Untersuchung des Einflusses von Interleukin-10 auf den Verlauf der experimentellen
Theilervirusinfektion in SJL-Mäusen
INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Ann-Kathrin Uhde
Seesen
Hannover 2015
Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Andreas Beineke Institut für Pathologie
1. Gutachter: Prof. Dr. Andreas Beineke 2. Gutachter: Prof. Dr. Ludwig Haas
Tag der mündlichen Prüfung: 19.11.2015
meinen Eltern
&
meinem Freund Christian in Liebe und Dankbarkeit
♥
The process of scientific discovery is, in effect, a continual flight from wonder.
(Albert Einstein)
Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden bereits vorab zur Veröffentlichung eingereicht:
A.-K. Uhde, V. Herder, M. Akram Khan, M. Ciurkiewicz, D. Schaudien, R. Teich, S.
Floess, W. Baumgärtner, J. Huehn and A. Beineke (2015):
Viral infection of the central nervous system exacerbates interleukin-10 receptor deficiency-mediated colitis in SJL mice.
eingereicht
Teilergebnisse der vorliegenden Arbeit wurden bereits als Kongressbeiträge präsentiert:
A.-K. Uhde, V. Herder, J. Hühn, R. Teich, W. Baumgärtner und A. Beineke(2014):
Interleukin-10 receptor blockade in Theiler´s murine encephalomyelitis.
2nd Joint European Congress of the ESVP, ESTP and ECVP 27. bis 30. August 2014 in Berlin
A.-K. Uhde, V. Herder, J. Hühn, W. Baumgärtner und A. Beineke(2014):
Interleukin-10-Rezeptorblockade bei der Theiler‘schen murinen Enzephalomyelitis, einem Tiermodell für Entmarkungskrankheiten.
57. Jahrestagung der DVG-Fachruppe „Pathologie“
8. bis 9. März 2014 in Fulda
A.-K. Uhde, V. Herder, R. Teich, S. Flöß, W. Baumgärtner, J. Hühn und A. Beineke (2015):
Interleukin-10 receptor blockade enhances hippocampal damage of Theiler´s virus- infected SJL mice.
Joint European Congress of the ESVP and ECVP 2. bis 5. September 2015 in Helsinki
A.-K. Uhde, V. Herder, R. Teich, S. Flöß, W. Baumgärtner, J. Hühn und A. Beineke (2015):
Interleukin-10 receptor blockade enhances neuroinflammation in Theiler´s murine encephalomyelitis.
60th Annual Meeting of the German Society for Neuropathology and Neuroanatomy 26. bis 28. August 2015 in Berlin
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 3
2.1 Die Multiple Sklerose... 3
2.2 Tiermodelle der Multiplen Sklerose ... 5
2.3 Das Theiler´sche murine Enzephalomyelitisvirus ... 7
2.4 Die Immunantwort bei der Theiler´schen murinen Enzephalomyelitis ... 9
2.4.1 CD4+-T-Helferzellen ... 9
2.4.2 CD8+-zytotoxische T-Zellen ... 14
2.4.3 Regulatorische T-Zellen ... 16
2.4.4 B-Zellen / Plasmazellen ... 17
2.4.5 Antigenpräsentierende Zellen ... 18
2.5 Zytokine bei der Theiler´schen murinen Enzephalomyelitis ... 20
2.6 Interleukin-10 ... 24
2.7 Interleukin-10 und virale Infektionskrankheiten ... 30
3 Hypothesen und Ziele ... 33
4 Material und Methoden ... 35
4.1 Verwendete Mäuse und Versuchsdurchführung ... 35
4.1.1 Nicht infizierte Tiere (erster Versuchsteil) ... 35
4.1.2 Tiere, die mit dem Theiler´schen murinen Enzephalomyelitisvirus infiziert wurden und anti-Interleukin-10-Rezeptor-Antikörper in der akuten Phase der Infektion erhielten (zweiter Versuchsteil) ... 36
4.1.3 Tiere, die mit dem Theiler´schen murinen Enzephalomyelitisvirus infiziert wurden und anti-Interleukin-10-Rezeptor-Antikörper in der chronischen Phase der Infektion erhielten (dritter Versuchsteil) ... 38
4.1.4 Klinische Untersuchung ... 40
Inhaltsverzeichnis II
4.1.5 Sektion und Gewinnung von Probenmaterial ... 43
4.2 Histologie ... 44
4.2.1 Semiquantitative Auswertung der Läsionen des Dünndarms, Zäkums und Kolons ... 45
4.2.2 Semiquantitative Auswertung der Läsionen im Rückenmark ... 45
4.3 Immunhistologie ... 47
4.3.1 Durchführung ... 47
4.3.2 Protokoll für die Immunhistologie an Paraffinschnitten ... 49
4.3.3 Auswertung ... 52
4.4 Isolation von Ribonukleinsäure ... 53
4.5 Reverse Transkription ... 54
4.6 Konventionelle Polymerase-Kettenreaktion ... 55
4.7 Gelelektrophorese ... 57
4.8 Reverse Transkriptase-quantitative Polymerase-Kettenreaktion ... 57
4.9 Durchflusszytometrie ... 60
4.9.1 Durchführung ... 60
4.9.2 Protokoll für die Durchflusszytometrie ... 61
4.10 Statistik ... 64
5 Viral infection of the central nervous system exacerbates interleukin-10 receptor deficiency-mediated colitis in SJL mice ... 66
5.1 Nonstandard abbreviations ... 67
5.2 Abstract ... 68
5.3 Introduction ... 69
5.4 Results ... 72
5.5 Discussion ... 90
5.6 Materials and Methods ... 96
5.6.1 Experimental design ... 96
5.6.2 Histology ... 98
5.6.3 Immunohistochemistry ... 99
5.6.4 RNA isolation and reverse transcription ... 101
5.6.5 Reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction ... 102
5.6.6 Flow cytometry ... 103
5.6.7 Statistical analysis ... 104
5.7 Acknowledgements ... 105
5.8 References ... 106
5.9 Supplemental material ... 115
6 Diskussion ... 126
6.1. Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen und ihre Pathogenese ... 126
6.2 Chronisch-entzündliche Darmerkrankungen des Menschen ... 128
6.3 Exazerbation von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen durch virale Infektionen ... 130
6.4 Wechselwirkungen zwischen Darm und Zentralem Nervensystem ... 132
6.4.1 Der Einfluss von psychischem Stress ... 132
6.4.2 Die Bedeutung der Darmflora für die Etablierung von Autoimmunkrankheiten ... 134
6.5 Komorbidität von Multiple Sklerose und chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen ... 136
6.6 Mögliche Ursachen für die begrenzte Modulation der Entzündungsreaktion im Rückenmark nach Blockade des Interleukin-10-Rezeptors ... 137
6.6.1 Kompartimentalisierung der Entzündung im Zentralen Nervensystem………. ... 138
6.6.2 Die Blut-Hirn-Schranke ... 139
Inhaltsverzeichnis IV
6.6.3 Immunologischer Erschöpfungszustand und Sequestration der
Entzündung im Darm ... 141
6.7 Interleukin-10 und andere Autoimmunkrankheiten ... 143
6.8 Schlussfolgerungen ... 145
7 Zusammenfassung ... 147
8 Summary ... 150
9 Literaturverzeichnis ... 153
10 Anhang ... 201
10.1 Bezugsquellen für Chemikalien, Reagenzien und Antikörper ... 201
10.2 Bezugsquellen für Geräte, Software und Einmalartikel... 209
10.3 Bezugsquelle für die Tiere ... 215
10.4 Lösungen und Puffer ... 216
10.5 Abkürzungsverzeichnis ... 218
11 Danksagung ... 223
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 2-1: Aktivierung von CD4+ T-Lymphozyten 10 Abbildung 2-2: Kreuzregulation der Th1/Th2-Immunität 12 Abbildung 2-3: Interaktion von IL-10 mit dem IL-10R-Komplex 26 Abbildung 4-1: Versuchsdesign von Experiment 2 38 Abbildung 4-2: Versuchsdesign von Experiment 3 40 Figure 5-1: Motor coordination in Theiler’s murine encephalomyelitis
virus-infected SJL mice 73
Figure 5-2: Clinical effects of Theiler`s murine encephalomyelitis virus- infection in SJL mice following IL-10R blockade 74 Figure 5-3: Neuropathological findings in Theiler’s murine
encephalomyelitis virus-infected SJL mice 75 Figure 5-4: Effects of IL-10R blockade upon the spinal cord in Theiler’s
murine encephalomyelitis virus-infected SJL mice 77 Figure 5-5: Enteric disease following IL-10R blockade in non-infected
SJL mice 80
Figure 5-6: Effects of IL-10R blockade upon the spleen in non-infected
SJL mice 82
Figure 5-7: Theiler’s murine encephalomyelitis virus-infection
exacerbates enteric disease following IL-10R blockade 84 Figure 5-8: Effects of acute Theiler’s murine encephalomyelitis
virus-infection (experiment I) upon cytokine expression and phenotypical changes in the spleen of IL-10R blocked SJL
mice 86
Figure 5-9: Effects of chronic Theiler’s murine encephalomyelitis virus- infection (experiment II) on cytokine expression and phenotypical changes in the spleen of IL-10R neutralized
SJL mice 88
Abbildungsverzeichnis II
Figure 5-10: Leukomyelitis in Theiler’s murine encephalomyelitis
virus-infected SJL mice 115
Figure 5-11: Study design 116
Abbildung 6-1: Übersicht über mögliche Auswirkungen der Hypothalamus- autonomes Nervensystem-Achse und der Hypothalamus-
Hypophysen-Nebennierenrinden-Achse auf den Darm
bei Morbus Crohn 134
Abbildung 6-2: Aufbau der Blut-Hirn-Schranke 139
Tabellenverzeichnis
Tabelle 2-1: Übersicht über die Wirkungen von IL-10 29 Tabelle 4-1: Übersicht über die verwendeten Tiere aus Versuch 1 36 Tabelle 4-2: Übersicht über die verwendeten Tiere aus Versuch 2 37 Tabelle 4-3: Übersicht über die verwendeten Tiere aus Versuch 3 39 Tabelle 4-4: Bewertungskriterien der klinischen Untersuchung 42 Tabelle 4-5: Semiquantitative Auswertung des Darms 46 Tabelle 4-6: Semiquantitative Auswertung des Rückenmarks 47 Tabelle 4-7: Übersicht über die durchgeführten immunhistologischen
Untersuchungen 51
Tabelle 4-8: Probenansatz für die konventionelle Polymerase-
Kettenreaktion 55
Tabelle 4-9: Spezifische Primerpaare für den mRNS-Nachweis von Zytokinen, Foxp3, TMEV, MBP und den drei
Referenzgenen GAPDH, HPRT und β-Aktin 56 Tabelle 4-10: Temperaturprofil und Zyklusdauer für die Amplifikation der
cDNS 59
Tabelle 4-11: Zusammenfassung der Antikörper für die
Durchflusszytometrie 64
Table 5-1: Summary of antibodies used for immunohistochemistry 101 Table 5-2: Summary of statistical analyses (p-values): effects of
IL-10R blockade during acute Theiler’s murine
encephalomyelitis (experiment I) 117
Table 5-3: Summary of statistical analyses (p-values): effect of IL-10R blockade during chronic Theiler’s murine encephalomyelitis
(experiment II) 119
Table 5-4: Statistical analyses of obtained data: effects of IL-10R
blockade in non-infected SJL mice 121
Tabellenverzeichnis II
Table 5-5: Summary of statistical analyses (p-values): effects of acute Theiler’s murine encephalomyelitis virus-infection upon
IL-10R blockade (experiment I) 122
Table 5-6: Summary of statistical analyses (p-values): effects of chronic Theiler’s murine encephalomyelitis virus infection upon IL-10R blockade (experiment II) 124 Tabelle 6-1: Übersicht über inflammatorische Erkrankungen, die mit
Polymorphismen des Interleukin-10-Gens assoziiert sind 144
1 Einleitung
Bei dem Theiler´schen murinen Enzephalomyelitisvirus (TMEV, Theilervirus, Theiler´s murine encephalomyelitis virus) handelt es sich um ein einzelsträngiges RNS-Virus aus dem Genus Cardiovirus und der Familie der Picornaviridae (PEVEAR et al., 1987). Natürlich infizierte Mäuse (Mus musculus) entwickeln nach fäkal/oraler Übertragung eine asymptomatische, enterale Infektion mit Serokonversion. TMEV persistiert dabei überwiegend in Enterozyten und den mesenterialen Lymphknoten.
Nur in seltenen Fällen tritt auch eine Infektion des Zentralen Nervensystems (ZNS) in Form einer Poliomyelitis und -enzephalitis auf (LIPTON et al., 2001). Die mehr als 20 bekannten TMEV-Stämme können anhand ihrer Neurovirulenz nach experimenteller, intrazerebraler Infektion in zwei Gruppen unterteilt werden. Die Gruppe der hochvirulenten Stämme beinhaltet den GDVII- und den FA-Stamm. Diese verursachen eine in der Regel fatal verlaufende Polioenzephalitis. Überleben die Mäuse die Infektion, wird das Virus vollständig eliminiert. Im Gegensatz hierzu, verursachen die weniger neurovirulenten Stämme der zweiten Gruppe, wie beispielsweise der BeAn-Stamm, einen biphasischen Krankheitsverlauf in empfänglichen Mausstämmen. Dabei ist der Krankheitsverlauf nicht nur abhängig vom verwendeten Virusstamm, sondern vor allem vom Genotyp der Maus. Während SJL-Mäuse nach intrazerebraler Injektion eine biphasische Erkrankung mit akuter Polioenzephalitis und chronisch-demyelinisierender Leukoenzephalomyelitis entwickeln, eliminieren C57BL/6-Mäuse und einige BALB/c-Substämme das Virus nach der akuten Phase und entwickeln keine Demyelinisierung (LIPTON, 1975;
LIPTON und DAL CANTO, 1979; FU et al., 1990; OLESZAK et al., 2004).
Auf Grund des chronisch-progressiven Charakters und dem histologischen Bild dient die chronische Phase der TMEV-Infektion als ein wichtiges Tiermodell für die Multiple Sklerose (MS) des Menschen (DAL CANTO und RABINOWITZ, 1982; DENIC et al., 2011). Trotz intensiver Forschungsbemühungen zur Pathogenese und Therapie der MS sind die Therapieerfolge, insbesondere in der chronisch-progressiven Phase der Erkrankung noch immer unzureichend (FITZNER und SIMONS, 2010). In den letzten Jahren rückten besonders immunmodulatorische Therapeutika in den Mittelpunkt der
Einleitung 2
Forschung (AMEDEI et al., 2012). Vorangegangene Arbeiten mit der Theiler´schen murinen Enzephalomyelitis (Theiler´s murine encephalomyelitis, TME) zeigten eine erhöhte Expression von Interleukin (IL)-10 im Gehirn von SJL-Mäusen im Vergleich zu resistenten C57BL/6-Mäusen. Die erhöhten IL-10-mRNS-Konzentrationen gingen mit einer verzögerten Viruselimination einher und unterstrichen die Hypothese, dass ein Ungleichgewicht im Zytokin-Milieu in der Frühphase der Infektion zu einer unzureichenden Viruselimination in der chronischen Phase der Erkrankung beitragen könnte (HERDER et al., 2012). Eine verminderte erregerspezifische Immunantwort durch IL-10 konnte auch bereits bei der experimentellen Infektion mit dem Lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) festgestellt werden. Eine in vivo Blockade des IL-10-Rezeptors (IL-10R) durch einen neutralisierenden Antikörper resultierte hierbei in einem therapeutischen Effekt durch Etablierung einer protektiven Immunantwort mit konsekutiver Elimination des Virus (BROOKS et al., 2006;
EJRNAES et al., 2006). Ähnliche Effekte wurden auch bereits bei der experimentellen Infektion mit dem West-Nil-Virus (WNV) sowie bei der Humanen Immundefizienz-Virus (HIV)- und Hepatitis-C-Virus (HCV)-Infektion des Menschen festgestellt (RIGOPOULOU et al., 2005; BAI et al., 2009; BROCKMAN et al., 2013).
Allerdings ist die Bedeutung von IL-10 für die chronische Phase der TME bisher nur unzureichend untersucht worden. Auch im Hinblick auf die MS des Menschen kam damit die Frage auf, ob eine Unterbrechung der IL-10-Signalkaskade einen therapeutischen Effekt bei der TME zur Folge hat oder die Entwicklung von immunpathologischen Prozessen in nicht-infizierten und infizierten SJL-Mäusen fördert.
2 Literaturübersicht
2.1 Die Multiple Sklerose
Bei der Multiplen Sklerose (MS) handelt es sich um die häufigste chronisch- entzündliche Erkrankung des ZNS bei jungen Erwachsenen (HIRTZ et al., 2007). Sie betrifft etwa 0,1% der Weltbevölkerung, wobei Nordamerika und Europa topographisch deutlich überrepräsentiert sind (HAUSER und OKSENBERG, 2006).
MS führt zu sensorischen, motorischen und kognitiven Beeinträchtigungen, die mit Depressionen, Migräne, Vertigo (Schwindel), Diplopie (Doppelsehen), Parästhesie, Paraplegie, Trigeminusneuralgie, Müdigkeit, Harnabsatzstörungen und sexueller Dysfunktion einhergehen können (PIKSTON et al., 2007; GOLDENBERG, 2012).
Die Ätiologie dieser Erkrankung ist unklar. Vermutlich liegt eine multifaktorielle Genese mit einer Kombination aus genetischer Prädisposition und nicht-genetischen Faktoren zu Grunde (CREE, 2007). Neben Umweltfaktoren werden auch zahlreiche virale Erreger, wie das Masern-, das Epstein-Barr-, das Herpes-simplex-, das Varizella-Zoster- und das humane Herpesvirus-6 als auslösende Agenzien diskutiert (JACOBSON et al., 1985; BERGSTRÖM et al., 1989; SINDIC et al., 1994;
CHALLONER et al., 1995; RAND et al., 2000). Darüber hinaus wird eine Beteiligung humaner Coronaviren sowie des kaninen Staupe- und des humanen T-Zell- Leukämie-Virus von einigen Autoren in Erwägung gezogen (HAAHR und HÖLLSBERG, 2001; RIMA et al., 2006). Im Liquor cerebrospinalis von MS-Patienten wurde außerdem ein MS-assoziiertes Retrovirus nachgewiesen (PERRON et al., 1997). Neben monoviralen Infektionen könnten auch Koinfektionen verschiedener viraler Erreger zur Entstehung der MS beitragen. Beispielsweise wurden neurotrope Herpesvirusinfektionen als Kofaktor, im Sinne eines zusätzlichen Stimulus (triggering effect) für latente Retrovirusinfektionen bei MS-Patienten beschrieben (PERRON et
Literaturübersicht 4
al., 1993). Allerdings ist bisher keines dieser Viren in einen eindeutigen, ätiologischen Zusammenhang mit der Entstehung der MS gebracht worden.
Die klinische Einteilung der MS erfolgt in vier Gruppen abhängig vom Krankheitsverlauf (GOLDENBERG, 2012): Die häufigste Form ist die schubförmig- remittierende MS. Diese Verlaufsform ist durch akute Schübe gekennzeichnet, die von einer temporären Rekonvaleszenz gefolgt werden, in der die Symptome deutlich milder werden oder ganz abklingen. Im chronischen Verlauf der Erkrankung kann diese Verlaufsform in die sekundär progrediente MS übergehen. Die Symptome werden stärker und die Intervalle kürzer, zum Teil entfallen die Phasen der Rekonvaleszenz vollständig. In selteneren Fällen, bei circa 10% der MS-Patienten, tritt eine primär progrediente Form auf, bei der die Symptome von Beginn an stark zunehmen und keine Phasen der Remission auftreten. Bei der vierten Verlaufsform handelt es sich um die progressiv-schubförmige MS. Sie tritt bei weniger als 5% der Betroffenen auf und ist durch einen primär progressiven Verlauf mit schubförmig auftretender Verstärkung der Symptome charakterisiert (HAUSER et al., 2008;
GOLDENBERG, 2012).
Pathologisch-anatomisch treten bei der MS multifokale, rötliche oder graue Areale von derber, teils gummiähnlicher Konsistenz in der weißen Substanz des Gehirns und des Rückenmarks auf. Oftmals ist darüber hinaus auch der Sehnerv betroffen (Optikusneuritis; GOLDENBERG, 2012). Histologisch handelt es sich um einen plaqueförmigen Verlust von Oligodendrozyten und Myelin, der mit einer Infiltration von Lymphozyten und Makrophagen vergesellschaftet ist (HAUSER et al., 2008). In der progressiven Phase der Erkrankung liegt darüber hinaus eine großflächige Demyelinisierung in der grauen Substanz vor, die besonders den zerebralen und zerebellären Kortex sowie den Hippocampus betrifft. Außerdem weisen häufig auch makroskopisch unveränderte Areale der weißen Substanz (normal appearing white matter, NAWM) eine diffuse, entzündliche Infiltration und Mikrogliaaktivierung auf (KUTZELNIGGL et al., 2005; GEURTS et al., 2007; LASSMANN et al., 2009).
Die Läsionen in der weißen Substanz werden anhand ihres pathohistologischen Musters in vier verschiedene Gruppen eingeteilt (LASSMANN et al., 2001): Gruppe I
(pattern I) beschreibt eine Makrophagen-assoziierte Demyelinisierung, bei der überwiegend toxische Metabolite von Makrophagen, wie Tumornekrosefaktor (TNF) und reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) zu einer Zerstörung von Myelin führen. Entsprechende Läsionen sind überwiegend perivenös lokalisiert und bestehen aus T-Zellen, Makrophagen und aktivierten Mikroglia (GRIOT et al., 1990). Gleichartige Veränderungen finden sich auch bei antikörpervermittelten Läsionen der Gruppe II (pattern II). Allerdings weisen diese Läsionen zusätzlich eine Ablagerung von Immunglobulinen und aktivierten Komplementfaktoren auf, sodass eine komplementvermittelte Lyse des durch Antikörper markierten Myelins stattfindet.
Bei Gruppe III (pattern III) handelt es sich um eine ischämisch-induzierte, distale Oligodendrogliopathie in Folge einer T-Zell-vermittelten Vaskulitis kleinerer Blutgefäße der weißen Substanz. Gruppe IV (pattern IV) beschreibt eine seltene primäre Schädigung von Oligodendrozyten mit sekundärer Demyelinisierung. Dieses Muster tritt nur bei der primär progressiven Verlaufsform der MS auf und weist histologisch eine massive, periläsionale, saumförmige Degeneration von Oligodendrozyten auf. Ursächlich liegt wahrscheinlich eine metabolische Störung oder ein genetischer Defekt der Oligodendrozyten zu Grunde. Auf die Schädigung der Myelinscheiden folgt eine Schädigung der Axone. Diese erfolgt einerseits direkt durch toxische Metabolite von Makrophagen und zytotoxischen T-Zellen und andererseits indirekt durch eine fehlende trophische Versorgung ausgehend von den geschädigten Oligodendrozyten (LUCCHINETTI et al., 2000; LASSMANN et al., 2001).
2.2 Tiermodelle der Multiplen Sklerose
Da die MS nur beim Menschen auftritt und es sich um ein sehr variables und vielschichtiges Krankheitsgeschehen handelt, werden in der Forschung zahlreiche Tiermodelle genutzt, um die unterschiedlichen Aspekte der Erkrankung zu untersuchen. Grundsätzlich werden autoimmun-mediierte, genetische und toxisch
Literaturübersicht 6
bedingte sowie viral-induzierte Modelle unterschieden (RANSOHOFF et al., 2012).
Bei der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) handelt es sich um das am häufigsten verwendete Tiermodell der MS (CONSTANTINESCU et al., 2011). Durch Injektion von myelinspezifischen Proteinen, wie beispielsweise Basischem Myelinprotein (myelin basic protein, MBP), Myelin-Proteolipid-Protein (PLP) oder Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG) wird eine Autoimmunreaktion induziert, die gegen körpereigenes Myelin gerichtet ist. Alternativ kann die EAE auch durch einen adoptiven Transfer von CD4+ oder CD8+ enzephalitogenen T-Zellen ausgelöst werden (CONSTANTINESCU et al., 2011;
HUSEBY et al., 2001). Histologisch ähneln die Läsionen denen der MS (WAKSMAN und ADAMS, 1962; CONSTANTINESCU et al., 2011). Allerdings entwickeln C57BL/6-Mäuse nach Injektion des Antigens bei der „klassischen Form“ der EAE einen akuten Krankheitsverlauf ohne wiederkehrende Schübe und die Erkrankung betrifft im Gegensatz zur MS vor allem die subpialen Bereiche der weißen Substanz des Rückenmarks. Darüber hinaus handelt es sich bei der EAE überwiegend um eine CD4+-T-Zellantwort während in MS-Plaques CD8+-T-Zellen dominieren (BABBE et al., 2000; RANSOHOFF et al., 2012). Neben der „klassischen Form“ der EAE gibt es allerdings auch schubförmig (relapsing-remitting EAE) bzw. chronisch verlaufende Manifestationsformen, die den rezidivierenden Charakter der MS präziser wiederspiegeln (BERARD et al., 2010). Warum die Administration desselben Antigens im gleichen Mausstamm aber z.T. unterschiedliche Formen der EAE hervorruft, ist weitestgehend unklar. Vermutlich spielen in der Pathogenese der schwereren, schubförmigen und chronischen Verlaufsformen neben einer Dominanz von CD8+-T-Zellen auch erhöhte Expressionen von proinflammatorischen Zytokinen wie z.B. Interferon-γ, (INF-γ), TNF, IL-1α und chemokine (C-X-C motif) ligand (CXCL)-9 eine Rolle (BERARD et al., 2010).
Bei den genetischen Tiermodellen handelt es sich überwiegend um „knockout“- Mutanten, wie beispielsweise MBP-deletierte „shiverer“-Mäuse oder PLP-deletierte
„rumshaker“-Mäuse (EDGAR et al., 2004; ROUSSARIE et al., 2007). Eines der meistverwendeten Modelle zur Erzeugung toxischer Demyelinisierung nutzt den Kupfer-Chelator Cuprizon. Cuprizon verursacht nach mehrwöchiger Fütterung bei
Mäusen eine Dysfunktion des mitochondrialen Komplex IV, die mit einer selektiven Toxizität gegenüber Oligodendrozyten einhergeht und Apoptosen im Corpus callosum und im Hippocampus und Cerebellum auslöst (HOFFMANN et al., 2008;
SKRIPULETZ et al., 2010). Neben der Demyelinisierung weisen toxisch-induzierte Läsionen bereits kurz nach Wegfall des toxischen Agens eine charakteristische Remyelinisierung auf (MATSUSHIMA und MORELL, 2001; HERDER et al., 2011;
SKRIPULETZ et al., 2011). Ein gleichartiges Nebeneinander von Schädigung und Reparatur findet sich auch in den Läsionen der MS. Allerdings löst der toxische Insult durch Cuprizon im Vergleich zur MS keine andauernde Immunantwort aus (RANSOHOFF et al., 2012). Die wichtigsten viral-induzierten Modelle der MS sind die TME und das Maus-Hepatitis-Virus (MHV). Während TMEV nach intrazerebraler Infektion von SJL-Mäusen im ZNS persistiert, wird MHV in immunkompetenten Wirten innerhalb von zwei Wochen nach der Infektion eliminiert (MARTEN et al., 2001; BERGMANN et al., 2006). Dennoch setzt als Spätfolge der MHV-Infektion eine fortlaufende Demyelinisierung ohne Nachweis des Pathogens ein (BERGMANN et al., 2006).
2.3 Das Theiler´sche murine Enzephalomyelitisvirus
Das TMEV wurde 1937 von dem gleichnamigen Mikrobiologen Max Theiler entdeckt (THEILER, 1937). Es gehört zur Familie der Picornaviridae und dem Genus Cardiovirus (PEVEAR et al., 1987). Nach experimenteller, intrazerebraler Infektion verursachen die hochvirulenten Stämme, wie beispielsweise der GDVII- und der FA- Stamm, eine in der Regel fatal verlaufende Polioenzephalitis. Empfängliche SJL- Mäuse, die mit dem niedrig virulenten BeAn-Stamm infiziert werden, entwickeln hingegen einen biphasischen Krankheitsverlauf mit akuter Polioenzephalitis und chronisch-demyelinisierender Leukoenzephalomyelitis, die nach etwa 30-40 Tagen einsetzt (LIPTON, 1975; FU et al., 1990; OLESZAK et al., 2004).
Literaturübersicht 8
Histologisch liegt in der Frühphase der Erkrankung überwiegend eine transiente Infiltration der grauen Substanz und der Meningen durch Makrophagen, Plasmazellen sowie CD4+- und CD8+-T-Zellen vor. Perivaskuläre Entzündungszellinfiltrate sind hauptsächlich in Hippocampus, Hypothalamus, Thalamus, Hirnstamm, Basalganglien und den Vorderhörnern des Rückenmarks nachweisbar (OLITSKY und SCHLESINGER, 1941; STROOP et al., 1981;
RODRIGUEZ et al., 1987; OLESZAK et al., 1995; ZOECKLEIN et al., 2003;
KUMMERFELD et al., 2012). Das Virus infiziert initial überwiegend Neuronen, breitet sich später aber auch über Astrozyten, Oligodendrozyten, Gliavorläuferzellen und Mikroglia/Makrophagen aus (WROBLEWSKA et al., 1979; BRAHIC et al., 1981;
O`SHEA et al., 1997). Nach einmaliger Infektion persistiert das TMEV des BeAn- Stammes bei SJL-Mäusen lebenslang in Mikroglia/Makrophagen, Oligodendrozyten und Astrozyten (CLATCH et al., 1990; LIPTON et al., 1995; QI und DAL CANTO, 1996; ZHENG et al., 2001; PRINGPROA et al., 2010; KUMMERFELD et al., 2012).
Resistente Stämme, wie C57BL/6-Mäuse oder einige BALB/c-Substämme entwickeln hingegen lediglich eine akute Polioenzephalitis und keine Demyelinisierung. Sie eliminieren das Virus bereits in der Frühphase der Infektion (LIPTON und DAL CANTO, 1979). Während die Erkrankung bei SJL-Mäusen initial häufig klinisch inapparent verläuft, zeigen die Tiere in der Spätphase der Erkrankung reduzierte spontane Aktivität, progressive Ataxie und spastische Paresen (THEILER 1937;
ULRICH et al., 2006; GERHAUSER et al., 2007). Histologisch liegt ab etwa 30 Tagen nach der Infektion eine progressive Demyelinisierung mit Nachweis von Myelinophagen und Sphäroiden im Rückenmark vor (MCGAVERN et al., 1999).
Diese werden, wie bereits in der Frühphase der Erkrankung, von überwiegend perivaskulär lokalisierten Entzündungszellinfiltraten begleitet (LIPTON und JELACHICH, 1997). Obwohl das gesamte Rückenmark betroffen ist, etablieren sich die stärksten Läsionen in den ventralen und lateralen Funiculi der thorakalen Rückenmarkssegmente. Die dorsalen Segmente sind nur sporadisch und weniger stark betroffen (RODRIGUEZ et al., 1996; URE und RODRIGUEZ, 2002; ULRICH et al., 2010).
Im Vergleich zu Infektionen mit dem BeAn-Stamm rufen Infektionen mit dem ebenfalls niedrig virulenten DA-Stamm eine stärkere Demyelinisierung hervor. Im Rückenmark liegt außerdem mehr virale RNS und virales Antigen vor. Die in der Spätphase der Erkrankung auftretenden, funktionalen Defizite sind stärker ausgeprägt, treten jedoch auch später auf als nach Infektion mit dem BeAn-Stamm (NJENGA et al., 1999; ZOECKLEIN et al., 2003).
Pathogenetisch tragen vermutlich verschiedene Faktoren zur Etablierung der demyelinisierenden Erkrankung bei. Neben der direkten Phagozytose von Myelin und der primären Schädigung von Oligodendrozyten spielt auch Exzitotoxizität durch Glutamat, sowie die Freisetzung zytotoxischer Faktoren eine Rolle (LANGRISH et al., 2005; DOCAGNE et al., 2007). In erster Linie handelt es sich hierbei um Proteasen, Zytokine, Komplementfaktoren, Stickstoffmonoxid (NO) und ROS (LANGRISH et al., 2005). Insgesamt sind die Mechanismen, die zur Entwicklung der Demyelinisierung beitragen sehr komplex, das Immunsystem spielt aber bei allen Mechanismen eine zentrale Rolle (MECHA et al., 2013).
2.4 Die Immunantwort bei der Theiler´schen murinen Enzephalomyelitis
2.4.1 CD4
+-T-Helferzellen
CD4+-T-Helferzellen kommt in der Pathogenese der akuten und chronischen TME eine zentrale Rolle zu (OLESZAK et al., 2004). Für ihre Aktivierung bindet initial ein Antigen an den T-Zellrezeptor (T-cell receptor, TCR), welches über Haupthistokompatibilitätskomplexe (MHC, Major Histocompatibility Complex) der Klasse II präsentiert wird. Wenn gleichzeitig eine Kostimulation über CD28-CD80 bzw. CD28-CD86 erfolgt, setzt eine Aktivierung der CD4+-T-Helferzellen ein. Die T-
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Zell-Aktivierung ist schematisch in Abbildung 2-1 dargestellt (TIZARD, 2013;
MCGAVIN und ZACHARY, 2007).
Abbildung 2-1: Aktivierung von CD4+ T-Lymphozyten.
Die Aktivierung erfolgt in zwei Schritten: Initial bindet der TCR das Antigen, das über einen MHC- Klasse-II-Komplex von der APC präsentiert wird (Signal 1), dann erfolgt eine Kostimulation durch Bindung von CD80 bzw. CD86 an CD28 (Signal 2).
APC = antigenpräsentierende Zelle (antigen presenting cell), CD = Cluster of Differentiation, MHC- Klasse-II-Komplex = Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex) der Klasse II, TCR = T-Zell-Rezeptor (T cell receptor complex).
Modifiziert nach SNYDER, 2007.
In Abhängigkeit vom Zytokin-Milieu entwickeln sich CD4+-T-Helferzellen zu Th1-, Th2- oder Th17-Zellen (MOSMANN und COFFMAN, 1989; TIZARD, 2013; SCHMITT und UENO, 2015). Eine Differenzierung zu Th1-Zellen erfolgt unter Einfluss von Interleukin (IL)-12, welches überwiegend von Antigen-präsentierenden Zellen (APC, antigen presenting cells) wie Makrophagen, dendritischen Zellen und B-Zellen gebildet wird. Nach Aktivierung über den Transkriptionsfaktor T-bet produzieren Th1- Zellen überwiegend IL-2, Interferon-γ (βγ) und Lymphotoxin-α (syn.
Tumornekrosefaktor-β). Th1-Zellen führen somit zur Aktivierung von T-Zellen, B- Zellen, natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und Makrophagen sowie zur Produktion von Immunglobulin (Ig) G durch Plasmazellen (SCHMITT und UENO, 2015). Sie lösen eine primär gegen intrazelluläre Organismen gerichtete Immunantwort aus und verursachen eine Hypersensitivitätsreaktion vom verzögerten Typ (Typ-IV- Allergie, TIZARD, 2013).
Im Gegensatz hierzu benötigen Th2-Zellen für ihre Aktivierung IL-4 aus Makrophagen und dendritischen Zellen sowie eine Kostimulation durch CD86. Sie synthetisieren hauptsächlich IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13 und stimulieren die Proliferation von B-Zellen sowie die Sekretion von Ig G, Ig A und Ig E (SCHMITT und UENO, 2015). Außerdem wird über die Expression von IL-10 die Funktion von Makrophagen gehemmt und die Ausbildung einer Th1-Immunantwort unterdrückt.
Die Th2-Immunantwort ist mit einer verstärkten Immunreaktion gegenüber extrazellulären Pathogenen vergesellschaftet, führt aber zu einer insuffizienten Immunität bei viralen Infektionen (TIZARD, 2013). Eine Übersicht über die verschiedenen Zytokine, die an der Aktivierung von Th1- und Th2-Zellen sowie an der Kreuzregulation der Th1/Th2-Immunität beteiligt sind, ist in Abbildung 2-2 dargestellt.
Literaturübersicht 12
Abbildung 2-2: Kreuzregulation der Th1/Th2-Immunität.
Während Th1-Zellen überwiegend durch IL-12 aktiviert werden und die zellmediierte Immunität stärken indem sie Makrophagen und CD8+ zytotoxische T-Zellen aktivieren, werden Th2-Zellen durch IL-4 aktiviert und fördern die Entwicklung einer humoralen Immunität. Sie sezernieren vor allem Zytokine, die das Wachstum und die Differenzierung von B-Zellen, Mastzellen und eosinophilen Granulozyten fördern. Darüber hinaus wird über IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-12 und IL-13 eine Kreuzregulation der beiden Signalwege vermittelt, sodass eine inverse Beziehung zwischen der zellmediierten und humoralen Immunantwort besteht.
IL = Interleukin, IFN-γ = Interferon-γ, Th1-Zellen = T-Helfer-Zellen der Subgruppe 1, Th2-Zellen = T- Helfer-Zellen der Subgruppe 2, Treg = regulatorische T-Zellen, CD = Cluster of Differentiation.
Modifiziert nach SNYDER, 2007.
Th17-Zellen werden durch IL-23, IL-6, IL-21 und den transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β) initiiert und haben zwei Hauptfunktionen: Einerseits unterstützen sie die Funktion von B-Zellen und wirken anderseits proinflammatorisch indem sie die Proliferation von Granulozyten fördern, Makrophagen rekrutieren und deren Überlebenszeit verlängern. Sie sezernieren IL-22 sowie IL-17A und -F und fördern somit eine gegen extrazelluläre Erreger gerichtete Immunantwort (GAFFEN, 2009; TIZARD, 2013). Im Gegensatz zu Th1-Zellen begünstigen Th17-Zellen die Entstehung einer viralen Persistenz bei der TME, da sie das Überleben virusinfizierter Zellen begünstigen (HOU et al., 2009).
In der Frühphase der TMEV-Infektion wird virales Antigen durch APC prozessiert und CD4+-T-Zellen präsentiert. Nach Freisetzung proinflammatorischer Zytokine migrieren Makrophagen und Monozyten in das ZNS. Ihre Infiltration geht mit einer Schädigung und dem Abbau von Myelin einher und resultiert schließlich in der Freisetzung von Myelinbestandteilen und der Etablierung einer anti-Myelin- spezifischen CD4+-T-Zellpopulation (Th1-vermittelte Immunantwort; OLSON und MILLER, 2004). Entsprechend resultiert eine intravenöse Applikation von anti-CD4- Antikörpern während der chronischen Phase der Infektion in einer verminderten Demyelinisierung und einer geringeren Anzahl an schweren Krankheitsverläufen (WELSH et al., 1987; MURRAY et al., 1998). Die Infektion CD4-deletierter SJL- Mäuse führt hingegen zu einer Steigerung der Demyelinisierung, da virales Antigen in der Frühphase der Infektion nur unzureichend eliminiert wird (MURRAY et al., 1998). In gleicher Weise entwickeln C57BL/6-Mäuse mit einer Deletion des Aβ-Gens des MHC-Klasse-II-Komplexes eine Viruspersistenz mit konsekutiver Demyelinisierung. Gleichzeitig weisen sie auch niedrigere anti-TMEV-Immunglobulin (Ig)G-Spiegel als immunkompetente C57BL/6-Mäuse auf. Eine schwache CD4- Antwort mit einem Mangel an neutralisierenden Antikörpern führt bei diesen Tieren zu einer verringerten Viruselimination und Etablierung einer persistenten Infektion (NJENGA et al., 1996).
Wenngleich also in der Frühphase der TME eine Spezifität infiltrierender T-Zellen gegen das TMEV-Epitop VP270-86 besteht und die Viruslast effektiv vermindert wird, entwickelt sich in der chronischen Phase der Infektion eine gegen autologe Myelinepitope gerichtete Autoimmunität mit konsekutiver Demyelinisierung (GERETY et al., 1994; KATZ-LEVY et al., 2000; KANG et al., 2002; MCMAHON et al., 2005).
Überwiegend besteht hierbei vermutlich eine Autoreaktivität gegen MBP139-151, hervorgerufen durch eine de novo Aktivierung (priming) autoreaktiver T-Zellen gegenüber Myelinautoepitopen, die im Zuge der T-Zell-mediierten Demyelinisierung freigesetzt wurden (epitope spreading; Th2-vermittelte Immunantwort; OLSON und MILLER, 2004; CHASTAIN und MILLER, 2012). Da keine Kreuzreaktivität zwischen den immundominanten TMEV-Epitopen und denen der Myelinproteine PLP, MBP
Literaturübersicht 14
und MOG besteht, scheint Molekulares Mimikry bei der TME lediglich eine untergeordnete Rolle zu spielen (MILLER et al., 1997).
2.4.2 CD8
+-zytotoxische T-Zellen
Neben CD4+-T-Zellen spielen auch CD8+-T-Zellen eine Rolle in der Früh- und Spätphase der TME (OLESZAK et al., 2004). Für eine vollständige Aktivierung von CD8+-zytotoxischen T-Zellen ist neben einem an MHC-Klasse-I-Komplexe gebundenem Antigen eine Kostimulation durch CD4+-Th1-Zellen erforderlich. Die aktivierten, zytotoxischen T-Zellen führen dann durch die Freisetzung zytotoxischer Proteine zur Apoptose von virusinfizierten Zellen (JANEWAY et al., 2001; TIZARD, 2013).
Allerdings ist diese Immunantwort bei SJL-Mäusen im Gegensatz zu C57BL/6- Mäusen nicht ausreichend um das TMEV vollständig zu eliminieren (LIPTON und DAL CANTO, 1979). Entsprechend führt eine experimentelle Infektion von CD8+-T- Zell-Knock-out (KO)-Mäusen auf einem C57BL/6-Hintergrund zu einer TMEV- Persistenz und Etablierung einer demyelinisierenden Erkrankung (MURRAY et al., 1998; OLESZAK et al., 2004). Während sich eine starke T-Zellantwort mit konsekutiver, antiviraler Immunität positiv auf den frühen Krankheitsverlauf auswirkt, führt eine intraperitoneale Applikation von anti-CD8-Antikörpern zum Zeitpunkt der beginnenden Demyelinisierung nach Infektion mit dem BeAn-Stamm zu einem reduzierten Myelinabbau und einem günstigeren Krankheitsverlauf (RODRIGUEZ und SRIRAM, 1988). Entsprechend wiesen TSUNODA et al. (2006) das Vorliegen autoreaktiver TMEV-spezifischer CD8+-T-Zellen bei SJL-Mäusen nach. Nach Übertragung (adoptiver Transfer) dieser Zellen in nicht-infizierte Tiere, entwickelten diese ebenfalls eine Meningitis und perivaskuläre Infiltrate im ZNS (LIBBEY et al., 2012). Allerdings ergab ein Vergleich der CD8+-T-Zellantwort von SJL- und C57BL/6- Mäusen nach TMEV-Infektion zwar einige quantitative, jedoch keine qualitativen Unterschiede: Während C57BL/6-Mäuse initial größere Mengen an virus- spezifischen CD8+-T-Zellen aufweisen, reduziert sich ihre Anzahl im Verlauf der
Infektion derart stark, dass SJL-Mäuse im späteren Krankheitsverlauf höhere CD8+- T-Zell-Spiegel als C57BL/6-Mäuse zeigen (LYMAN et al., 2004). Da beide Stämme im Verlauf der Infektion aber gleiche Mengen proinflammatorischer Zytokine (TNF, IFN-γ) exprimieren und sich die zytolytische Funktion der CD8+-T-Zellen zwischen C57BL/6- und SJL-Mäusen nicht unterscheidet, sind die unterschiedlichen Krankheitsverläufe bei diesen beiden Stämmen vermutlich nicht ausschließlich auf die CD8+-T-Zellpopulation zurückzuführen (LYMAN et al., 2004; MECHA et al., 2013).
CD8+-T-Zellen spielen außerdem eine Rolle für den sogenannten, immunologischen Erschöpfungszustand (T cell exhaustion). Bei vielen viralen Erkrankungen mit einem chronischen Verlauf, wie beispielsweise LCMV-, HIV- oder murinen Coronavirus- Infektionen, etabliert sich im Krankheitsverlauf eine Erschöpfung der virusspezifischen CD8-T-Zellantwort (MOSKOPHIDIS et al., 1993; BERGMANN et al., 1999; OXENIUS et al., 2002; FREBEL et al., 2010). Dieser Zustand manifestiert sich durch eine nachlassende oder fehlende Expression bestimmter, proinflammatorischer Zytokine (z.B. IL-2 > TNF > IFN-γ) sowie einen Verlust des proliferativen Potentials und einen deutlichen oder vollständigen Rückgang der virusspezifischen CD8+-T-Zellpopulation. Zusätzlich scheinen aber auch CD4+-T- Zellen in ihrer Funktion beeinträchtigt zu werden (MOSKOPHIDIS et al., 1993;
FULLER et al., 2004; WHERRY et al., 2004; FREBEL et al., 2010).
Die vorherrschenden Mechanismen dieser immunologischen Erschöpfung sind bisher nur teilweise bekannt, wahrscheinlich liegt ihnen aber eine multifaktorielle Genese zu Grunde. Neben der Expression von IL-10 und TGF-β sowie hohen Antigenspiegeln, spielt auch die Expression inhibitorischer Moleküle, wie PD-1 (programmed cell death 1), LAG-3 (lymphocyte-activation gene 3) und TIM-3 (T cell immunoglobulin and mucin protein 3) auf T-Zellen eine Rolle für die Reduktion der Immunantwort (MATTER et al., 2006; JONES et al., 2008; BLACKBURN et al., 2009;
FREBEL et al., 2010). Beispielsweise führt die Bindung von PD-1 an seine Liganden PDL (programmed cell death ligand)-1 und PDL-2 zu einer verminderten T-Zell- Aktivierung. Einerseits fördert PD-1 auf diesem Wege die Selbsttoleranz und beugt
Literaturübersicht 16
Autoimmunkrankheiten vor, vermindert andererseits aber gleichzeitig die Etablierung einer effektiven, antiviralen Immunität (NISHIMURA et al., 2001; IWAI et al., 2003;
KEIR et al., 2008). Inwieweit im Verlauf der TME eine Funktionsstörung von zytotoxischen T-Zellen auftritt, bzw. welchen Einfluß ein immunologischer Erschöpfungszustand auf den Krankheitsverlauf hat, ist bislang noch überwiegend unklar (KANEYAMA et al., 2014; TAKIZAWA et al., 2014). Allerdings wiesen TAKIZAWA et al. (2014) eine erhöhte Expression von PD-1- und PDL-1-spezifischer mRNS im Rückenmark von TMEV infizierten Mäusen nach. Die Gabe von anti-PD-1- spezifischen Antikörpern resultiert in einer klinischen und histologischen Exazerbation der demyelinisierenden Erkrankung, sodass diesen inhibitorischen Molekülen vermutlich eine wichtige Rolle in der TME zukommt.
2.4.3 Regulatorische T-Zellen
Auch regulatorische T-Zellen (Treg) spielen vermutlich eine wichtige Rolle in der Pathogenese der TME, da sie die Etablierung und Aufrechterhaltung von Toleranz und Immunität steuern (RICHARDS et al., 2011). Die Aktivierung von Treg- Vorläuferzellen durch Antigene und ihre Kostimulation über IL-2 und TGF-β induziert die Expression des Transkriptionsfaktors forkhead box protein P3 (FoxP3; LI und ZHENG, 2015). Sie erfolgt überwiegend im Darm, sowie zu einem kleineren Anteil in sekundären lymphatischen Organen. Treg sezernieren IL-10, IL-35 und TGF-β und hemmen die Funktion von T-Zellen und Makrophagen (TIZZARD, 2013). Nach TMEV-Infektion entwickeln SJL-, aber nicht C57BL/6-Mäuse eine schnelle Treg- Expansion mit erhöhter Expression von IL-10 im Gehirn. Durch die Expansion ergibt sich ein ungünstiges Verhältnis von Treg zu Effektor-T-Zellen, welches einen nachteiligen Effekt auf die antivirale Immunität zu haben scheint (RICHARDS et al., 2011; HERDER et al., 2012). Dementsprechend resultiert die funktionelle Inaktivierung von Treg mittels anti-CD25-Antikörpern in einer gesteigerten CD4- und CD8-dominierten, antiviralen Immunität sowie einem milderen Krankheitsverlauf und einer geringeren Virusmenge im ZNS (RICHARDS et al., 2011). Ein adoptiver Transfer von ex vivo generierten, induzierten Treg (iTreg) in der Frühphase der
Infektion resultiert hingegen folglich in einer Exazerbation der Erkrankung mit Nachweis erhöhter Virustiter (MARTINEZ et al., 2014). Interessanterweise führt eine Übertragung der gleichen iTreg in der chronischen Phase der TME nach Beginn der Demyelinisierung aber zu einer Verringerung des Schweregrades der chronisch- demyelinisierenden Erkrankung (MARTINEZ et al., 2014).
Während Treg also vermutlich eine zentrale Funktion in der TME von SJL-Mäusen erfüllen, scheinen sie hingegen im Krankheitsverlauf von C57BL/6-Mäusen nur eine untergeordnete Rolle zu spielen. Eine Treg-Depletion verursacht zwar einen transienten Anstieg von Th1- und CD8+-Zellen, reduziert aber nicht die Virusmenge im ZNS von TMEV-infizierten C57BL/6-Mäusen (PRAJEETH et al., 2014).
2.4.4 B-Zellen / Plasmazellen
Eine Aktivierung von B-Zellen erfolgt überwiegend durch IL-4, IL-5, IL-6 und IL-13, welche von Th2-Zellen sezerniert werden. Während IL-4 und IL-13 das Wachstum und die Differenzierung von B-Zellen stimulieren, den Wechsel der Immunglobulinklasse fördern und die Expression von MHC-Klasse-II-Molekülen und Fc-Rezeptoren induzieren, initiiert IL-5 hauptsächlich die Differenzierung aktivierter B-Zellen zu Plasmazellen und stimuliert die Produktion von Immunglobulinen (TIZARD, 2013). Für ihre vollständige Aktivierung ist außerdem eine Kostimulation durch T-Helferzellen (CD40-CD154) und Komplement (CD21-CD19) erforderlich (BANCHEREAU, 2015). Während T-Zellen lediglich bereits prozessiertes Antigen erkennen, sind B-Zellen auch fähig, natives Antigen zu binden und einer T-Zelle zu präsentieren, um anschließend eine Kostimulation zu erhalten (OBINO und LENNON-DUMÉNIL, 2014). Es erfolgt eine Differenzierung zu Antikörper- produzierenden Plasmazellen und Gedächtniszellen. Um Autoimmunität zu vermeiden, erfahren B-Zellen einen zweistufigen Selektionsprozess, der jene Zellen die Autoantigene binden in die Apoptose leitet (TIZZARD, 2013).
Literaturübersicht 18
Obwohl autoimmunen B-Zellen in der Pathogenese der MS inzwischen eine Schlüsselrolle zugesprochen wird, ist über die Bedeutung von B-Zellen und Plasmazellen bei der TME bisher nur wenig bekannt (DISANTO et al., 2012). Mittels Genexpressionsanalysen wurde allerdings bereits gezeigt, dass viele der Gene, die im Verlauf der TME aufreguliert werden, mit der humoralen Immunantwort im Zusammenhang stehen (NAVARETTE-TALLONI et al., 2010; ULRICH et al., 2010).
Außerdem weisen SJL-Mäuse in der chronischen Phase der TME, drei bis vier Monate nach Infektion, eine Infiltration CD138+ Plasmazellen/Plasmablasten und hohe IgG-Spiegel im Liquor cerebrospinalis bei intakter Blut-Hirn-Schranke (blood- brain barrier, BBB) auf. Dies deutet darauf hin, dass sich im Verlauf der Erkrankung eine ortsständige Plasmazellpopulation etabliert, deren Bedeutung für den Krankheitsverlauf der TME noch weitestgehend unklar ist (PACHNER et al., 2011).
Auch bei der MS entwickeln sich im chronischen Stadium der Erkrankung ektopische Lymphfollikel mit B-Zellreifung und Plasmazelldifferenzierung in den Meningen (MEINL et al., 2006).
2.4.5 Antigenpräsentierende Zellen
Zu den antigenpräsentierenden Zellen (APC) im ZNS gehören vor allem Mikroglia und Makrophagen. Ob und inwieweit Astrozyten an der Präsentation von Antigenen beteiligt sind, wird in der Literatur kontrovers diskutiert (WEBER et al., 1994; DONG und BENVENISTE, 2001; CONSTANTINESCU et al., 2005). APC erfüllen im ZNS vielfältige Aufgaben: Neben der Präsentation von Antigen zur Aktivierung von T- und B-Zellen determinieren sie durch Zytokinsekretion die Differenzierung von CD4+-T- Zellen zu Th1-, Th2- und Th17-Zellen und modulieren die Etablierung, Aufrechterhaltung und den Verlauf von Entzündungen (ZHU und PAUL, 2010).
Aktivierte Mikroglia spielen auch eine große Rolle in der Pathogenese der MS und der TME. Bei der MS sind Mikroglia überwiegend in den Läsionen der weißen Substanz lokalisiert, phagozytieren Myelinfragmente, aktivieren CD4+-T-Zellen und exprimieren MHC-Klasse-II-Moleküle und deren Kostimulatoren (ALOISI et al., 2000).
Bei der TME entwickeln infizierte SJL-Mäuse eine lebenslange Persistenz des Virus in Mikroglia/Makrophagen (LIPTON et al., 1995) und Astrozyten (ZHENG et al., 2001), wodurch diesen Zellpopulationen eine besondere Bedeutung in der Pathogenese der Erkrankung zukommt. Eine Aktivierung durch TMEV-Antigen führt zu einer erhöhten Expression von myelinotoxischen Faktoren, wie z.B. TNF, IL-6, IL- 1β, IL-12β und induzierbarer Stickstoffmonoxid-Synthase (inducible nitric oxide synthase, iNOS; DALPKE et al., 2002; OLSON und MILLER, 2004, MECHA et al., 2013), wodurch ein Milieu entsteht, das die Schädigung des ZNS begünstigt (bystander demyelination; CHASTAIN et al., 2011). Neben Zytokinen exprimieren Mikroglia/Makrophagen nach Stimulation durch TMEV-Antigen auch Chemokine, wie zum Beispiel chemokine (C-C motif) ligands (CCL)-2, CCL-3, CCL-4 und CXCL-3 (EBERT et al., 2005) sowie CCL-5 und CXCL-10 (HERDER et al., 2015). Für die TME wurde bereits gezeigt, dass CCL-5 und CXCL-10 die Infiltration von Leukozyten in das ZNS regulieren und die antivirale Immunität beeinflussen (RANSOHOFF et al., 2002; MI et al., 2004; HERDER et al., 2015; RUBIO et al., 2014). Im Gegensatz zum Serum von Balb/C-Mäusen enthielt jenes von TMEV-infizierten SJL-Mäusen beispielsweise hohe Mengen an biologisch aktivem CXCL-10 zum Zeitpunkt des Einsetzens der klinischen Erkrankung (RUBIO et al., 2014). Eine Aufregulation von CCL-5 und CXCL-10 liegt außerdem auch bei der EAE und der MS vor (SORENSEN et al., 1999; ELHOFY et al., 2002). Die Depletion von CCL-2 bei C57BL/6-Mäusen mit EAE resultiert in einem milderen Krankheitsverlauf mit weniger Demyelinisierung und einer geringeren Anzahl an iNOS- und TNF-produzierenden dendritischen Zellen und Makrophagen (DOGAN et al., 2008). Ob CCL-2 eine ähnliche Funktion im Verlauf der TME erfüllt ist weitestgehend unklar.
Jedoch hat die Aktivierung von Mikroglia/Makrophagen im Verlauf der Demyelinisierung nicht nur nachteilige Effekte. Nach lokaler Applikation von Ethidiumbromid begünstigt die Phagozytose von Myelinfragmenten durch Mikroglia/Makrophagen das Einsetzen der nachfolgenden Remyelinisierung (KOTTER et al., 2006). Pathogenetisch liegt wahrscheinlich eine Hemmung der Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen durch Myelin zu Grunde (KOTTER et al., 2006). Allerdings führt auch die Applikation von nichtspezifischen
Literaturübersicht 20
Membranbestandteilen zu einer geringeren, aber signifikanten Hemmung der Remyelinisierung, weshalb möglicherweise neben Myelin auch andere Zellbestandteile inhibitorisch auf die Remyelinisierung im ZNS wirken könnten (ROBINSON et al., 1999; KOTTER et al., 2006). Analog zu ihrer dualen Funktion in der Pathogenese der Demyelinisierung kann eine Einteilung der Mikroglia/Makrophagen-Population in zwei Gruppen erfolgen (CHASTAIN et al., 2011): Während klassisch-aktivierte, proinflammatorische M1-Makrophagen die Entzündung verstärken und die protektive Immunität fördern, terminieren alternativ- aktivierte M2-Makrophagen die Entzündung, phagozytieren zellulären Debris und unterstützten die Gewebsheilung (PINTEAUX-JONES et al., 2008; LASKIN, 2009;
CHASTAIN et al., 2011; MARTINEZ und GORDON, 2014; PRAJEETH et al., 2014).
Zu Beginn der chronisch-demyelinisierenden Erkrankung zeigen TMEV-infizierte SJL-Mäuse eine erhöhte Expression von CD16+ CD32+ M1-Makrophagen und eine Aufregulation der korrespondierenden Gene im Rückenmark. In der chronischen Phase der TME entwickelt sich eine zunehmende M2-Prägung bei erhaltener M1- Polarisation. Möglicherweise begünstigt eine Imbalance der Makrophagenpolarisierung mit Dominanz von M1-Zellen die Entwicklung chronischer Rückenmarksläsionen in TMEV-infizierten SJL-Mäusen (HERDER et al., 2015).
2.5 Zytokine bei der Theiler´schen murinen Enzephalomyelitis
Ähnlich wie bei anderen viralen Infektionen mit chronischem Verlauf scheint die Orchestrierung der frühen Immunantwort auch bei der TME einen entscheidenden Einfluss auf die Elimination oder Persistenz des Virus zu haben. In der Frühphase der Infektion weisen sowohl SJL- als auch C57BL/6-Mäuse eine starke Expression proinflammatorischer Zytokine auf. Überwiegend handelt es sich hierbei um IFN-γ, IL-1, IL-6, IL-12p40 und TNF (CHANG et al., 2000). Allerdings exprimieren nur SJL- Mäuse gleichzeitig hohe Mengen an IL-10 mRNS. Diese werden vor allem von T-
Zellen und Makrophagen/Mikroglia gebildet und gehen mit einer vermehrten Infiltration von Foxp3+-Treg und CD45R+-B-Zellen einher (HERDER et al., 2012).
Folglich etabliert sich eine schwächere Entzündungsreaktion mit ungenügender antiviraler Immunantwort (HIMEDA et al., 2010; HERDER et al., 2012).
In der subakuten Phase, acht Tage nach der Infektion, exprimieren SJL-Mäuse hingegen bereits höhere Mengen an TGF-β und TNF als resistente B57BL/6-Mäuse (CHANG et al., 2000). In der Spätphase der Infektion weisen dann nur noch SJL- Mäuse eine proinflammatorische Th1-Zytokinantwort im ZNS auf. Darüber hinaus liegen bei SJL-Mäusen auch gleichzeitig hohe Mengen der antiinflammatorischen Zytokine IL-4, IL-5 und IL-10 vor (CHANG et al., 2000). Da IL-10 auch in vitro zu einer verminderten Expression von IL-12 und IL-23 durch TMEV-infizierte Mikroglia führt, scheint es wie bei der LCMV-, HIV- oder HCV-Infektion auch bei der TME an der Etablierung einer insuffizienten, antiviralen Immunantwort beteiligt zu sein (RIGOPOULOU et al., 2005; BROCKMAN et al., 2009; CORREA et al., 2011;
HERDER et al., 2012; RICHTER et al., 2013).
Jedoch spielen neben IL-10 auch diverse andere Zytokine eine wichtige Rolle in der Pathogenese der TME. Im Gegensatz zu IL-10 ist TNF ein stark proinflammatorisch wirkendes Zytokin. Es gilt als einer der wichtigsten Entzündungsmediatoren und ist in entzündeten Geweben maßgeblich an der Rekrutierung von Lymphozyten beteiligt (PROBERT, 2015). TNF vermittelt die Aufregulation von Adhäsionsmolekülen (z.B.
E-Selektin, Intercellular Adhesion Molecule 1, ICAM-1 und Vascular Cell Adhesion Molecule 1, VCAM-1) und führt zur Vasodilatation durch eine vermehrte Expression des Vasodilators Prostaglandin I2 (PGI2; BRADLEY, 2008). Welche Rolle TNF bei viralen Infektionen im Allgemeinen und der TME im Besonderen zukommt, ist fraglich, da für verschiedene, infektiöse Erkrankungen sowohl neuroprotektive als auch neurodestruktive Effekte beschrieben wurden (SERGERIE et al., 2007;
KIRKMAN et al., 2010). Auf Grund seiner proinflammatorischen Eigenschaften verstärkt TNF die antivirale Immunität in resistenten C57BL/6-Mäusen und vermindert die Gewebsschädigung im Gehirn nach der Infektion mit dem DA-Stamm des TMEV (SERGERIE et al., 2007; EJRNAES et al., 2006). Gleichzeitig wurde in
Literaturübersicht 22
anderen Arbeiten gezeigt, dass TNF die Freisetzung exzitatorischer Neurotransmitter fördert und die Schädigung von Neuronen begünstigt (LIBBEY et al., 2008;
KIRKMAN et al., 2010). Ein Vergleich von SJL- und C57BL/6-Mäusen nach Infektion mit dem DA-Stamm zeigte, dass SJL-Mäuse in der akuten bis subakuten Phase der Infektion erhöhte Mengen an TNF exprimieren (CHANG et al., 2000). TNF spielt somit möglicherweise ebenfalls eine Rolle in der stammspezifischen Pathogenese der TME.
Andere proinflammatorische Zytokine wie IL-6, IFN-α und evtl. auch IFN-γ verursachen bei SJL-Mäusen hingegen eine erhöhte Expression von PD-1 auf infiltrierenden Makrophagen. Diese Aufregulation inhibitorischer Moleküle mindert die Zytolyse durch CD8+-T-Zellen und begünstigt die Etablierung einer viralen Persistenz. Da IL-6 außerdem die Differenzierung zu Th17-Zellen fördert, trägt es vermutlich direkt zur Demyelinisierung bei (JIN et al., 2013). Transgene C57BL/6- Mäuse, die das humane IL-6 exprimieren, entwickeln nach TMEV-Infektion eine chronisch-demyelinisierende Leukoenzephalomyelitis. Diese geht mit einer erhöhten viralen Persistenz und einer vermehrten Differenzierung zu Th17-Zellen einher.
Synergistisch unterstützen IL-6 und IL-17 die Expression von B-cell lymphoma protein 2 (Bcl-2) und B-cell lymphoma-extra large protein (Bcl-xl), die beide den Übergang von virusinfizierten Zellen in die Apoptose verhindern. IL-6 und IL-17 wirken sich somit direkt negativ auf die Elimination virusinfizierter Zellen im ZNS aus (HOU et al., 2014).
Ähnlich wie IL-6 begünstigen auch hohe IL-1-Spiegel die Differenzierung von CD4+ T-Helferzellen zu Th17-Zellen. Eine Depletion von IL-1 führt jedoch ebenfalls zu einer vermehrten Viruspersistenz, da diese eine ungenügende T-Zell-Aktivierung mit verstärkter Expression antiinflammatorischer Zytokine und inhibitorischer Moleküle (PDL-1, TIM-3) zur Folge hat. Eine angemessene Aktivierung der IL-1-Signalkaskade scheint daher für die Protektion vor einer persistenten Infektion mit TMEV unerlässlich zu sein (KIM et al., 2012).
Während bei IL-1 sowohl die Applikation als auch die Depletion mit einer Exazerbation der demyelinisierenden Leukoenzephalomyelitis einhergeht, scheinen
sich erhöhte Mengen an IL-2 günstig auf den Krankheitsverlauf auszuwirken. Die Applikation von IL-2 sezernierenden Tumorzellen verhindert in TMEV-infizierten Dilute Brown Non-Agouti/2 (DBA/2)-Mäusen die Entwicklung einer persistenten Infektion. Diese Beeinflussung des Krankheitsverlaufs geht mit einem drei- bis vierfachen Anstieg zytotoxischer T-Zell-Vorläuferzellen einher. LARSSON-SCIARD et al. (1997) postulieren deshalb, dass zumindest bei DBA/2-Mäusen eine ungenügende Anzahl und Aktivierung von zytotoxischen T-Zell-Vorläuferzellen für die Etablierung der viralen Persistenz von Bedeutung sein könnte. Inwieweit IL-2 eine Rolle für die Viruspersistenz in SJL-Mäusen spielt, ist hingegen weitestgehend unklar.
Zusätzlich scheinen IFN-γ und TGF-β eine wichtige Rolle in der Pathogenese der TME zu spielen (CHANG et al., 2000; MURRAY et al., 2002; RODRIGUEZ et al., 2003). Die Hauptfunktion von IFN-γ besteht in der Aktivierung von Makrophagen und der Initiation der Migration von Leukozyten in das ZNS. Darüber hinaus erfüllt IFN-γ auch direkte antivirale und antiproliferative Effekte und fördert die Expression von TNF und IL-1 (RODRIGUEZ et al., 2003). IFN-γ-defiziente C57BL/6-Mäuse entwickeln nach Infektion mit TMEV eine chronisch-demyelinisierende Leukoenzephalomyelitis mit Persistenz des Virus im ZNS (MURRAY et al., 2002).
Eine Infektion von Mäusen mit gleichartiger Defizienz und einem empfänglichen genetischen Hintergrund führt darüber hinaus zu einer erhöhten Mortalitätsrate und schweren neurologischen Ausfällen, die innerhalb von 16 Tagen nach der Infektion auftreten. Diese sind überwiegend auf eine schwere neuronale Schädigung in der Frühphase der Infektion zurückzuführen. Die Tiere weisen erhöhte Virustiter und eine geringere Expression von CD4+- und CD8+-T-Zellen sowie MHC-Klasse-I- und MHC- Klasse-II-Molekülen auf (RODRIGUEZ et al., 2003). Die Ergebnisse dieser Arbeiten lassen darauf schließen, dass sich IFN-γ positiv auf den Verlauf der TME auswirkt.
Es wird postuliert, dass IFN-γ dem virus-induzierten Untergang von Neuronen entgegenwirkt und somit die neuronalen Schäden bei der TME begrenzt. Diese Hypothese wurde auch dadurch untermauert, dass IFN-γ in vitro das Überleben von Neuronen unterstützt (RODRIGUEZ et al., 2003).
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Hingegen wurde mittels Genexpressionsanalyse gezeigt, dass Gene, die mit der Signalkaskade von IFN-γ korrespondieren während der demyelinisierenden Phase der Erkrankung aufreguliert sind (HERDER et al., 2015). Da IFN-γ eine große Rolle in der M1-Polarisation von Makrophagen spielt, führt die vermehrte Expression zu einer Steigerung der Infiltration und Aktivierung von Makrophagen, wodurch sich eine verstärkte Demyelinisierung in der Spätphase der TME etabliert (MILLER et al., 2001; TSUNODA et al., 2002; ULRICH et al., 2006; KIGERL et al., 2009). Somit scheint sowohl ein Mangel an IFN-γ in der Frühphase der Erkrankung, als auch ein hoher Spiegel während der Demyelinisierung eine Exazerbation des Krankheitsverlaufs zu begünstigen (MILLER et al., 2001; MURRAY et al., 2002;
TSUNODA et al., 2002; ULRICH et al., 2006; KIGERL et al., 2009).
2.6 Interleukin-10
IL-10 wurde erstmals 1989 von MOSMANN et al. beschrieben und ist neben TGF-β und IL-35 eines der stärksten antiinflammatorischen Zytokine mit diversen, pleiotropen Eigenschaften (FIORENTINO et al., 1989; SABAT et al., 2010). Es wird in der Peripherie überwiegend von Monozyten, Makrophagen und T-Helferzellen synthetisiert, kann jedoch in Abhängigkeit von Stimulus, Zeitpunkt und Art des betroffenen Gewebes auch von dendritischen Zellen, B-Zellen, zytotoxischen T- Zellen, Treg, NK-Zellen und Mastzellen sowie von neutrophilen und eosinophilen Granulozyten gebildet werden (MAYNARD et al., 2007; COUPER et al., 2008;
SABAT et al., 2010). Während initial die Auffassung vertreten wurde, dass IL-10 lediglich von Th2-Zellen produziert wird, ist heute bekannt, dass Th1-Zellen ähnlich hohe Mengen an IL-10 bilden (FIORENTINO et al., 1989; DEL PRETE et al., 1993;
JANKOVIV et al., 2007; SARAIVA et al., 2009). Im ZNS wird IL-10 überwiegend von Mikroglia, Astrozyten und Neuronen exprimiert (HULSHOF et al., 2002; LEDEBOER et al., 2002).
Zur Aktivierung der Signalkaskade muss IL-10 in zwei Schritten an den zweiteiligen IL-10-Rezeptor (IL-10R) binden (YOON et al., 2006). Während der IL-10R1 überwiegend von Immunzellen, vor allem von Monozyten und Makrophagen exprimiert wird, ist der IL-10R2 auch ein Anteil anderer Rezeptorkomplexe (z.B. von IL-22, IL-26, IL-28a, IL-28b und IL-29) und wird daher großflächig auf der Membran der meisten körpereigenen Zellen ausgebildet (WOLK et al., 2002; KUNZ et al., 2006; SABAT et al., 2010; ZDANOV, 2010). Zur Aktivierung der IL-10R- Signalkaskade erfolgt initial eine Bindung von IL-10 an die Untereinheit IL-10R1. Eine darauffolgende Konformationsänderung erlaubt im zweiten Schritt die Assoziation des IL-10/IL-10R1-Komplexes mit dem IL-10R2 (YOON et al., 2006). Diese Bindung resultiert in einer Aktivierung der IL-10R1-assoziierten Januskinase Jak1 und der IL- 10R2-assoziierten Januskinase Tyk2, gefolgt von einer Phosphorylierung des IL- 10R1. Nun bindet der Transkriptionsfaktor signal transducer and activator of transcription (STAT) 3 an den phosphorylierten IL-10R1 und wird dadurch selbst phosphoryliert. In Abhängigkeit vom Zelltyp erfolgt in der IL-10-Signalkaskade zum Teil auch eine Phosphorylierung von STAT1- und STAT5-Molekülen. Die phosphorylierten STAT-Moleküle bilden Homo- und Heterodimere, migrieren in den Zellkern, binden an STAT-Bindungselemente und induzieren die Transkription korrespondierender Gene (FINBLOOM et al., 1995; SABAT et al., 2010). Die Interaktion von IL-10 mit seinem Rezeptor ist in Abbildung 2-3 schematisch dargestellt.
Die Aktivierung der IL-10-Signalkaskade hat weitreichende Effekte. Allein in Monozyten werden etwa 1600 Gene aufreguliert und gleichzeitig circa 1300 Gene herunterreguliert (JUNG et al., 2004). IL-10 hemmt beispielsweise die Freisetzung von proinflammatorischen Mediatoren durch Monozyten/Makrophagen. Hierzu zählen unter anderem TNF, IL-1ß, IL-6, IL-8, IL-12, IL-23 sowie der Granulozyten- kolonienstimulierende Faktor (granulocyte colony stimulating factor, G-CSF) und der Granulozyten-Monozyten-kolonienstimulierende Faktor (granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF). Gleichzeitig verstärkt es die Expression antiinflammatorischer Mediatoren, wie die des IL-1-Rezeptor-Antagonisten (IL-1RA) und löslicher TNF-Rezeptoren (FIORENTINO et al., 1994; HART et al., 1996).
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Außerdem hemmt IL-10 die Antigenpräsentation durch eine verminderte Expression von MHC-Klasse-II-Komplexen und ihren Kostimulatoren (z.B. CD86) und verhindert die Etablierung einer Th1- und Th17-Immunantwort durch Hemmung der IL-12- und IL-23-Synthese (DE WAAL MALEFYT et al., 1991; D`ANDREA et al., 1993; CREERY et al., 1996; SCHÜTZE et al., 2005). Darüber hinaus verstärkt IL-10 die Phagozytose durch eine Steigerung der Expression von Oberflächenrezeptoren und hemmt gleichzeitig die Abtötung phagozytierter Mikroorganismen (ROILIDES et al., 1998;
BUCHWALD et al., 1999; SABAT et al., 2010).
Abbildung 2-3: Interaktion von IL-10 mit dem IL-10R-Komplex.
IL-10 bindet an die Untereinheit IL-10R1 und verändert dessen Konformation, sodass eine Bindungsstelle für den IL-10R2 entsteht, der daraufhin über IL-10 an den IL-10R1 bindet. Durch eine Aktivierung und Phosphorylierung von Jak1 und Tyk2 und der konsekutiven Phosphorylierung des IL- 10R1 und der STAT3-Transkriptionsfaktoren bilden sich Homo- und Heterodimere, die im Nukleus an STAT binding elements binden und die Transkription korrespondierender Gene induzieren. Je nach Zelltyp werden zum Teil auch STAT1- und STAT5-Moleküle aktiviert.
Jak1= Janus Kinase 1; Tyk2= Tyrosin Kinase 2; STAT= signal transducer and activator of transcription, P = Phosphorylierung.
Modifiziert nach SABAT et al., 2010.
