Towards an evaluation of the health risk posed by the in vivo nitrosation of foods

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Towards an evaluation of the health risk posed by the in vivo nitrosation of foods

Doctoral Thesis

Author(s):

Shephard, Sarah E.

Publication date:

1987

Permanent link:

https://doi.org/10.3929/ethz-a-000413881 Rights / license:

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TOWARDS AN EVALUATION OF THE HEALTH RISK

POSED BY THE IN VIVO NITROSATION OF FOODS

A dissertation submitted to the

SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH for the

degree

^of

Doctor of Natural Sciences

presented by

SARAH E. SHEPHARD, ^B.Sc.

born March 31, ¹⁹⁶⁰ citizen of Canada

accepted ^on the recommendation of Prof. Dr. Ch. Schlatter, ^examiner Prof. Dr. F.

Wurgler,

co-examiner

PD Dr. W.K. Lutz, co-examiner

1987

Parts of this thesis have been published ^in:

Food & Chemical

Toxicology,

Vol.25, No.l,

Pergamon

^Press

(1987).

The Relevance of N-Nitroso

Compounds

^{to Human Cancer:} Exposures ^and

Mechanisms. H. Bartsch, ^R. Schulte-Hermann, ^IK. O'Neill, Eds., ^{IARC Sci.}

Publ.

84,

^Int.

Agency

^Res. Cancer, Lyon

(1987).

- 186 ^-

12. S U M M A R Y

In vivo nitrosation of

dietary components

could lead to the formation of

carcinogenic

^N-nitroso

compounds

^{(NOC). The}

possible

health risk

posed by endogenous

nitrosation

depends

^{on several factors: the} concentrations of precursors and nitrite in the

stomach,

^the

speed

^of

nitrosation of the individual precursors, and the

carcinogenicity

^{of the}

resulting

N-nitroso derivatives. The health risks

arising

^{from the}

endogenous

nitrosation of

dietary primary

^&

secondary alkyl

^and

aryl amines, primary

^&

secondary

^amino

acids,

^amides

(including peptides), guanidines

^{and ureas were}

compared

and evaluated

using

^a combination of in vitro and in vivo models,

along

^with theoretical considerations.

Two colorimetric in vitro

screening

^{tests were}

developed

^{to examine} the nitrosation

speed

^of

dietary

precursors, and the

stability

^{and the}

alkylating ability

^{of the}

resulting

^{NOC. These test}

systems,

^{which used}

p-(4-nitrobenzyl)-pyridine

^{(NBP) as}

nucleophile,

^were

particularly

^useful for

testing

the formation and

alkylating ability

of the unstable

primary

NOC and the N-nitrosoureas. Overall reactivities

(nitrosation/alkylation) spanned

^{more than 5 orders of}

magnitude,

^{from the}

peptides (reacting

^at

the N-terminal amino

group),

^{ureas, and}

primary arylamines

^{at the}

top,

down to the

guanidines, simple alkylamines

^and

cyclizing

amino acids

(Lys,

Glu, Gin) at or below the limit of detection.

The roles of

pyrrolidine, putrescine

^and

proline

^as

dietary

precursors of

N-nitrosopyrrolidine

^{(NPYR) were examined.} The precursors

were nitrosated in

vitro,

^{and the NPYR}

yield

^determined

by

^GC

analysis.

From the reaction

kinetics,

^the

yield

^{of NPYR was in each case estimated}

to be

negligible

^under

gastric

conditions.

The

DNA-arylating ability

^of

p-hydroxymethylbenzene

^{diazonium ion} (BDI), ^the ultimate nitrosation

product

^{of a} primary

arylamine,

^was measured in vivo

using

tritium-labelled

compound.

^Covalent

binding

^to

DNA in the mouse occurred

mainly

^at the site of

application

^(stomach).

The level of DNA

binding placed

BDI among weak

genotoxic agents.

In vivo nitrosation/DNA

alkylation experiments

^were carried out on a urea and a

glycine

derivative. Nitrite and radiolabeled precursor ^were

given by

oral gavage to

rats,

^DNA of the liver and

digestive

tract organs

was

purified,

^{and the}

specific radioactivity

^{of the DNA was used as a}

measure of DNA

alkylation.

^{At a}

gastric

nitrite concentration of approx¬

imately

¹⁵ mM, the resultant level of DNA

binding

(examined in

liver,

stomach and small intestine)

by dicarbamoyl putrescine agreed

^{well with}

the value

predicted by

^{the in} vitro models. A similar

experiment

^with

glycine ethylester, however,

led to far lower levels of DNA

binding

ⁱⁿ

stomach and liver than

predicted by

^{the NBP test results. It is not}

yet

known whether this was due to DNA-adduct

instability

^{or to} the effect of

trapping by

^food

components

^{in the rat stomach.}

Finally,

^an estimate of the health risk

posed by consumption

^{of each}

precursor in a normal Western diet was calculated

using

the mathematical formula: Health risk ^-

[daily

^{intake of}

precursor]

^x

[gastric

^nitrite

concentration]"

x [nitrosation ^rate constant] x

[carcinogenicity

^{of NOC} derivative]. ^The risk estimates

spanned

nine orders of

magnitude;

however,

^{for normal}

eating habits,

^the risk from all precursors ^was estimated to be lower than that from exogenous

dietary

^N-nitroso-

dimethylamine

^(NDMA).

Upon combining

the results of all these

experiments,

the precursor classes could be divided into two groups:

a) Low

priority:

Primary & secondary alkvlamines,

primary

^&

secondary alkvl amino acids

(except

^{those with an aromatic or}

S-containing

^side

chain), guanidines.

With these precursors, under normal

gastric

^nitrite

concentrations,

^the combined factors of

daily intake,

nitrosation rate and

carcinogenicity

^{result in a} health risk

negligible

ⁱⁿ

comparison

^{to the}

dietary

^{burden of} exogenous NDMA (risk relative to NDMA:

10"9

to

10"4).

b)

High priority:

^Ureas,

arylamines, peptides.

Under normal

gastric conditions,

^the risk from these precursors is also smaller than that from

-4 -2

exogenous ^NDMA (relative risk 10 to 10 ). Under conditions of

particularly high gastric

^nitrite

burden,

the health risk could

approach

the levels of NDMA, ^{but would}

only

very

rarely

^{exceed it.}

The latter three precursor classes,

along

^{with the} "nonclassical"

nitroso precursors (indoles ^and other aromatics.

S-containing compounds)

should be the focus of future research on

endogenous

nitrosation.

- 188 ^-

13. ZUSAMMENFASSUNG

Die

endogene Nitrosierung

^von

Nahrungsmitteln

^im

Verdauungstrakt

^kann

zur

Bildung

^von

kanzerogenen N-Nitrosoverbindungen

(NOC) fiihren. Das daraus abzuleitende Gesundheitsrisiko

hangt

^von mehreren Faktoren ab:

von der Konzentration von Vorlaufer und Nitrit im

Magen,

^{der Nitrosie-}

rungsgeschwindigkeiten

^der verschiedenen Vorlaufer, und von der Kanzero-

genitat

^der

gebildeteten

N-Nitrosoderivate. Die

Bedeutung

^von

primaren

und sekund'aren

Alkyl-

^und

Arylaminen, primaren

^{und sekundaren}

Aminosauren,

Amiden (einschliesslich

Peptiden),

^{Guanidinen und} Harnstoffen als

gesundheitliches

Risiko nach

endogener Nitrosierung

^wurde

abgeschatzt

anhand einer Kombination von in vitro und in vivo Modellen und

theoretischen

Uberlegungen.

Es wurden zwei kolorimetrische ^{in vitro}

Testsysteme entwickelt,

^urn Informationen uber die

Nitrosierungsgeschwindigkeiten

^der Vorlaufer und die Stabilitat bzw. Reaktivitat der verschiedenen NOC zu erhalten. Die

Systeme

verwendeten

p-Nitrobenzylpyridin

^{(NBP) als}

Nukleophil

^{und waren}

insbesondere

geeignet

^zur

Untersuchung

^der

Bildung

^und

Alkylierungs-

potenz

der instabilen

primaren

^NOC sowie der N-Nitrosoharnetoffe. GQsamt- reaktivifaten

(Nitrosierungs-

^und

Alkylierungsgeschwindigkeiten)

umfassten mehr als 5

Zehnerpotenzen,

^{von den}

Peptiden

^{(die an der} N-terminalen

Aminogruppe reagieren),

den Harnstoffen und den

primaren Arylaminen

^{hinunter bis zu den}

Alkylaminen, ringbildenden

Aminosauren

(Glu, Gin, Lys)

^und Guanidinen unter der

Nachweisgrenze.

Die

Bedeutung

^von

Pyrrolidin,

Putrescin und Prolin als VorTaufer fur

N-Nitrosopyrrolidin

(NPYR) wurde untersucht. Die Vorlaufer wurden in vitro nitrosiert und die NPYR-Ausbeute durch

GC-Analyse

^{ermittelt. Aus}

der Reaktionskinetik der drei Vorlaufer

geht hervor,

^{dass die unter}

Magen- bedingungen gebildeten Mengen

^{an NPYR in}

jedem

^Fall

vernachlassigbar

klein sind.

Die

DNS-arylierende

^{Potenz von}

p-Hydroxymethylbenzoldiazoniumion (BDI),

^{das ultimale}

Elektrophil

^nach

Nitrosierung

^des

entsprechenden primaren N-Nitrosoarylamins,

^{wurde in} vivo mittels radioaktiv markierter

Verbindung

^{bestimmt. Kovalente}

Bindung

^{an DNS in der Maus fand vor allem}

am

Applikationsort

^(dem

Magen)

^{statt. Im}

Vergleich

mit Standard-

kanzerogenen

^{war BDI nur schwach}

genotoxisch.

In vivo

Nitrosierungs/DNS-Alkylierungsversuche

^{wurden mit einem Harn-}

stoff und einem

Glyzinderivat durchgeflihrt.

Nitrit und radioaktiv

markierte Substanz wurden

peroral

^{an Ratten}

appliziert.

^{Die DNS aus}

Magen,

Dunndarm und .Leber wurde

gereinigt,

^{und die}

spezifische

^Radio-

aktivitat an der DNS wurde als Mass fur die

DNS-Alkylierung

^verwendet.

Bei einer Nitritkonzentration von ca. 15 mM im

Magen

^erreichte

Dicarbamoylputrescin

(DCP) in alien untersuchten

Organen

^eine

DNS-Bindungsstarke,

^die

aufgrund

der in vitro Modelle erwartet wurde.

Ein "ahnlicher Versuch mit

Glyzinathylester ergab jedoch

eine unerwartet tiefe

DNS-Bindung.

^Ob dies in einer Instabi1itat des DNS-Adduktes Oder in einem

Abfangeffekt

^{durch die}

Nahrung

^im

Magen

^der Versuchstiere

begrtindet

war, bleibt

ungewiss.

Das

Gesundheitsrisiko,

^das die Aufnahme der einzelnen Vorlaufer aus

einer ublichen westlichen

Nahrung darstellt,

^wurde auch mathematisch

folgendermassen abgeschatzt:

^{Risiko =»}

[tagliche

Aufnahme des Vorlaufers]

x [Nitritkonzentration ^im

Magen]n

^x

[Nitrosierungsrate]

^{x [Kanzero-}

genitat

^des

gebildeten

^{NOC]. Die}

Risikoabschatzung ergab

^eine

Spanne

^von 9

Zehnerpotenzen. Verglichen

^{mit der}

Belastung

^durch

vorgebildetes

N-Nitrosodimethyl

amin (NDMA) in der

Nahrung

ist bei normalen

Essgewohn-

heiten das aus einer

endogenen Nitrosierung

resultierende Risiko bei alien Vorlaufern klein.

Aufgrund

^aller

durchgefuhrten Experimente

^konnten die einzelnen Vorlauferklassen in zwei

Gruppen eingeteilt

^werden:

a)

Niedrige

^Prioritat: Primare und sekundare Alkvlamine. primare und sekundare Alkvlaminosauren

(ausgenommen jene

mit aromatischen oder

S-haltigen Seitenketten),

sowie Guanidine. Bei diesen Vorlaufern und bei normalen Nitritkonzentrationen im

Magen

^{ist das}

gesundheitliche Risiko,

welches sich aus

taglicher Aufnahme, Nitrosierungsrate

^und

Kanzerogenitat

des

Nitrosierungsproduktes

zusammensetzt,

vernachlassigbar

^im

Vergleich

zu der

Belastung

mit exogen via

Nahrung aufgenommenem

NDMA (das relative Risiko

betragt 10"9

bis

10"4).

b) Hohe Prioritat: Harnstoffe. Arvlamine. Peptide. Bei

Normalbedingungen

^im

Magen

^{ist das aus} diesen Vorlaufern resultierende Risiko ebenfalls kleiner als

dasjenige

^aus exogen

zugefiihrtem

^NDMA (relatives Risiko 10" bis

10"2).

Bei sehr hohem

Nitritgehalt

^im

Magen

^{kbnnte das}

gesundheitliche

^{Risiko das Niveau von NDMA}

erreichen,

wurde es aber kaum uberschreiten.

Die drei

letztgenannten Stoffklassen,

^zusammen mit den "nicht- klassischen" Nitrosovorlaufern (Indole und andere aromatische. sowie S-haltiae Substanzen), sol 1 ten bei weiteren

Untersuchungen

^uber

endogene

Nitrosierbarkeit im

Mittelpunkt

stehen.