Optimierung biologischer Systeme

Optimierung

biologischer Systeme

Christoph Wittmann & Elmar Heinzle

Vorlesung Biotechnologie für Bioinformatiker Juli 2004

Technische Biochemie, Universität des Saarlandes

Einsatz biologischer Systeme in der Biotechnologie

Citrat

EPO

Ethanol

Gewünschtes Produkt Substrat

Biotechnologische Produktion – Idealer Mikroorganismus

möglichst hoher Umsatz des Substrates in das gewünschte Produkt

Anabolismus Unerwünschte

Nebenprodukte

Gewünschtes Produkt Substrat

Unerwünschte Regulation

Optimierung der Zellen

Katabolismus Transport

Biotechnologische Produktion – realer Mikroorganismus

Optimierung biologischer Systeme

Genetischer Bauplan

Eine Vielzahl an Genen codiert für den Phänotyp eines Mikroorganismus

Optimierung durch Änderung des Bauplans (Mutation)

klassische Stamm- optimierung

rationale Stamm- optimierung Optimierung biologischer Systeme

Wildtyp

ungünstige Eigenschaften

Produktionsstamm günstige Eigenschaften

Klassische Stammoptimierung

Selektion / Screening

Auswahl „guter“ Stämme aus der Vielzahl der Mutanten,

Selektion auf gewünschte Eigenschaften

Ungerichtete Mutation

Chemische Agenzien, UV-Licht zufällige Schädigungen der DNA,

zumeist Punktmutationen,

eingesetzt in der Biotechnologie seit ca. 1950 (Strategie analog der Evolution)

zufällige Schädigungen der DNA geringe Überlebensrate

Ungerichtete Mutation

Selektion

Primary Screen

ca. 30.000 bis 300.000 Mutanten high-throughput

miniaturisiert, automatisiert

die besten 50 bis 500 Mutanten weiterführende Untersuchungen

Secondary Screen

Weitere Verbesserung Auswahl weniger Mutanten viele Stämme, kurze Zeit, quantitativ

Anwendungsbeispiel

Klassische Stammoptimierung

Herstellung Feed-Back-resistenter Mutanten zur Über-Produktion von Aminosäuren

Produktion von Lysin mit C. glutamicum

Beispiel - Klassische Stammoptimierung

Herstellung Feed-Back-resistenter Mutanten zur Über-Produktion von Aminosäuren

in Wildtyp-Stämmen unterliegt die Aminosäuresynthese typischerweise einer Feed-back-Inhibierung zumeist ist das erste Enzym des SWW kontrolliert

A B

C D

E

E

Intrazelluläre Akkumulation von Lysin und Threonin

führt zum Abschalten der Synthese praktisch keine Sekretion von Lysin ins Medium

Regulation der Lysin-Biosynthese in C. glutamicum

Gewinnung von Produktionsmutanten über Ausschalten/Umgehung der Feed-Back-Inhibierung

Kultivierungsprofil des Wildtyps

Lysin

Lysinproduktion ist kontrolliert über Feed-Back-Inhibierung

der Aspartokinase

Regulation der Lysin-Biosynthese in C. glutamicum

Aspartyl-P Aspartat

P

ATP ADP (A)

Konformationsänderung des Enzyms nach Bindung von Lysin/Threonin

Aspartat

X

Threonin Lysine

(B)

Wildtyp

keine Überproduktion von Lysin

∆-PDC

Diaminopimelate

Threonine

Lysine Aspartate

Überproduktion von Lysin deregulierte Mutante

Ziel

Stammoptimierung

Beispiel - Klassische Stammoptimierung

∆-PDC

Diaminopimelate

Threonine

Lysine Aspartate

Inkubation mit chemischen Agenzien, UV-Licht Wildtyp

zufällige, ungerichtete Schädigung der DNA tausende von zufälligen Mutanten Mutation des Wildtyps von C. glutamicum

zur Produktion von Lysin

Beispiel - Klassische Stammoptimierung

Problem Feed-Back-Inhibierung

durch L-Lysin

Einsatz toxischer Strukturanaloga zur Selektion

bindet WT-Aspartokinase Feed-Back-Inhibierung

Bindung ist reversibel COOH

CH CH₂ H₂N

CH₂ CH₂ CH₂

NH₂

L-Lysin

COOH CHCH² H²N

CH² CH² CH²

NH²

COOH CH

CH2

H2N

S CH2

CH2

NH2

COOH CH

CH2

H2N

CH2

CH2

CH2

NH2

L-Lysin S(Aminoethyl)-

Cystein

Einsatz toxischer Strukturanaloga zur Selektion

bindet WT-Aspartokinase irreversibel, dauerhafte Inhibierung der

Lysinsynthese, (Zelltod) bindet WT-Aspartokinase reversibel

L-Lysin

COOH CHCH² H²N

CH²CH² CH²

NH²

AEC

COOH CHCH² H2N

S CH² CH²

NH² H

COOH CHCH² H2N

S CH² CH²

NH² H

Mutante mit mutierter Aspartokinase (Mutation in Lysin-Bindungsstelle) Stamm lebensfähig in Anwesenheit von AEC Inkubation von Mutanten in Anwesenheit von AEC

Mutante mit nicht mutierter Aspartokinase, nicht lebensfähig

in Anwesenheit von AEC

COOH CH

CH2

H2N

S CH2

CH2

NH2

COOH CH

CH2

H2N

S CH2

CH2

NH2

AEC AEC

COOH CH

CH2 H₂N

S CH2 CH2

NH2

Selektion von Feed-Back-resistenten Mutanten von C. glutamicum zur Produktion von Lysin

Selektions-Agar mit α-Amino-Ethyl-Cystein

toxisches Struktur-Analogon von Lysin, irreversible Bindung der Aspartokinase an der Lysinbindungsstelle

zuvor erhaltene, zufällige Mutanten

lebensfähige, wachsende Kolonien Mutation in der Lysin-Bindungsstelle der Aspartokinase

Feed-Back-Resistente Stämme

Ausplattieren

weiteres Screening

Wildtyp

Feed-back resistente Mutanten

Feed-Back-resistente Mutanten von C. glutamicum

Schutz optimierter Stämme durch Patentierung

Lysin-Patent für USA von Kyowa Hakko

(Japan) von 1973

Klassische Stammoptimierung

Selektion

Analyse

Mutation

Screening / Selection Mutagenesis

Classical Strain Improvement

Klassische Stammoptimierung ist ein Iterativer Prozess

nur geringe Kenntnisse des Metabolismus notwendig leicht durchzuführen

fast jeder industriell genutzte Stamm ist heutzutage klassisch optimiert

schrittweise Optimierung in aufeinander folgenden Mutations/Selektions-Zyklen möglich

Vorteile

Klassische Stammoptimierung

Akkumulation unerwünschter Mutationen (ca. 10 pro Zyklus) (metabolic burden)

Konstruktion von Dead-End-Mutanten

kein Wissenszuwachs über den Organismus

„gute“ Mutationen können nicht kombiniert werden Nachteile

Klassische Stammoptimierung

genetische Änderungen eng begrenzt (einzelne Gene)

Zielgerichtete Optimierung wünschenswert lange Dauer/ hoher Aufwand bis zum gewünschten Stamm

Verbesserung klassischer Optimierungsstrategien

Klassische Vorgehensweise Genome Shuffling

gezieltes „Kreuzen“ von Mutanten (Sex in the Tube) mit der Möglichkeit, gute Mutationen zu kombinieren, führt zu deutlich höheren Verbesserungssraten

iterative Mutation Selektion

1x Mutation iterative Rekombination

1 g/L Produkt 6.2 g/L Produkt

20 Jahre Arbeit, 20 iterative Zyklen

1 Million Assays

1 g/L Produkt 8.2 g/L Produkt

1 Jahr Arbeit, 2 iterative Zyklen

24.000 Assays

The Power of Genome Shuffling

Auswahl von 11 Mutanten

Auswahl von 7 Mutanten

Genome Shuffling

VT sehr effektive Methode zur Optimierung von Stämmen, Kombination guter Mutationen, wenig Metabolic Burden

NT kein rationaler Ansatz, Kenntnisgewinn, eingeschränkte Mutationen, Dead End Mutanten

Targeted improvement of cellular activities by manipulation of enzymatic, transport, and regulatory functions of the cell with the use of

rDNA technology.

Jay Bailey (1991) Science

Metabolic Engineering

Gezielte Manipulation der DNA durch Genetic Engineering (rekombinante DNA Technologie)

Gen-Knockout

Gen-Duplikation

Gen-Insertion Gen-Austausch

Zielgerichtete Modifikationen möglich

Schlüssel zum Erfolg ist die Identifikation geeigneter Targets

Stammoptimierung durch Metabolic Engineering

Analyse

Design Synthese

Metabolic Engineering

Design

Metabolic Redirection Attenuation / Amplification

Modification of Control

Analyse

Genom, Transcriptom, Proteom, Metabolom,

Synthese

Mutation, Genetic Engineering Knock-out, Amplifikation

viele erfolgreiche Anwengungen

Beispiele – Metabolic Engineering

Erweiterung des Substratspektrums Pentose-Metabolismus zur Ethanolbildung

Cellulose-Depolymerisierung Stärke-Abbau Xenobiotika-Abbau

Steigerung der Produktausbeute Ethanol

Aminosäuren (Glutamat, Lysin) 1,3-Propandiol

Erweiterung des Produktspektrums Antibiotika

Polyketide Biopolymere

Xylitol

Optimierung zellulärer Eigenschaften Änderung Stickstoff-Metabolismus Prevention von Overflow-Metabolismus

Genetische Stabilität Verringerung Maintenance-Bedarf

Änderung Substrat-Aufnahme

Biotechnologische Produktion von L-Lysin

• Biosyntheseweg

• Transport

• Nebenproduktbildung

• Precursorstoffwechsel

• Cofaktorsynthese

• Regulation

• Erhaltungsstoffwechsel

Optimierung

Glucose

Phosphoenolpyruvate Pyruvate

Oxaloacetate L-Aspartate

L-Aspartyl-phosphate

L-Aspartyl- semialdehyde

L-2,3 Dihydro- picolinate

NADPH NADP L-Piperidine- 2,6 dicarboxylate

NADPH NADP

N-Succinyl- 2-amino-6-ketopimelate

N-Succinyl- 2,6-L,L-Diaminopimelate

NADPH

NADP NADPH NADP

Glutamate Oxoglutarate

NH4 +

Oxoglutarate Glutamate

NH4+

L,L-Diaminopimelate

D,L-Diaminopimelate

L-Lysine Succinyl-CoA

CoA

Succinate NADPH

NADP NH₄⁺

Oxoglutarate Isocitrate

L-Isoleucineex

L-Lysineex

NADPH NADP

L-Threonineex

23 ATP

ADP

CO2

1

2 3

1 Austausch Aspartokinase 2 Knockout HS-DH, HS-Kinase

3 Amplifikation Dihydropicolinat-Reduktase

Austausch

Wildtyp-Stamm

Produktions-Stamm mit alternativem Gen

Stammoptimierung durch Gen-Austausch

mutiertes Gen ursprünglich über klassische Optimierung gewonnen

3PG

∆-PDC

Diaminopimelate

Threonine

Lysine Aspartate

3PG

∆-PDC

Diaminopimelate

Threonine

Lysine

Aspartate

Feed-back resistente Aspartokinase Austausch eines einzigen Nukleotids

gegenüber dem Wildtyp

Optimierung der Lysinproduktion

Lysin (g/L)

LysC-Mutante

Wildtyp

Stammoptimierung durch zusätzliche Gen-Kopien (Amplifikation)

Wildtyp-Stamm mit einem Produktsynthese-Gen

Produktions-Stamm mit vielen Produktsynthese-Genen

Amplifikation von dap A (Dihydropicolinat-Reduktase) über

Plasmid-codierte Expression

Optimierung der Lysinproduktion

3PG

∆-PDC

Diaminopimelate

Threonine

Lysine Aspartate

3PG

∆-PDC

Diaminopimelate

Threonine

Lysine

Aspartate

Änderung des Produktspektrums Lysinproduzent

Threoninproduzent AK

HD HK

∆-PDC

Diaminopimelate

Lysine Aspartate

∆-PDC

Diaminopimelate

Threonin

Lysine Aspartate

Amplifikation der WT-Aspartokinase

Optimierung der Lysinproduktion

schlechteres Wachstum keine Erhöhung der Lysinbildung Phosphoenolpyruvat

Amplifikation der WT-PEP-Carboxylase besseres Wachstum

keine Erhöhung der Lysinbildung

simultane Amplifikation von AK und PEPC

Lysinbildung = 250 % vom Wildtyp ! schwierige Vorhersage genetischer Änderungen

3PG

∆-PDC

Diaminopimelate

Threonine

Lysine Aspartate

3PG

∆-PDC

Diaminopimelate

Threonine

Lysine Aspartate

Erweiterung des Substrat-Spektrums durch heterologe Expression eines SWW

Nachwachsende Rohstoffe

Bakterien / Hefen

Bioethanol

Produktion von Bioethanol

CO₂

Beispiel - Erweiterung des Substrat-Spektrums

Bioethanol Produktion aus nachwachsenden Rohstoffen

Gunasekaran und Chandra Raj (2001) Madurai Kamaraj University, India

Z. mobilisals interessanter Organismus zur Ethanolbildung

Nellaiah, Karunakaran and Gunasekaran (1988) J. Ferment. Technol.

P = erzielte Ethanol-Konzentration (g/l) Y_P/S= Produktausbeute (g(g)

Erweiterung des Substrat-Spektrums

Z. mobiliskann keine Pentose-Zucker metabolisieren

Unvollständige Nutzung von Cellulose/Hemicellulose-Mischungen

Erweiterung des Substrat-Spektrums

Xylose- Fraktion

Genetic Engineering von Z. mobilis

Einbau der Gene zur Xylose-Aufnahme und des PPP

Klonierung und Expression heterologer Gene aus E. coli

Zhang, Eddy, Deanda, Finkelstein and Picataggio (1995) Science. 267

Simultane Aufnahme von Glucose und Xylose

Wildtyp-Stamm

Produktions-Stamm mit heterologem Stoffwechselweg

Insertion

Stammoptimierung durch Insertion

Einbau zusätzlicher Gene zur Stammoptimierung

2. Transformation mit heterologem Pathway 1. Plasmidkonstruktion

heterologe Gene

Ori Locus

Simultane Aufnahme von Glucose und Xylose

Genetic Engineering von Z. mobilis

Produktion von Aceton/Butanol

Chaim Weizmann

C. acetobutylicum „The Weizmann Bacterium“

Produktion von Aceton/Butanol mit Chlostridium acetobutylicum

Erhöhung der Produktivität

pH

Butyrat

Acetat Aceton

Butanol

t

Acetyl-CoA Acetat

Acetoacetyl-CoA

Butyryl-CoA Butyrat

Säurebildung (pH > 4,5)

AK PTA

BK PTB

Acetyl-CoA Acetat

Acetoacetyl-CoA

Butyryl-CoA Butyrat

Solvent-Bildung (pH < 4,5)

Aceton

Ethanol

Butanol

Umschalten von Säurebildung auf gewünschte Aceton/Butanol-Bildung

Aufklärung der metabolischen Regulation Identifikation des SOL-Repressorproteins

Operons für Bildung von Aceton/Butanol SolR

Regulation der Bildung von Aceton/Butanol (Sol Locus)

Repressorprotein

SolR

Repressorprotein bindet an die Regulatorsequenzen der einzelnen Operons und verhindert deren Transcription

Stategie Knock-out Mutation des SolR-Gens

Knock-out Mutation des SolR-Gens führt zu deutlich verbesserter Produktivität

Transcription

WT

SolR Knock-out

mM Butanol 74

249

mM Aceton 66

140

mM Aceton 15

21

Acetyl-CoA Ethanol

Acetoacetyl-CoA

Butyryl-CoA Butanol Aceton

Erhöhung der Butanol-Bildung in C. acetobutylicum

Butyrat

BK PTB

Acetat

AK PTA

Ansatz: Verringerung der Aktivität von Butyratkinase (BK) und Phosphotransbutyrylase (PTB) über antisense RNA

Metabolic Design – Kontrolle des Metabolismus über antisense-RNA chromosomales Gen für BK Antisense-Plasmid gegen BK

Transcription

mRNA as-RNA

Abbau durch Doppelstrang-RNAsen Translation

Ribosom- bindung

keine Translation Konkurrenzreaktionen

mRNA

BK PTB

asRNA gegen BK asRNA gegen PTB Herstellung von Konstrukten zur Unterdrückung

der Transcription von BK und PTB

PTB WT

mut 1 mut 2

BK WT

mut 1

mut 2

Einsatz von asRNA führt zu deutlich geringeren Aktivitäten von Butyratkinase und Phosphotransbutyrylase in den Mutanten

Messung spezifischer Enzymaktivitäten von BK und PTB

Vergleich – Wildtyp und asRNA-Mutanten

Veränderung zellulärer Eigenschaften

Krokodile haben verblüffende Eigenschaften

Krokodile können beim Lauern – ohne Luft zu holen – mehr als eine Stunde unter Wasser bleiben

Krokodile verfügen dazu über ein besonderes Hämoglobin dieses verringert bei Akkumulation von Bicarbonat

im Blut drastisch seine Affinität für Sauerstoff Beim Jagen setzen Krokodile auf den Überraschungseffekt:

Auftauchen, Zuschnappen, Todesrolle, Fressen.

Krokodile verfügen dazu über ein besonderes Hämoglobin dieses verfügt über eine Bindungsstelle für Hydrogencarbonat

(HCO₃^-)

bei Akkumulation von Bicarbonat

im Blut erfolgt dessen Bindung an das Hämoglobin drastische Verringerung der Affinität für Sauerstoff

Transplanting a unique allosteric effect from crocodile into human haemoglobin

Hennakao et al. (1995) Nature 373

100

50

0

log(pO₂) in blood

oxygensaturationof Hb

croco human

croco: conformation change due to allosteric binding of bicarbonate oxygen binding affinity decreases

geringe Bicarbonat- Konzentration

Hohe Bicarbonat- Konzentration

Transplanting a unique allosteric effect from crocodile into human haemoglobin

Hennakao et al. (1995) Nature 373

100

50

0

log(pO₂) in blood

oxygensaturationof Hb

Scuba

low bicarbonate

high bicarbonate

Only a few mutations in key positions can create new properties of proteins and allow species to adapt to a new environment

allosteric binding effect via only 12 AA exchanges

Metabolic Engineering

interdisziplinäres Feld in Forschung und Industrie großes Potential zur Optimierung von Bioprozessen

effektive Tools zur genetischen Modifikation großer Mangel im Verständnis von Funktion und

Regulation des Metabolismus

gezielte Änderungen führen nicht immer zum gewünschten Erfolg