen Proben an sechs Tagen bestimmt und anschließend pro Serum- bzw. Liquorprobe der Variationskoeffizient errechnet.
Nach denselben Prinzipien erfolgten die Berechnungen für den ELISA nach TIPOLD et al. (1994). Anstelle der Fluoreszenzintensitäten wurden die Extinktionswerte
Messung der Proben
Für die Messung der Proben mittels des „microsphere-based immunofluorescence assay“ wurden die Liquorproben in der Verdünnung 1:20 bzw. 1:40 und die Serumproben in der Verdünnung 1:2000, 1:4000 oder 1:5000 eingesetzt. Zur Probenverdünnung wurde der Waschpuffer verwendet.
Das detaillierte Versuchsprotokoll ist im Folgenden beschrieben:
1. Erstellen der Standardreihe
Jede der oben genannten Standardkonzentrationen wurde als Triplikat angesetzt, so dass pro Reihe insgesamt 150 µl der jeweiligen Verdünnungsstufe benötigt wurden.
Zunächst wurde 1 µl der IgA-Serumpool-Probe mit 499 µl Waschpuffer verdünnt.
Davon wurden 200 µl in weiteren 200 µl Waschpuffer verdünnt und die Verdünnungsreihe entsprechend in 2er Schritten fortgeführt. Anschließend wurden jeweils 50 µl der Standard-Verdünnungen in 5-ml Röhrchen pipettiert. Zur Herstellung des Standards „0“ wurde ausschließlich Waschpuffer verwendet.
2. Herstellung der Kontrollprobe:
Das Kontrollserum hat eine IgA-Konzentration von 100 µg/ml. Es wurde in einer Konzentration von 100 ng/ml eingesetzt. Dazu wurde 1 µl Kontrollserum in 999 µl Waschpuffer verdünnt und im Folgenden jeweils 50 µl in die entsprechenden 5 ml-Röhrchen pipettiert.
3. Proben:
Die korrespondierenden Liquor- und Serumproben wurden bei Raumtemperatur aufgetaut und gemäß den oben genannten Verdünnungsstufen als Duplikate pipettiert.
4. Verdünnung der Beads:
Die präparierten Beads wurden 5 sek. mit Hilfe des Reagenzglasschüttlers gemischt und anschließend mit dem Wachpuffer 1:50 verdünnt.
5. In jedes Standard-, Kontroll- und Probenröhrchen wurden 50 µl der verdünnten Beads pipettiert. Damit die Beads in Suspension bleiben, wurden die Röhrchen dabei leicht geschwenkt. Es folgte eine Inkubationszeit von 30 min., wobei die Röhrchen lichtgeschützt bei Raumtemperatur auf dem Plattformschüttler (Stufe 3) aufbewahrt wurden.
6. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Beads gewaschen. Dazu wurde in jedes Röhrchen 1 ml Waschpuffer pipettiert, dieses 5 min. bei 1000 x g zentrifugiert und der Überstand vorsichtig mittels Pasteurpipette abgenommen.
7. In jedes Röhrchen wurden 50 µl des Detektions-Antikörpers (Maus-gegen- kanines-IgA; Verdünnung 1:2,5) hinzugefügt und mittels Reagenzglasschüttler gut vermischt.
8. 30 min. Inkubationszeit und anschließender Waschvorgang (siehe Punkt 5 und 6)
9. In jedes Röhrchen wurden 50 µl des RPE-konjugierten F(ab´)2-Fragments Ziege- gegen-murines-IgG (Verdünnung 1:100) hinzugefügt und mittels Reagenzglas- schüttler gut vermischt.
10. 30 min. Inkubationszeit und anschließender Waschvorgang (siehe Punkt 5 & 6)
11. Die Beads wurden in 100 µl Waschpuffer resuspendiert und dann der FACS- Messung unterzogen.
FACS-Analyse
Die Durchflusszytometrie im ursprünglichen Sinne dient der Sortierung von Zellen bzw. Partikeln anhand ihrer Größe und Beschaffenheit. Die sogenannte FACS- Analyse (Fluorescence activated cell sorting) ermöglicht die Sortierung von Partikeln anhand der Farbe und Intensität emittierter Fluoreszenzen (JAROSZESKI u.
RADCLIFF 1999).
Aufgrund des verwendeten Fluorochromfarbstoffes PhycoErythrin wurde die Fluoreszenzintensität im FL2-Kanal des Durchflusszytometers (FACSCalibur™) gemessen. Des Weiteren wurden das Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC) und das Seitwärtsstreulicht (Side Scatter, SSC) erfasst. Das Vorwärtsstreulicht erlaubt Rückschlüsse auf die Größe der Partikel, während das Seitwärtsstreulicht Informationen über die Komplexität der Teilchen liefert (JAROSZESKI u. RADCLIFF 1999). Eine Mindestanzahl von 1000 Ereignissen pro Probe wurde im Vorhinein festgelegt.
Die Auswertung der gemessenen Fluoreszenzintensitäten erfolgte mit dem Analyseprogramm Flow Jo (Version 7.6, ©Tree Star, Inc., Ashland, OR USA). Der geometrische Mittelwert der Fluoreszenzen wurde berechnet und anhand des mitgeführten Standards wurden die Konzentrationen der gemessenen Liquor- und Serumproben mit Hilfe des Programms GraphPad Prism® (Version 5.0, GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) ermittelt.
IgA-ELISA nach Tipold
Der ELISA wurde, wie im Anhang beschrieben, entsprechend dem Protokoll aus der Studie von TIPOLD et al. (1994), durchgeführt.
Kommerzieller IgA-ELISA
Der ELISA wurde entsprechend der Herstellerangaben durchgeführt. Ein detailliertes Protokoll ist im Anhang zu finden.
2.1.4. Statistische Auswertung - Methodenvergleich
Ziel der Studie war neben der Etablierung eines neuen Messverfahrens auch der Vergleich der neuen (MIA) mit der etablierten Methode (ELISA).
Die statistische Aussagekraft dieses Vergleichs ist unter anderem abhängig von der Anzahl der verwendeten Proben und dem von den Proben umfassten Analysebereich. Die vorliegende Studie beinhaltet die Messung von 44 korrespondieren Serum- und Liquorproben und folgt somit der Empfehlung verschiedener Autoren, eine Mindestanzahl von 40 Proben einzusetzen (LUMSDEN 2000; JENSEN u. KJELGAARD-HANSEN 2006). Die Auswahl und Einteilung der Proben in die drei oben aufgeführten Gruppen erfolgte in der genannten Art und Weise, um einerseits den klinisch bedeutsamen Referenzbereich abzudecken und andererseits, um neben der SRMA als wichtigste Erkrankung auch weitere neurologische Erkrankungen für die Methodenvalidierung mit einzubeziehen.
Dieser Vergleich der beiden Methoden zur Bestimmung der IgA-Konzentration wurde auf zwei unterschiedlichen Wegen durchgeführt. Zum einen erfolgte eine Beurteilung anhand des in der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover verwendeten klinischen Referenzbereiches. Diese Referenzwerte entstammen einer vorhergehenden Studie, bei der IgA bei gesunden Beageln gemessen wurde (TIPOLD et al. 1994) (siehe Tabelle 2).
IgA-Konzentration in µg/ml Intervall (+ 10%) CSF < 0,2 (Referenzbereich) < 0,22 µg/ml > 0,2-0,9 (geringgrad. Erhöhung) > 0,22-0,99 µg/ml > 0,9 (deutliche Erhöhung) > 0,99 µg/ml Serum < 100 (erniedrigt od. Referenzbereich) < 110 µg/ml > 100-200 (geringgrad. Erhöhung) > 110-220 µg/ml > 200 (deutliche Erhöhung) > 220 µg/ml
Eine Übereinstimmung der Messwerte wurde bejaht, wenn die mit den Beads gemessenen IgA-Konzentrationen zur Einordnung in denselben Referenzbereich + ein 10%-Intervall führte wie die mit dem ELISA gemessenen Konzentrationen.
Erfolgte die Einordnung allerdings in unterschiedliche Gruppen, wurde dies als fehlende Übereinstimmung gewertet.
Zum anderen wurde ein statistischer Methodenvergleich nach dem von BLAND und ALTMAN (1986) entworfenen Prinzip durchgeführt. Hierbei werden die Differenzen der Messwerte aus beiden Methoden gegen den Mittelwert der Messwerte beider Methoden aufgetragen, so dass insbesondere die Streuung und Verzerrung der Daten mit berücksichtigt werden. Bei einer hinreichend symmetrischen Verteilung der Differenzen liegen 95% der Messwerte im Bereich der Übereinstimmungsgrenzen („limits of agreement“; berechnet aus d ± 2 x s; d = Mittelwert der Messwerte beider Methoden und s = Standardabweichung der Differenzen). Eine Vorraussetzung für die Gültigkeit des Verfahrens ist, dass die Differenzen keine systematischen Veränderungen aufweisen. Sollte dies doch der Fall sein, kann eine gleichförmige Variabilität der Daten durch eine logarithmische Transformation der Messwerte erreicht werden (BLAND u. ALTMAN 1986). Ein Bland-Altman-Diagramm erlaubt eine gute visuelle Beurteilung der Übereinstimmung bzw. Differenzen zweier Methoden. Eine anschließende Interpretation der Übereinstimmungsintervalle unter klinischen Gesichtspunkten ermöglicht dann die Einschätzung der Güte der Übereinstimmung und somit ein abschließendes Urteil über die Vergleichsmethode.
2.2. Messung von Tau-Protein im Liquor cerebrospinalis
2.2.1. Patientenmaterial und Datenerhebung
In die Studie konnten 51 Hunde, die in den Jahren 2005 bis 2011 in der Klinik für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover aufgrund eines Bandscheibenvorfalls in Hals-, Brust- oder Lendenwirbelsäule vorgestellt wurden, aufgenommen werden. Einschlusskriterien waren neurologische Symptome mit dem Schweregraden 2 bis 5 (Einteilung nach SHARP u. WHEELER 2005) sowie eine stattgefundene Liquorentnahme.
Die Patientendaten wurden hinsichtlich Signalement (Rasse, Geschlecht, Alter), Dauer der Erkrankung bis zur Erstvorstellung, Vorbehandlung, neurologischem Status bei der Erstuntersuchung, Lokalisation der Läsion, Befunde aus der bildgebenden Diagnostik und klinischem Verlauf während des stationären Aufenthaltes retrospektiv aufgearbeitet.
Entsprechend der Dauer der Symptome bis zur Erstvorstellung wurden die Hunde in die folgenden Gruppen unterteilt:
• Akut: 1-5 Tage, (n = 15)
• Subakut: 5-14 Tage, (n = 14)
• Chronisch: > 14 Tage, (n = 20)
• Unbekannt, (n = 2).
Abhängig von der Art der Vorbehandlung erfolgte eine Unterteilung der Hunde in:
• Vorbehandlung mit Glukokortikosteroiden, (n = 23)
• Vorbehandlung ohne Glukokortikosteroide, (n = 26)
• Unbekannt, (n = 2).
Anhand der Befunde der neurologischen Untersuchung am Tag der Erstvorstellung und des Schweregrades der Symptome wurden die Patienten in folgende Gruppen unterteilt (nach SHARP u. WHEELER 2005):
• Grad 1: Schmerzhaftigkeit der Wirbelsäule ohne neurologische Ausfallserscheinungen, (n = 0)
• Grad 2: Gering- bis mittelgradige Parese, Ataxie und
Propriozeptionsdefizite, selbstständig lauffähig, (n = 24)
• Grad 3: Hochgradige Parese; nicht lauffähig, (n = 7)
• Grad 4: Plegie mit erhaltenem Tiefenschmerz, (n = 14)
• Grad 5: Plegie ohne Tiefenschmerz, (n = 6)
Für die spätere statistische Auswertung der Daten wurden die Hunde mit einer Parese (Grad 2 und Grad 3) und die Hunde mit einer Plegie (Grad 4 und 5) in jeweils eine Gruppe zusammengefasst.
Bei 50 Hunden wurde eine MRT (bis 2009 mittels Magnetom Impact Plus, 1.0 Tesla, Siemens AG, Erlangen; ab 2010 mittels Philips Achieva 3.0 Tesla, Philips, Hamburg) in Allgemeinanästhesie durchgeführt. Neben der genauen Lokalisation des Bandscheibenvorfalls wurde insbesondere auf intramedulläre hyperintense Läsionen in der T2-gewichteten SE Sequenz geachtet, da diese einen wichtigen Beitrag zur Prognosestellung liefern (ITO et al. 2005; LEVINE et al. 2009;
BOEKHOFF et al. 2012).
Dementsprechend wurden die Patienten in die nachstehend genannten Befundgruppen eingeteilt:
• Hunde mit Bandscheibenvorfall im Bereich der Halswirbelsäule, (n = 18)
• Hunde mit Bandscheibenvorfall im Bereich der Brust- oder Lendenwirbelsäule, (n = 33)
o Rückenmark ohne intramedulläre hyperintense Läsion, (n = 26) o Rückenmark mit intramedullärer hyperintenser Läsion, (n = 24)
Bei einem Hund erfolgte anstelle eines MRTs ein Myelo-CT, so dass dieser Hund bezüglich der MRT-Befunde nicht mit in die Auswertung genommen werden konnte.
Die Entwicklung der neurologischen Symptomatik während des stationären Aufenthaltes wurde durch tägliche Verlaufskontrollen beobachtet. Eine Verbesserung um einen neurologischen Grad innerhalb einer Woche wurde als positives Ergebnis gewertet. Diese Entwicklung wurde sowohl für die Gesamtheit der erkrankten Hunde als auch getrennt für die einzelnen Erkrankungsgrade (Grad 2/3 und Grad 4/5) betrachtet, um insbesondere die Prognose für die plegischen Hunde beurteilen zu können. Demnach ergab sich folgende Einteilung:
• Besserung alle Hunde, (n = 23)
• Keine Besserung alle Hunde, (n = 28) o Besserung Hunde Grad 2/3, (n = 17)
o Keine Besserung Hunde Grad 2/3, (n = 14) Besserung Hunde Grad 4/5, (n = 6)
Keine Besserung Hunde Grad 4/5, (n = 5)
Von den 51 Hunden mussten 13 Hunde aufgrund einer schlechten Prognose euthanasiert werden, so dass eine weitere Gruppierung in
• Euthanasierte Hunde, (n = 13)
• Weiterhin lebende Hunde, (n = 38)
vorgenommen wurde.
Die detaillierten Angaben zu den Tieren einschließlich Signalement und erhobenen Befunden sind im Anhang V. und VI. zu finden.
2.2.2. Liquorentnahme
Die Gewinnung der Gehirnrückenmarksflüssigkeit erfolgte in Allgemeinanästhesie aus der Cisterna cerebellomedullaris. Unmittelbar nach Entnahme wurden 200 µl des Liquors der routinemäßigen Laboruntersuchung (Bestimmung von Zellzahl, Gehalt an Glukose und Protein) zugeführt. Die verbleibende Probenmenge wurde in Polypropylen-Röhrchen bei -20°C für die spätere Bes timmung der Tau-Protein- Konzentration aufbewahrt.
Als Negativkontrolle diente der Liquor cerebrospinalis von 12 Hunden, die klinisch und neurologisch gesund oder an anderen, für diese Studie unbedeutenden Krankheiten bekannter Genese (z.B. intramuskulärer Abszess, Pankreatitis) erkrankt waren.
2.2.3. Material
Geräte
- Reinstwasser-Aufbereitungssystem GenPure, Fa. TKA Thermo Fisher Scientific, Niederelbert - Gefrierschrank Premium NoFrost,
Fa. Liebherr, Ochsenhausen
- Kühlschrank Comfort, Fa. Liebherr, Ochsenhausen
- Reagenzglasschüttler Reax control, Fa. Heidolph, Schwabach - Synergy 2 Multi-Detektions-Reader für Mikroplatten,
Fa. BioTek Instruments, Bad Friedrichshall
Laborbedarf
- Bechergläser Fa. VWR, Darmstadt
- Pipettenspitzen: 10 µl (kristall; Best.-Nr. 702504), Fa. Brand, Wertheim 200 µl (gelb) (Best.-Nr. 613-0240), Fa. VWR, Darmstadt 1000 µl (blau) (Best.-Nr. 2100610), Fa. Ratiolab, Dreieich - Pipetten Transferpette® einstellbar (0,1-1000 µl)
Fa. Brand, Wertheim
- Pipettierhelfer accu-jet® pro, Fa. Brand, Wertheim - Mehrfachdispenser Handy-step® (Best.-Nr. 705100),
Fa. Brand, Wertheim
- Präzisionsdispenserspitzen 5 ml (Best.-Nr. 702376), Fa. Brand, Wertheim
- Polypropylenröhrchen mit Verschluss 2 ml (Art.-Nr.72.694), Fa. Sarstedt, Nümbrecht
- Polypropylenröhrchen 4 ml (Best.- Nr. 55.532), Fa. Sarstedt, Nümbrecht
- Reagenzröhrchen mit Verschluss, Polypropylen, 15 ml (Best.- Nr. 62.554.001),
Reagenzien und Chemikalien
- INNOTEST® hTAU Ag, (Artikel-Nr. 80323) Fa. Innogenetics®, Ghent, Belgien
- 2 N Schwefelsäure (H2SO4) (Stopplösung für den ELISA)
PC Software
- Gen5™ Reader Control and Data Analysis Software, Fa. BioTek Instruments, Bad Friedrichshall
- GraphPad Prism®, Version 5.0,
Fa. GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA
2.2.4. Messung des Tau-Proteins
Für die Messung des Tau-Proteins im Liquor cerebrospinalis wurde ein kommerziell erhältlicher ELISA verwendet (INNOTEST® hTAU Ag, Innogenetics, Ghent, Belgien).
Das Funktionsprinzip eines ELISA beruht auf einer spezifischen Antigen-Antikörper- Reaktion, die mittels Farbumschlag quantitativ ausgewertet werden kann.
Waschvorgänge zwischen den einzelnen Reaktionsschritten verhindern unspezifische Bindungen und beseitigen überschüssige Reagenzien.
Der verwendete ELISA erfasst humanes Tau-Protein oder dessen Fragmente mittels eines ersten monoklonalen (AT120) und zweier sekundärer, biotinylierter Antikörper (HT7bio und BT2bio). Dieser Antigen-Antikörper-Komplex wird anschließend durch ein peroxidasemarkiertes Streptavidin (HRP-SV) nachgewiesen (siehe Abbildung 2).
Die eingesetzten Antikörper binden sogenanntes „Total Tau“, das heißt, es wird sowohl phosphoryliertes als auch nicht-phosphoryliertes Tau gebunden.
Abbildung 3: Prinzip des Tau-ELISA
Aufgrund der Tatsache, dass Tau ein in vielen verschiedenen Spezies vorkommendes Protein ist und gezeigt werden konnte, dass es konservierte Proteinregionen besitzt, war die Wahrscheinlichkeit groß, dass auch kanines Tau von den verwendeten Antikörpern gebunden wird (VIERECK et al. 1988; JANKE
Vorangegangene Studien zeigten, dass es zu keiner Beeinträchtigungen des Testes durch Hämoglobin, Bilirubin, Albumin und Globulin kommt (NISHIMURA et al. 1998).
50 µL (2 x 25 µl) unverdünnter Liquor cerebrospinalis wurden für die Bestimmung der Konzentration des Tau-Proteins genutzt. Dabei erfolgte die Messung der Proben und des Standards in Duplikaten. Die errechneten Mittelwerte konnten im Folgenden für die statistische Auswertung verwendet werden.
Wurde bei den Messungen innerhalb einer Probe ein Variationskoeffizient von 20%
überschritten, so erfolgte eine Wiederholung des Tests für die betroffene Probe.
Die Gesamtheit der Messwerte wurde nur dann als zuverlässig angesehen, wenn die vom Hersteller empfohlenen Validierungskriterien erfüllt waren. Die Extinktion der Leerwertvertiefungen sollte bei 450 nm < 0,200 OD und die Extinktion des höchsten Standards bei 450 nm > 1,600 OD betragen.
Der mitgeführte Standard erlaubte die Erstellung einer sigmoidalen Standardkurve, anhand derer die Interpolation der unbekannten Tau-Protein-Konzentrationen in den CSF-Proben (pg/ml) durchgeführt wurde.
Die Nachweisgrenze für humanes Tau lag gemäß Herstellerangaben bei 60 pg/ml.
TANAKA et al. (2011) validierte den ELISA für den Hund, wobei gesunde Hunde eine Tau-Protein-Konzentration von im Mittel 29,3 pg/ml aufwiesen. Für die folgende statistische Auswertung der Daten wurden Messwerte zwischen 18,7 und 60,0 pg/ml als Zahlenwerte belassen, während Messwerte < 18,7 pg/ml als nicht messbar (0) klassifiziert wurden (TANAKA et al. 2011).
Versuchsprotokoll des Tau-ELISA
1. Alle Reagenzien auf Raumtemperatur bringen
Liquorproben bei Raumtemperatur auftauen und vor dem Verwenden für 10 sek.
mit Hilfe des Reagenzglasschüttlers mischen.
2. Standard vorbereiten:
Lyophilisiertes, rekombinantes Tau mit 500 µl Probenverdünner rekonstituieren;
15 min. stehen lassen, danach 15 sek. mittels Reagenzglasschüttler mischen.
Ausgehend vom Standard (1200 pg/ml) weitere Verdünnungsstufen (1:2) herstellen (jeweils 300 µl der vorherigen Verdünnung + 300 µl Probenverdünner) durchführen.
- Standardkonzentrationen: 1200, 600, 300, 150 und 75 pg/ml - Die Leerprobe enthält nur Probenverdünner
3. Herstellung der Arbeitslösung 1 (monoklonale Anti-hTAU-Antikörper BT2 und HT7, markiert mit Biotin):
- 100 µl Arbeitslösung 1 mit 10 ml der zugehörigen Verdünnungsflüssigkeit mischen
- In jede Kavität 75 µl Arbeitslösung 1 pipettieren
4. 25 µl jeder Standardkonzentration, 25 µl Probenverdünner (Leerprobe) und 25 µl jeder Liquorprobe (unverdünnt) im Doppelansatz in die entsprechenden Kavitäten pipettieren und durch vorsichtiges Klopfen des Teststreifenhalters mischen.
5. Inkubation der ELISA-Platte für 14-18 Stunden (über Nacht) bei 25 ± 2°C.
6. Herstellung der Arbeitslösung 2 (Peroxidase-markiertes Streptavidin):
- 120 µl Arbeitslösung 2 mit 12 ml der zugehörigen Verdünnungsflüssigkeit mischen
7. Herstellen der Waschlösung (Phosphatpuffer):
- 40 ml Waschlösung mit 960 ml Aqua destillata mischen 8. Platte 4x waschen
9. In jede Kavität 100 µl Arbeitslösung 2 pipettieren
11. Herstellung der Substratlösung (Tetramethylbenzidin gelöst in Dimethylsulfoxid) - 120 µl Substratlösung mit 12 ml Substratpuffer mischen
12. 4x waschen
13. In jede Kavität 100 µl Substratlösung pipettieren
14. Platte für 30 min. bei Raumtemperatur (18-30°C ) lichtgeschützt inkubieren
15. Stoppen der Reaktion: Zugabe von 100 µl 2N-Schwefelsäure in jede Kavität in derselben Reihenfolge und in denselben Zeitabständen wie die Zugabe der Substratlösung
16. Photometrische Auswertung mit Hilfe des ELISA-Readers bei einer Wellenlänge von 450 nm mit Hilfe des Programms Gen5™ (Referenzwellenlänge 620 nm)
2.2.5. Statistische Auswertung
Die deskriptive Auswertung der Messwerte, deren graphische Darstellung in Form von Box-and-Whisker-Plots sowie alle statistischen Berechnungen erfolgten mithilfe des Statistikprogramms GraphPad Prism®, Version 5.0, (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA).
Zunächst wurden die Werte einer jeden Gruppe mittels Kolmogorov-Smirnov Test auf ihre Normalverteilung überprüft. Da die Daten keine Normalverteilung aufwiesen, wurden nicht-parametrische Tests (Kruskal-Wallis und Mann-Whitney U Test) für die Beurteilung statistischer Zusammenhänge angewendet. Alle statistischen Methoden wurden als zweiseitige Tests durchgeführt und als Irrtumswahrscheinlichkeit wurde p< 0,05 angesetzt.
Eine ROC-(Receiver Operating Characteristic)-Kurvenanalyse einschließlich der Berechnung der AUC (Area under the curve), der Testsensitivität und –spezifität wurde durchgeführt, um diejenige Tau-Protein-Konzentration zu ermitteln, die als Schwellenwert für die Einschätzung der Prognose dienen kann.
3. Ergebnisse
3.1. Measurement of IgA in canine CSF using MIA
Evaluation of a microsphere-based immunofluorescence assay for the determination of immunoglobulin A concentrations in
cerebrospinal fluid of dogs
A. Roerig, R. Carlson, A. Tipold
Department of Small Animal Medicine and Surgery, University of Veterinary Medicine Hannover, Hannover, Germany
Research in Veterinary Sciene DOI: 10.1016/j.rvsc.2012.07.013
Abstract
The simultaneous increase of immunoglobulin A (IgA) in serum and cerebrospinal fluid (CSF) is a characteristic finding in dogs suffering from canine steroid-responsive meningitis–arteritis (SRMA). The study aimed at developing and evaluating a microsphere-based immunofluorescence assay (MIA) for the measurement of IgA, trying to fulfil the need of a quicker method using only small volumes of CSF.
Microsphere beads were coated with goat anti-dog IgA antibodies and bound IgA was detected by a mouse anti-dog IgA antibody in combination with a PE-labeled goat anti-mouse IgG. CSF from 44 dogs were tested for IgA and compared with an in-house utilized ELISA.
3.2. CSF Tau in dogs with IVDH
Cerebrospinal fluid tau protein as a biomarker for severity of spinal cord injury in canine intervertebral disk herniation
A. Roerig, R. Carlson, A. Tipold, V.M. Stein*
Department of Small Animal Medicine and Surgery, University of Veterinary Medicine Hannover, Hannover, Germany
*Corresponding author: Tel: +49-511-953-6311 Email: veronika.stein@tiho-hannover.de (V.M. Stein)
Abstract
Intervertebral disk herniation (IVDH) is a common cause of spinal cord injury (SCI) in dogs. Microtubule-associated protein tau derives predominantly from neurons and axons, making it a potential marker of neuronal injury.
A retrospective study, including fifty-one dogs with thoracolumbar or cervical IVDH and 12 clinically normal dogs, was designed to describe associations between cerebrospinal fluid (CSF) tau concentration, degree of neurological signs and motor functional recovery in dogs with IVDH. Signalement, degree of neurological dysfunction and outcome were recorded. Cisternal CSF tau values were determined by an ELISA. Associations between CSF tau concentration and various clinical parameters were evaluated.
Tau protein was significantly elevated in dogs showing plegia (median: 79.9 pg/mL;
P = 0.016) compared to healthy dogs and dogs with paresis (median: 30.1 pg/mL;
P = 0.025). Plegic dogs that improved by one neurological grade within one week had significantly lower tau protein levels compared to plegic dogs that needed more time for recovery or did not show an improvement (P =0.008). A CSF tau concentration of > 41.3 pg/mL had a sensitivity of 86% and specificity of 83% to predict an unsuccessful outcome in plegic dogs based on receiver-operating characteristics curve analysis (area under the curve = 0.887, P = 0.007, 95%
confidence interval [CI]: 0.717 to 1.057).
In conclusion, CSF protein tau levels are positively associated with the severity of spinal cord damage and therefore may serve as a prognostic indicator in dogs with IVDH.
Keywords: spinal cord injury, dog, CSF analysis, protein tau
Introduction
Tau proteins belong to the microtubule-associated proteins family (Weingarten et al., 1975). These phosphoproteins specifically localize in neurons where they bind to microtubules, promoting their assembly and stability (Weingarten et al., 1975; Binder et al., 1985). Tau is not physiologically secreted; its release into the cerebrospinal fluid (CSF) is most probably due to neuron damage or death (Mori et al., 1995).
Therefore CSF tau protein concentrations can serve as a biological marker for axonal damage in the central nervous system (CNS) (Zemlan et al., 1999; Shiiya et al., 2004).
Elevated levels of CSF tau protein have been described in human neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s disease and in multiple sclerosis (Blennow et al., 1995; Andreasen et al., 1998; Terzi et al., 2007). At present, information on tau protein in veterinary medicine is rare. So far tau protein expression in the aging brains of dogs and cats as well as CSF tau levels in dogs with encephalitis have been examined (Head et al., 2005; Pugliese et al., 2006; Tanaka et al., 2011)
Intervertebral disk herniation (IVDH) is a common cause of spinal cord injury (SCI) in dogs, resulting in pain and neurological dysfunction. Severity of neurological signs is determined by neuroanatomical location, velocity and amount of the compressive material as well as duration of compression (Brisson, 2010). IVDH leads to SCI via a combination of primary and secondary events. Primary spinal cord injury refers to the initial mechanical insult whereas secondary injury is a biochemical cascade following the primary event and consisting of vascular dysregulation, neurogenic shock, oxidative stress and excitotoxicity (Dumont et al., 2001).
Several prognostic factors for IVDH were previously studied in CSF samples, such as the percentage of CSF macrophages (Srugo et al., 2011), CSF levels of myelin basic protein and creatinine kinase activity (Levine et al., 2010; Witsberger et al., 2012), concentration of beta-2-microglobulin (Muñana et al., 2007) and CSF glutamate concentration (Olby et al., 1999). These described studies included dogs with thoracolumbar IVDH or dogs with acute signs (Levine et al., 2006; Levine et al., 2010; Srugo et al., 2011). Therefore additional reliable prognostic factors that allow
differentiating between good and poor functional outcome, are needed. Moreover clear cut-off points for unfavourable outcome should be stated (Levine et al., 2010;
Witsberger et al., 2012).
CSF tau levels were highly elevated in human head trauma patients and a correlation was established between clinical improvement and decreased CSF tau levels (Zemlan et al., 1999).We therefore hypothesized that high levels of protein tau reflect the severity of spinal cord damage and that determination of CSF tau concentration has a pivotal value as a prognostic biomarker for motor functional recovery in dogs with IVDH.
Material and Methods
Study design and animals
Medical records of the Department of Small Animal Medicine and Surgery, University of Veterinary Medicine, Hannover, Germany, were retrospectively reviewed (2005 - 2011) for dogs diagnosed with IVDH. The study was performed according to the ethical rules of the University.
On the basis of the severity of the neurological signs 51 dogs were categorized according to Sharp and Wheeler (2005) into five grades: paraspinal hyperesthesia (grade 1), ambulatory paresis, ataxia and proprioceptive deficits (grade 2), nonambulatory paresis (grade 3), plegia with nociception (grade 4), plegia with no deep nociception (grade 5) (Sharp and Wheeler, 2005). Inclusion criteria for this study were dogs suffering from cervical or thoracolumbar IVDH as suggested by magnetic resonance imaging (MRI) findings and in most cases confirmed by decompressive surgery, a severity of grade 2 to 5 at presentation and subsequent analysis of CSF. Dogs were neurologically re-examined seven days after first
The information retrieved from the medical records included signalement (sex, age, breed), time from onset of clinical signs to presentation, previous drug administration with emphasis on glucocorticosteroids, localization of the disk protrusion/extrusion, the occurrence of pathological changes in the myelon detected by MRI and functional neurological outcome (Levine et al., 2009; Boekhoff et al., 2012).All MR images were reviewed by certified neurologists. MR images were evaluated for the presence of an intramedullary hyperintensity over the length of one vertebral body or more (Levine et al., 2009).The outcome was defined to be successful if the dog improved by at least one neurological grade within a week after first presentation at the Department of Small Animal Medicine and Surgery.
Normal research colony dogs (n = 8, Animal Experiment number: 33.42502/05-12.05) as well as four dogs, which were presented at our clinic because of orthopedic, non- neurologic diseases, were used as a control population. All control dogs were required to have normal physical and neurological examinations as well as CSF analysis.
Cerebrospinal fluid (CSF) collection
Cerebrospinal fluid was collected at the time of presentation/admission under general anesthesia from the cerebellomedullary cistern. 200 µL of samples without iatrogenic blood contamination were subsequently used for routine examination (cell count, glucose and protein concentrations) and remaining CSF samples were frozen and stored in polypropylene tubes at -20°C (Lachno et a l., 2011).
Biochemical analysis of Tau protein
Tau protein was determined by a commercially available enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Innotest hTAU, Innogenetics), which recognizes non- phosphorylated and phosphorylated tau protein (Vandermeeren et al., 1993). It is a solid-phase enzyme immunoassay in which tau protein or tau fragments are captured by a primary monoclonal antibody (AT120) and two biotinylated secondary antibodies (HT7bio and BT2bio). 50 µL of CSF was used for each measurement, each sample was measured in duplicates, and the mean was used for further evaluation. Previous
examinations excluded interferences in the assay format for hemoglobin, bilirubin, albumin or globulin (Nishimura et al., 1998).
Statistical Analysis
Data obtained were analyzed using a commercially available software package (GraphPad Prism Version 5.0, GraphPad Software). Variables were controlled for normal distribution using Kolmogorov-Smirnov normality test. As data were not consistent with a Gaussian distribution, nonparametric tests (Kruskal-Wallis and Mann-Whitney U test) were applied. All statistical tests were two-tailed and a P-value
≤ 0.05 was considered to be statistically significant.
For the purpose of analyzing the relation between tau protein levels and severity of neurological dysfunction, dogs were divided into two groups (A: paresis = grade 2/3, B: plegia with and without deep pain sensation = grade 4/5). Within these groups dogs were further categorized based on occurrence of functional improvement by one grade within 7 days or no functional improvement.
For the purpose of describing duration of clinical signs before admission dogs were divided into three subcategories (acute: < 5 days, subacute: 5 - 14 days, chronic: >
14 days). For analyzing the effect of administration of corticosteroids (yes vs. no), location of the spinal cord compression (cervical vs. thoracolumbar) and spinal cord TW2 hyperintensity (yes vs. no) dogs were divided in two groups, respectively.
Receiver-operating characteristics (ROC) curve analysis was performed to determine the overall effectiveness of CSF tau concentration to predict an unsuccessful outcome in dogs showing plegia due to IVDH. Additionally, ROC curve analysis was used to find out if CSF tau concentrations are able to distinguish between paretic and plegic dogs. The cut-off that maximized the Youden index (sensitivity + specificity -1) was selected as optimal.
Results
Fifty-one dogs with cervical (n = 18) or thoracolumbar (n = 33) IVDH of various breeds and with a different degree of neurological dysfunction met the inclusion criteria. Mean age of the dogs was 7.3 years (range 3 - 12.25 years). Breeds included Dachshund (n = 19), mixed breed (n = 13), Beagle (n = 2), Bernese Mountain Dog (n = 2), Cocker Spaniel (n = 2), Rottweiler (n = 2), French Bulldog (n = 2) and 9 other breeds with one dog each. Twenty-three male, 11 castrated male, 7 female and 10 spayed female dogs were examined. The neurological examination revealed 24 dogs with paresis and/or ataxia with proprioceptive deficits (grade 2) whereas 7 dogs were nonambulatory paraparetic (grade 3). Fourteen dogs displayed plegia with nociception (grade 4) whereas in 6 dogs nociception was lost (grade 5). Dogs with paresis (grade2/3, n = 31) and dogs showing plegia (grade 4/5, n = 20) were combined for further evaluation. Forty-four dogs (grade 2: n = 18, grade 3: n = 7, grade 4: n = 14, grade 5: n = 5) underwent decompressive surgery whereas 6 dogs (all classified as grade 2) were treated conservatively and one dog (grade 5) was euthanized after diagnostic imaging.
Glucocorticosteroids were administered to 23 of the 51 dogs with IVDH (45.1%) before presentation (Table 1).
The control group consisted of 12 dogs with a mean age of 5.0 years (range 1.8 - 8.8 years). One female, two spayed females, two males and seven castrated males were examined. Breeds included Beagle (n = 8) and one of each of the following breeds (mixed breed, Labrador Retriever, Boxer, Chihuahua).
n Neurologic grade
Grade 2 Grade 3 Grade 4 Grade 5
24 7 14 6 Paretic dogs
Neurologic improvement No improvement
31 17 14 Plegic dogs
Neurologic improvement No improvement
20 6 14 Clinical signs before admission
Acute Subacute Chronic Unknown
15 14 20 2 Location of spinal cord compression
Cervical
Grade 2 Grade 3 Grade 4 Thoracolumbar Grade 2 Grade 3 Grade 4 Grade 5
18 11 3 4 33 13 4 10 6 administration of glucocorticosteroids
yes no
unknown
23 26 2 T2W Hyperintensity of spinal cord
(length > one vertebrae) yes
no
no MRI (Myelo-CT)
24 26 1 Treatment
Decompressive surgery Conservative treatment Euthanasia
44 6 1
Table 1. Clinical signs, treatment and MRI findings of 51 examined dogs with IVDH.
