Stein u. Bässler: Mikromethode zur enzymatischen Bestimmung von Acetessigsäure und D-(-)-/?-Hydroxybuttersäure 27
Daraus ergibt sich, daß auch unter extremen Bedingun-
gen die Umkehr der Wanderungsrichtung nicht allein von der Strömungswanderung abhängen kann. Der Pufferstrom verläuft bei denjenigen Substanzen, die ihre Wanderungsrichtung in Abhängigkeit von der Startlage umkehren, stets in der gleichen Richtung wie die wan-
dernde Substanz, bleibt aber in der Mehrzahl der Start- positionen stark hinter dem Wert für die Gesamtwande- rung zurück. Alle Substanzen, die ihre Wanderungs- richtung nicht-umkehren, wandern von einigen Start- positionen aus sogar dem Pufferstrom entgegen.
Literatur 1. GRAF, E. und P. H. LIST, Naturwissenschaften 40y 273 (1953). — 2. CLOTTEN, R. und A. CLOTTEN, Hochspannungselektrophorese, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1962). — 3. GRASSMANN, W. und K. HANNIG, Hoppe-Scyler's Z. physiol. Chem. 290, \ (1952). —
4. MICHL, H., Mh. Chem. 82, 489 (1951). — 5. SCHNEIDER, G. und G. SPARMANN, Naturwissenschaften 42, 156 (1955). — 6. v. HOLT, L., K. D. VOIGT und K. GAEDE, Biochem. Z. 323, 345 (1952). — 7. MICHL, H., Mh. Chem. 85, 1251 (1954).
Dr. Gerold Schneider 7828 Neustadt (Schwarzw.) Dennenbergstr. l
Mikromethode fcur enzymatischen Bestimmung
von Acetessigsäure und D-(-)-ß-Hydroxybuttersäure in Blut und Geweben
Von G. STEIN und K. H. BÄSSLER
Aus dem Physiologisch-Chemischen Institut der Universität Main^ (Direktor: Prof. Dr. R. K. Zahn) (Eingegangen am 9. Mai 1967)
Es wird eine Mikromethode zur enzymatischen Bestimmung von Acetessigsäure und ß-Hydroxybuttersäure in Blut und Geweben be- schrieben. Bei Patienten mit Ketoaci'dose und bei hungernden Ratten können beide Ketonkörper in 0,1 m/ Blut bestimmt werden. Für die Bestimmung normaler Spiegel beim Menschen benötigt man je 0,2 m/Blut für Acetessigsäure und 0-Hydroxybuttersäure. Daten über die Genauigkeit der Methode, Wiederfindungsversuche und Werte in Rattenblut und menschlichem Blut werden mitgeteilt.
A micromethod is described for the enzymic determination of acetoacetic acid and ß-hydroxybutyric acid in blood and tissues. In patients with keto-acidosis and in starved rats, both ketone bodies can be determined in 0.1 m/ of blood. 0.2 m/ of blood is required for the mea- surement of normal levels of acetoacetic acid and /?-hydroxybutyric acid in humans. Data are given for the accuracy of the method, the efficiency of recovery and values from rat blood and human blood.
Für Untersuchungen des Ketonkörper-StofFwechsels sind wir auf eine Methode Angewiesen, die es erlaubt, in 0,1 m/ Rattenblut Acetessigsäure und /?-Hydroxybutter- säure zu bestimmen. Ausreichende Spezifität gewähr- leistet nur die enzymatische Bestimmung. BERGMEYER und BERNT (1) haben eine enzymatische Methode be- schrieben, die aus der Methode von WILLIAMSON, MELLANBY und KREBS (2) entwickelt ist. Für Unter- suchungen an kleinen Versuchstieren erfordert sie aber zuviel Blut. Wir haben diese Methode für eine Mikro- bestimmung modifiziert, so daß bei hungernden Ratten beide Ketonkörper in 0,1 m/ Blut zuverlässig bestimmt werden können. Um Normalwerte beim gesunden Menschen messen zu können, benötigt man je 0,2m/
Blut für Acetessigsäure und ß-Hydroxybuttersäure. Für die Untersuchung pathologischer Fälle und für die Ver- laufskontrolle von Ketoacidpsen genügen auch beim Menschen 0,1 m/Blut für die Bestimmung beider Keton- körper, da hierbei die untere Nachweisgrenze bei Werten erreicht wird, die nicht mehr als pathologisch bezeichnet werden können. Da man bei Mikrolitermethoden trotz geringeren Enzymverbrauchs höhere Enzymkonzen- trationen im Ansatz hat als bei Makromethoden, ver- ringert sich der Zeitbedarf für eine Bestimmung wesent-
lich. Allerdings fallen deshalb auch Fremdaktivitäten im Enzympräparat stärker ins Gewicht und müssen berück- sichtigt werden.
Methodik
Prinzip der Methode
3-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase1) katalysiert die Dehydrierung von ß-Hydroxybuttersäure mit NAD?) bzw. die Reduktion von Acetessigsäure mit NADH. Dieser Vorgang wird nach dem Prinzip der Endwertbestimmung bei 366 nm registriert. Da käufliche Präparate von 3-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase noch Lactat- und Malat-Dehydrogenase enthalten, müssen vor der Bestimmung von Acetessigsäure Proben, die Pyruvat und Oxalacetat enthalten, mit Lactatdehydrogenase und Malatdehydrogenase inkubiert werden, um diese Substanzen zu beseitigen. Im Gegensatz zu den Angaben von BERGMEYER (1) fanden wir eine solche Vorinkubation auch bei der Bestimmung von /?-Hydroxybuttersäure notwendig, besonders, wenn die Lactatkonzentration in den Proben groß war. Der Grund
*) Der Trivialname 3-Hydroxybutyrat-Dehydrogenase wird hier gebraucht für das Enzym D-3-Hydroxybutyrat: NAD-Oxydo- reduktase EC I. I. I. 30; Lactat-Dehydrogenase für L-Lactat:
NAD-Oxydoreduktase EC I. LI. 27; Malatdehydrogenase für L-Malat: NAD-Oxydoreduktase EC 1.1.1. 37.
2) Abkürzungen: NAD bzw. NADH = Oxydiertes bzw. reduziertes Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid; LDH = Lactatdehydrogenase;
MDH = Malatdehydrogenase; 3-HBDH = 3-Hydroxybutyrat- dehydrogenase.
Z. klin. Chem. u. klin. Biochem. / 6. Jahrg. 1968 / Heft l 4*
28
Stein u. Bässler: Mikromethode zur enzymatischen Bestimmung von Acetessigsäure und D~(-)-j5-Hydroxybuttersäurefür diesen Unterschied liegt wahrscheinlich in der relativ höheren Enzymkonzentration bei der Mikromethode. Für Routinebe- stimmungen verzichten wir auf die Messung von Lactat und Malat bzw. Pyruvat und Oxalacetat und führen diese Vorinkubation in Reaktionsgefäßen des Mikrolitersystems durch, statt in der Küvette.
Wenn es erwünscht ist, auch diese Substrate zu bestimmen, kann die Vorinkubation mit Lactat- und Malat-Dehydrogenase in der Küvette durchgeführt werden.
Apparatur
Wir verwenden ein Photometer Eppendorf mit Mikrolitersystem und Registrierzusatz (Philips Einlinienschreiber PR 2500), eine Kombination, die die nötige Empfindlichkeit und Genauigkeit ge- währleistet. Der Registrierbereich wird auf 0—0,25 gestellt, so daß ein Schreiberausschlag von l cm einer Extinktionsdifferenz von 0,0125 entspricht. Der Papiervorschub wird bei Bestimmung von Acetessigsäure auf l cm/Min., bei Bestimmung von ß-Hydroxy- buttersäure auf 0,2 cm/Min, eingestellt. Es werden Mikroküvetten mit Absaugvorrichtung und l cm Schichtlänge verwendet.
Reagentien
D,L-/?-Hydroxybuttersäure, Na-Salz, \vurde bezogen von Nutritio- nal Biochemicals Corp., Cleveland, Ohio.
Acetessigsäure wurde durch Hydrolyse von Acetessigsäureäthyl- ester nach LJUNGGREN (3) dargestellt. Lactatdehydrogenäse (5 mg Protein/m/), Malatdehydrogenase (10 mg Protein/m/), 3-Hydroxy- butyratdehydrogenase (5 mg Protein/m/), sowie NAD und NADH (Na-Salz) stammten von C. F. Boehringer u. Söhne GmbH., Mannheim.
Die übrigen Reagentien waren von E. Merck, Darmstadt.
Arbeitsweise
Zur besseren Übersicht geben wir ein Arbeitsschema in Stichworten. Ausführlichere Bemerkungen zu einzelnen kritischen Schritten folgen im Anschluß daran.
1. Bestimmung von Acetessigsäure in menschlichem Blut (bei Untersuchung von Werten im Normbereich)
0,2 m/ Blut
0,2 m/ 6proz. Perchlorsäure
im verschlossenen Reaktionsgefäß 3 Min. rütteln (Rüttel- aufsatz des Mikrolitersystems), dann 2 Min. zentri- fugieren
0,2 m/ Überstand
0,1 m/ 0,8M K3PO4-Lösung
in ein Reaktionsgefäß pipettieren, 15 Min. im Eisbad stehen lassen, dann 2 Min. zentrifugieren
0,200 ml Überstand
0,050 ml 0,5M PhosphatpurTer pH 6,9 0,005 m/ NADH (10 mg Na-Salz pro m/) 0,010 m/ LDH
0,010 m/ MDH
in ein Reaktionsgefäß pipettieren, kurz rütteln und 4 Min. bei Zimmertemperatur stehen lassen. Pyruvat und Oxalacetat werden reduziert.
0,250 m/ aus dem vorinkubierten Ansatz in eine Küvette pipettieren, Leerlauf registrieren, dann Start mit 0,005 m/ 3-HBDH
Registrieren, bis die Extinktionsabnahme linear und parallel zur Abnahme vor dem Start mit 3-HBDH verläuft. Dauer 5—10 Min.
Berechnung: Schreiberausschlag in cm multipliziert mit dem Faktor 0,016 ergibt //Mol Acetessigsäure pro m/ Blut. Dieser Wert multipliziert mit 10,2 ergibt mg% Acetessigsäure.
2. Bestimmung von ß-Hydroxybuttersäure in menschlichem Blut (bei Untersuchung von Werten im Normbereich)
0,2 m/ Blut
0,2 m/ 6proz. Perchlorsäure
im verschlossenen Reaktionsgefäß 3 Min. rütteln, dann 2 Min. zentrifugieren
0,2 ml Überstand 0,1 m/ 1, 3 4
in ein Reaktionsgefäß pipettieren, 15 Min. im Eisbad stehen lassen, dann 2 Min. zentrifugieren.
0,200 ml Überstand
0,050 ml 0,5M Glycin-Puffer pH 9,5 0,020 ml NAD (40 mg pro m/) 0,010 ml LDH
0,010 ml MDH
in ein Reaktionsgefäß pipettieren, kurz rütteln und 4 Min. stehen lassen. Lactat und Malat werden oxydiert 0,250 ml aus dem vorinkubierten Ansatz in eine Küvette pi- pettieren, kurz registrieren um festzustellen, ob Lactat und Malat vollständig verbraucht sind, dann Start mit 0,010 ml 3-HBDH
Extinktionszunahme registrieren bis Kurve abszissen- parallel verläuft. Dauer 10—20 Min.
Berechnung: Schreiberausschlag in crn multipliziert mit dem Faktor 0,017 ergibt ! j5-Hydroxybuttersäure pro ml Blut.
Dieser Wert multipliziert mit 10,4 ergibt mg% 0-Hydroxy- buttersäure.
3. Bestimmung von Acetessigsäure und ß-Hydroxybuttersäure im Blut hungernder Ratten oder bei Menschen mit erhöhtem Keton- körperspiegel
0,1 ml Blut
0,2 ml 6proz. Perchlorsäure
im verschlossenen Reäktionsgefäß 3 Min. rütteln, dann 2 Min. zentrifugieren: Überstand I.
0,2 ml Überstand I 0,3m/0,6MK3P04
in ein Reaktionsgefäß pipettieren, 15 Min. im Eisbad stehen lassen, dann 2 Min. zentrifugieren: Überstand II.
Acetessigsäurebestimmung 0,100 ml Überstand II 0,100 ml 0,5M Phosphatpuffer
pH 6,9
0,005 ml NADH (10 mg/m/) 0,010 ml LDH
0,010 ml MDH
im Reaktionsgefäß kurz rütteln, 4 Min. stehen lassen
0,200 ml aus dem vorinkubierten Ansatz in Küvette, registrieren, Start mit 0,005 ml 3-HBDH
Extinktionsabnahme registrieren
Berechnung: Schreiberausschlag in cm · 0,052 = ! Acetessig- säure pro ml Blut
/3-Hydroxybuttersäurebestimmung 0,100 ml Überstand II
0,100 ml Glycinpuffer pH 9,5
0,020 mi NAD (40 mg/mi) 0,010 ml LDH
0,010 mi MDH
im Reaktionsgefäß kurz rütteln, 4 Min. stehen lassen
0,200 ml aus dem vorinkubierten Ansatz in Küvette, registrieren, Start mit 0,010 ml 3-HBDH
Extinktionszunahme registrieren
Berechnung: Schreiberausschlag in cm · 0,057 = ! 0-Hydroxy- buttersäure pro ml Blut
4. Bestimmung von A.cetessigsäure und ß-Hydroxybuttersäure in Rattenleber
0,5—1,0 g Leber werden im Potter-Elvehjem-Homogenisator mit 6proz. Perchlorsäure homogenisiert und auf 5,0m/ auf- gefüllt (Eiskühlung).
Nach Zentrifugieren werden 0,5 ml Überstand zur Fällung von Perchlorat mit 0,2 ml 2M K3PO4-Lösung versetzt und 15 Min.
im Bisbad gehalten.
2. kliri. Chem. u. klin. Biochem. / 6. Jahrg. 1968 / Heft l
Stein u. Bässler: Mikromethode zur ensymatischen Bestimmung von Acetessigsäure und D-(-)-/?-Hydroxybuttersäurc 29 Dann wird zentrifugiert. Vom Überstand werden je 0,1 m/ für
die Bestimmung von Acetessigsäure und /?-Hydroxybuttersäure verwendet, die ebenso durchgeführt wird, wie bei der Be- stimmung in Rattenblut beschrieben.
0,061 Berechnung
Acetessigsäure:
Schreiberausschlag in cm * _ . , Lebergewicht in g
= //Mol Acetessigsäure pro g Leber.
ß-Hydroxybuttersäure:
0,067 Schreiberausschlag in cm · — ——:—
Lebergewicht m g
= ! /?-Hydroxybuttersäure pro g Leber.
Anmerkung zur Methode Bluiabnahme und Enteiweißung
Die Perchlorsäure soll vorgekühlt sein (0—4°). Die Blutzucker- pipette, mit der Blut abgenommen worden ist, soll nicht in die Perchlorsäure eingetaucht werden, weil sich dadurch Volumen- fehler ergeben, die bei der Mikromethode ins Gewicht fallen. Man setzt den Blutstropfen durch leichtes Ausblasen unmittelbar über dem Perchlorsäurespiegel an die Gefäßwand. Die Pipette läuft einwandfrei und vollständig aus, wenn man vor Gebrauch l proz.
Heparinlösung aufzieht, wieder ausbläst und dann Blut aufzieht.
Mischen von Blut und Perchlorsäure erfolgt auf dem Rüttler.
Mischen in der Küvette
Zum raschen Durchmischen in der Mikroküvette nach Enzym- zugabe verwenden wir dünne Zahnstocher aus Kunststoff.
Auswertung
Bei der Bestimmung von Acetessigsäure findet man meist einen langsamen linearen Extinktionsabfall nach Beendigung der eigentlichen Reaktion. Dieser lineare Abfall nach Ablauf der Re- aktion wird in üblicher Weise extrapoliert auf die Zeit 0, um die Extinktionsdifferenz zu erhalten. Bei der Bestimmung von ß-Hy- droxybuttersäure kommt die Reaktion zum Stillstand und man nimmt die Differenz vom Fußpunkt bis zum Scheitel der Kurve.
Wenn die Reaktion nicht zum Stillstand kommt, sondern linear weiter läuft, ist der pH-Wert in der Küvette zu hoch.
Bei dem gewählten Registrierbereich entspricht l cm Schreiber- ausschlag einer Extinktionsdifferenz von 0,0125. Die Menge an jS-Hydroxybuttersäure bzw. Acetessigsäure im Ansatz errechnet sich deshalb zu: cm · 0,0125 « 3,3-d = ! im Testansatz.V (V = Testvolumen; d = Schichtlänge in cm; 3,3 = Extinktion von l ! NADH pro m/ bei 366 nm).
Dieser Wert ist mit dem Verdünnungsfaktor zu multiplizieren, um yuMole pro m/ Blut zu ergeben. Auf diese Weise kommen die bei den Berechnungen angegebenen Umrechnungsfaktoren zu- stande.
Es ist bei diesen Faktoren nicht berücksichtigt, daß Blut etwa 80%
seines Gewichts an Flüssigkeit enthält und ein spezifisches Gewicht von etwa 1,06 hat (4). Will man darauf korrigieren, so sind die bei 0,2 m/ Blut erhaltenen Werte mit dem Faktor 0,925 zu multipli- zieren (0,2 m/ Blut -f 0,2 m/ Perchlorsäure ergeben 0,37 m/
Extrakt) und die bei 0,1 m/Blut erhaltenen Werte mit dem Faktor 0,95 (0,1 m/ Blut -f- 0,2 m/ Perchlorsäure ergeben 0,285 m/
Extrakt).
Ergebnisse
Die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der Methode ergibt sich aus den Daten in Tabelle l, die durch mehr- malige Bestimmungen aus der gleichen Blutprobe ge- wonnen worden sind.
Wiederfindungsversuche aus Blut sind in Tabelle 2 zu- sammengestellt.
Tab. l
Genauigkeit der Bestimmung von Acetessigsäure und 0-Hydroxv- buttersäure im Blut
Einer Ratte wurden nach 12 Stdn. Hunger etwa 4 m/ Blut entnom- men. Aus dieser Blutmenge wurden 14mal je 0,1 ml zur Bestimmung
der beiden Ketonkörper verwendet
n
Extremwerte (juMolfmt) Mittelwert ( /mO Standardabweichung
Acetessigsäure 14 0,262—0,283
0,272 0,007
/?-Hydroxybutter- säure
14 0,858—0,915
0,890 0,021 Tab. 2
Wiederfindungsversuche
In größeren Blutproben wurden zuerst die beiden Ketonkörper be- stimmt. Dann wurden die in der Tabelle angegebenen Mengen an Acetessigsäure bzw. 0-Hydroxybuttersäure zugesetzt und wieder be- stimmt. Die gemessenen Werte abzüglich Mittelwert der schon im Blut vorhandenen Menge ergeben die in der Tabelle angegebenen
wiedergefundenen Mengen Acetessigsäure
Zugesetzt juMol/mi
0,572
Mittelwert:
| D-0-Hydroxybuttersäure Wiedergefunden
/iMolfml % 0,583 102 0,583
0,618 0,583 0,580 0,592 0,589
102108 102101 103 103
Zugesetzt Wiedergefunden uMol/ml //Mol/m/ %
0,350 0,361 103 0,361
0,342 0,300 0,352 0,390 0,351
10397,7 100,585,7 111,4 100,2 Tab. 3
Acetessigsäure und 0-Hydroxybuttersäure in Rattenblut nach 12 Stdn. Hunger
Die Werte stammen von 26 Ratten
Mittelwert Streubreite
(Extremwerte) Standardabweichung
Acet- essigsäure ( /mO 0,290 0,100—0,480
0,07
/9-Hydroxy- buttersäure
( /mJ) 0,593 0,285—1,163
0,2
0-Hydroxy- buttersäure Acetessigsäure
1,4—3,372,05 0,4
Tabelle 3 zeigt die Ketonkörperspiegel im Blut von Ratten nach 12 Stdn. Nahrungsentzug. Die Streubreite der Werte ist beträchtlich. Möglicherweise trägt zu dieser Streubreite der Umstand bei, daß in nicht kon- trollierbarer Weise ein Teil der Tiere unmittelbar vor Futterentzug gefressen haben mag, während ein anderer Teil schon längere Zeit kein Futter mehr aufgenommen
hat.
Werte für Acetessigsäure und /?-Hydroxybuttersäure in menschlichem Blut zeigt die Tabelle 4. Es fällt auf, daß diabetische Versuchspersonen trotz guter Ein- stellung im Durchschnitt höhere Ketonkörperspiegel
Tab. 4
Acetessigsäure und /S-Hydroxybuttersäure in menschlichem Blut Die Blutabnahme erfolgte morgens in nüchternem Zustand. Alle
Diabetiker waren eingestellt und unter Kontrolle Acet-
essigsäure (//Mol/m/) 0,028 0,088 0,028 0,073 0,130 0,130 0,015 0,021 0,013 0,019 0,090 0,048 0,043 0,019 0,027 0,026 0,027
0-Hydroxy- buttersäure ( /mZ)
0,137 0,275 0,124 0,100 0,251 0,246 0,034 0,041 00390,024 0,266 0,100 0,058 0,034 0,068 0,037 0,077
/ff-Hydroxy- buttersäure Acetessigsäun
4.903,13 4,43137 1931,89 2,271,95 3,001,26 2,962,08 1,351,79 2,521,42 2,85
Alter,Ges
0 58, 9 28, 9 61, Q 48, 9 61, 9 57, 9 68, 0 70,
§ 59, 9 63, 9 48, 9 61, 0 68, tf 6, Cf 13, O" 13, O1 6,
chlecht, Krankheit
Diabetes Diabetes Diabetes Diabetes Diabetes Diabetes Hypertonie Herzinfarkt Hypertonie Ul'cus cruris Leukämie Hypertonie Colon-Ca Nephritis Nephritis Nephritis Nephritis
Z. klin. Chem. u. klin. Biochern. / 6. Jahrg. 1968 / Heft 1
30 Pilz u, Stelzl : Fermente des menschlichen Blutes
haben als nicht diabetische. Eine statistische Auswertung 0,1 m/ Blut für die Bestimmung beider Ketonkörper ist aber bei der vorläufig noch geringen Zahl von Pro- genügen. Wird die Nachweisgrenze unterschritten, so banden nicht sinnvoll. ' sind die Werte nicht mehr als pathologisch zu bezeich- nen. Lediglich für die Untersuchung des normalen Diskussion Ketonkörperspiegels sind für die Bestimmung von Nimmt man 1cm Schreiberausschlag als Grenze für Acetessigsäure und ^3-Hydroxybuttersäure je 0,2 m/ Blut genaue Ablesbarkeit, so liegt die untere Nachweisgrenze erforderlich.
bei Verwendung von je 0,2 m/ Blut für die Bestimmung Ein kritischer Faktor ist der pH- Wert des Bestimmungs- von Acetessigsäure und ß-Hydroxybuttersäure bei ansatzes. Er soll bei der Bestimmung von Acetessigsäure 0,016 bzw. 0,017 ! Acetessigsäure bzw. /9-Hydroxy- zwischen 6,9 und 7,2 liegen, bei der Bestimmung von ß- buttersäure pro m/ Blut. Nimmt man 0,1 m/ Blut für die Hydroxybuttersäure zwischen 9,0 und 9,5. Will man die Bestimmung beider Ketonkörper, so liegt die untere in der Methode angegebenen Volumina oder Konzen- Nachweisgrenze bei 0,052 ! Acetessigsäure bzw. trationen ändern, so muß streng darauf geachtet werden, 0,057 öl /?-Hydroxybuttersäure pro ml Blut. Die daß die erforderlichen pH-Werte im Bestimmungsansatz Daten in Tabelle 4 zeigen, daß die Ketonkörperspiegel erreicht werden.
bei den meisten Diabetikern trotz guter Einstellung über
diesen Grenzwerten liegen, bei nicht diabetischen Per-. ° ., r stutzung der Arbeit durch eine Sachbeihilfe. Herrn Oberarzt Priv. Wir dank"n d" Deu*SclT sonen jedoch darunter. Daraus ergibt sich, daß für die Do2 Dr Prellwit2j n. MecUUniv.-Klinik Mainz, danken wir für klinische Kontrolle des Verlaufs einer Ketoacidose die Blutproben der in Tabelle 4 aufgeführten Patienten.
Literatur
1. BERGMEYER, H. U. und E. BERNT, Enzymol. biol. clin. 5, 65 422 (1924). — 4. BERGMEYER, H. U., in: H. U. BERGMEYER, (1965). — 2. WILLIAMSON, D. H., J. MELLANBY und H. A. KREBS, Methoden der Enzymatischen Analyse S. 37; Verlag Chemie Biochem. J. 82, 90 (1962). — 3. LJUNGGREN, G., Biochem. Z. 145, GmbH, Weinheim/Bergstr. (1962).
Professor Dr. K. H. Bässler 65 Mainz, Postfach 606
Fermente des menschlichen Blutes
XVI. Mitteilung): Beziehung ^wischen Fettstoffmchsel undBen^oylcholinspaltung im menschlichen Vollserum Von W. PiLZ2) und E. STELZL
Aus dem Physiologisch-Chemischen und Analytischen Laboratorium (Leiter: Dr. W. Pil%) der Ärztlichen Abteilung (Leiter:
Dr. H. Hör lein) der Farbenfabriken Bayer AGy Werk Leverkusen (Eingegangen am 16. Mai 1967)
Vor kurzem konnten wir feststellen, daß sich bei Patienten mit essentieller Hyperlipämie und essentieller Hypercholesterinämie oder all- gemein arteriosklerotischer StofFwechsellage bei der Hydrolyse von Benzoylcholin zwei, drei oder mehr pH-Optima ausbilden. In der vorliegenden Arbeit werden Experimente beschrieben, in denen das Serum junger gesunder Versuchspersonen (Ausgangsmaterial) mit etwa 10 g% Neutralfett (als Maisöl) künstlich beladen wird. In zeitlichen Abständen wird das pH-Optimum vor und in verschiedenen Zeitabständen nach Fettbeladung festgestellt. Gleichzeitig wurde das Ausgangsmaterial in derselben Weise untersucht. Außerdem wurden Serumanalysen der gesamten veresterten Fettsäuren, der endogenen Lipoproteidlipase3), der Arylesterase3) und des Gesamtcholesterins durchgeführt sowie jeweils die Dibucainzahl4) bestimmt. Alle Untersuchungen wurden sowohl in dem mit Fett beladenen als auch in dem nicht mit Fett beladenen Ausgangsmaterial in etwa denselben zeitlichen Abständen durchgeführt. Dabei stellte sich heraus, daß sich bei der Hydrolyse von Benzoylcholin bereits am 1. Tag nach der Fettbeladung mindestens vier pH-Optima ausgebildet hatten, mit zunehmender Zeit nahm die Anzahl der pH-Optima zu. In dem nicht mit Fett beladenen Serum blieb die Lage des pH-Optimums gleich, es bilden sich keine weiteren pH-Optima aus. Wird statt Benzoylcholin Acetylcholin als Substrat verwendet, treten weder in dem Versuch mit noch in dem Versuch ohne Fettbeladung mehrere pH-Optima auf. Wie die Serumanalysen zeigen, kommt bereits nach kurzer Zeit sowohl die endogene Lipoproteidlipase als auch ihr Cofermentsystem, die Arylesterase, zum Erliegen. Bei dem nicht mit Fett beladenem Ansatz bleibt die Aktivität der beiden Enzymsysteme bis zum Versuchsende praktisch konstant. Bei der Untersuchung mit Fettbeladung sank die Dibucainzahl (DN) im Vergleich zum Ausgangsmaterial (DN = 81) bereits innerhalb einer Stunde auf einen Wert von DN = 46, um dann konstant zu bleiben. Die in gleicher Weise durchgeführte Analyse des Ausgangsmaterials (Werte, die als Leerwerte angesehen werden können) zeigen, daß die Dibucainzahl praktisch konstant bleibt. Innerhalb von 8 Tagen nahm bei dem Versuch mit Fettbeladung die Menge der gesamten veresterten Fettsäuren um 510 mg% ab, während sie im gleichen Zeitraum im Ausgangsmaterial nur um 48 mg%
absank. Der Zusammenhang zwischen dem Auftreten mehrerer pH-Optima in dem Versuch mit Fettbeladung und der früher beschriebe- nen Existenz von 11 verschiedenen Benzoylcholin hydrolysierenden Enzymen im menschlichen Serum wird diskutiert.
1) Letzte Mitteilung: PILZ, W. und A. T. Boo, diese Z. 5., 173 3) Die Trivialnamen Lipoproteidlipase und Arylesterase werden (1967). hier gebraucht für die Enzyme: Glycerol ester hydrolase (E. C.
2) Auszugsweise vorgetragen bei der Tagung der Deutschen Ge- 3.1.1.3) und Aryl ester hydrolase (E.G. 3.1.1.2).
Seilschaft für Biologische Chemie in Marburg, Oktober 1966. 4) Abkürzungen: DN = Dibucainzahl; CE = Clearing Enzyme = Lipoproteidlipase; Tris = Trishydroxymethylaminomethan.
Z. klin. Chem. u. klin. Biochem. / 6. Jahrg. 1968 / Heft l
