Aus dem Institut für Pathologie
(Prof. Dr. med. H.-J. Radzun, Prof. Dr. med. P. Ströbel) der Medizinischen Fakultät der Universität Göttingen
Prognostische Relevanz der Autophagie in histologischen Subtypen des papillären
Nierenzellkarzinoms
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Georg-August-Universität zu Göttingen
vorgelegt von
Christina Schlegel
aus Bonn
Göttingen 2018
Dekan: Prof. Dr. rer. nat. H. K. Kroemer
Referent: Prof. Dr. med. H.-J. Radzun
Ko-Referent: PD Dr. med. R. Vasko
Datum der mündlichen Prüfung: 22.08.2018
Hiermit erkläre ich, die Dissertation mit dem Titel „Prognostische Relevanz der Autophagie in histologischen Subtypen des papillären Nierenzellkarzinoms“
eigenständig angefertigt und keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet zu haben.
Göttingen, den 03.03.2018 ………
(Unterschrift)
I Abbildungsverzeichnis ... III Tabellenverzeichnis ... V Abkürzungsverzeichnis ... VI
1 Einleitung ... 1
1.1 Nierenzellkarzinom – Epidemiologie und Ätiologie ... 1
1.1.1 Epidemiologie ... 1
1.1.2 Ätiologie ... 2
1.2 Klinik, Diagnostik und Therapie ... 3
1.3 Histologische Subtypen und Klassifizierung ... 4
1.4 Papilläre Nierenzellkarzinome ... 6
1.5 Autophagie ... 8
1.5.1 Molekularer Mechanismus der Makroautophagie ... 9
1.6 Zielsetzung ... 12
2 Material und Methoden ... 13
2.1 Patientenkollektiv... 13
2.2 Untersuchungsmaterial ... 13
2.3 Untersuchung am Tumorgewebe ... 15
2.3.1 Tissue Microarrays (TMA) ... 15
2.3.2 Präparation der Paraffinschnittpräparate ... 15
2.3.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung ... 15
2.4 Immunhistochemie und Primärantikörper ... 16
2.5. Morphometrische Untersuchung ... 17
2.6. Immunreaktiver Score ... 17
2.7 Statistik ... 18
3 Ergebnisse ... 20
3.1. Klassifizierung und Subtypisierung ... 20
II
3.2.1 Ki-67 ... 24
3.2.2 Beclin-1 ... 27
3.2.3 Light chain 3 ... 32
3.2.4 p62 ... 35
3.3 Gesamtüberleben und remissionsfreies Überleben vom papillären Nierenzellkarzinom ... 39
3.4 Gesamtüberleben und remissionsfreies Überleben in Subtypen des papillären Nierenzellkarzinoms ... 46
3.5 Gesamtüberleben und remissionsfreies Überleben in Bezug zur Expression der Autophagie-Proteine ... 48
3.5.1 Expression der Autophagie-Proteine und Gesamtüberleben ... 49
3.5.2 Expression der Autophagie-Proteine und remissionsfreies Überleben ... 51
4 Diskussion ... 54
4.1 Papilläre Nierenzellkarzinome ... 54
4.2 Autophagie in papillären Nierenzellkarzinomen ... 55
4.3 Autophagie und Überleben in papillären Nierenzellkarzinomen ... 63
4.4 Autophagie und Therapie in papillären Nierenzellkarzinomen ... 65
5 Zusammenfassung ... 68
6 Literaturverzeichnis ... 70
III
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Entstehung des Autophagosoms ... 10 Abbildung 2: Ausschnitt aus einem Schnittpräparat: HE-Färbung, papilläres
Nierenzellkarzinom Typ 1 ... 21 Abbildung 3: Ausschnitt aus einem Schnittpräparat: HE-Färbung, papilläres
Nierenzellkarzinom Typ 2 ... 21 Abbildung 4: Histogramme: a) T-Stadium b) N-Stadium, jeweils gruppiert nach
papillärem Nierenzellkarzinom Typ 1 und 2 in Abhängigkeit von den beobachteten Fällen. ... 23 Abbildung 5: 1) Histogramm für Ki-67-Expression in papillären Nierenzell- karzinomen Typ 1 und 2. 2) Ausschnitte aus den Schnittpräparaten:
Ki-67-Antikörper-Färbung in Typ 1 und 2. ... 25 Abbildung 6: 1) Balkendiagramm: Beclin-1 zytoplasmatisch und nukleär in
papillären Nierenzellkarzinomen. 2) Ausschnitte aus den Schnittpräparaten: Beclin-1, zytoplasmatische sowie nukleäre Anfärbung in Typ 1 und 2. ... 27 Abbildung 7: 1) Balkendiagramm: niedrige und hohe nukleäre Beclin-1-Expression
2) Balkendiagramm: Beclin-1 nukleär nach dem IRS, jeweils in papillären Nierenzellkarzinomen Typ 1 und 2. ... 30 Abbildung 8: Korrelationsanalyse der nukleären Beclin-1-Expression nach dem
IRS und des T-Stadiums in papillären Nierenzellkarzinomen ... 31 Abbildung 9: Korrelationsanalyse der nukleären Beclin-1-Expression nach dem
IRS und dem Grading ... 31 Abbildung 10: 1) Balkendiagramm: LC3 nach dem IRS in papillären Nierenzell- karzinomen. 2) Ausschnitte aus den Schnittpräparaten: LC3- Anfärbung in Typ 1 und 2 ... 33 Abbildung 11: Balkendiagramm: p62-Expression nach dem IRS in papillären
Nierenzellkarzinomen.. ... 35 Abbildung 12: 1) Balkendiagramm: niedrige und hohe zytoplasmatische (a) und
nukleäre (b) p62-Expression nach dem IRS in papillären Nierenzellkarzinomen Typ 1 und 2. 2) Ausschnitte aus den Schnittpräparaten: p62-Färbung in Typ 1 und 2. ... 36
IV Abbildung 13: Scatterplot: Korrelationsanalyse der zytoplasmatischen und nukleären p62-Expression und Grading in papillären Nierenzell- karzinomen ... 38 Abbildung 14: Kaplan-Meier-Kurve für das OS und DFS in papillären
Nierenzellkarzinomen (a), in Bezug auf das T-Stadium (b), auf Lymphknotenmetastasen (c), auf Metastasen (d) und auf das Grading (e). ... 41 Abbildung 15: Kaplan-Meier-Kurve: kumulierte Überlebensanteile in Abhängigkeit
von der Zeit in Jahren, aufgeteilt in OS und DFS für Typ 1 und 2 .... 47 Abbildung 16: Kaplan-Meier-Kurve für das Gesamtüberleben: Kumulierte
Überlebensanteile in Abhängigkeit von der Zeit in Jahren in Bezug auf die kodierten Autophagie-Proteine ... 49 Abbildung 17: Kaplan-Meier-Kurve für das rezidivfreie Überleben: Kumulierte
Überlebensanteile in Abhängigkeit von der Zeit in Jahren in Bezug auf die kodierten Autophagie-Proteine ... 51 Abbildung 18: Histogramm: Autophagiemarker nach dem IRS papillären
Nierenzellkarzinomen. ... 56
V
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: WHO-Klassifikation der histologischen Typen und Subtypen des Nieren- zellkarzinoms ... 5 Tabelle 2: TNM-Stadien nach UICC ... 6 Tabelle 3: Pathologische Kenndaten des untersuchten Tumorgewebes (papilläres
Nierenzellkarzinom Typ 1 und 2, T-Stadien und Grading) ... 14 Tabelle 4: Antikörper und Färbeprotokoll ... 17 Tabelle 5: Immunreaktiver Score: Intensität der Zellsignale ... 18 Tabelle 6: Pathologische Kenndaten: Häufigkeitsverteilung der TNM-Stadien in
Abhängigkeit von den Subtypen (Typ 1 und 2) ... 22 Tabelle 7: Übersichtstabelle der Kendalls Tau-Korrelationen zwischen Autophagie- Marker und pTNM-Stadium und Grading ... 24 Tabelle 8: Anzahl und Prozentanteil der vollständigen und zensierten Überlebens- zeiten in Bezug auf das TNM-Stadium und Grading im OS und DFS ... 39 Tabelle 9: OS in Abhängigkeit von T-Stadium und Grading ... 40 Tabelle 10: DFS in Abhängigkeit von T-Stadium und Grading ... 40 Tabelle 11: Log-Rank-Test: Auswirkungen der Expression der Autophagie-Marker
auf das OS und DFS ... 48
VI
Abkürzungsverzeichnis
ATG Autophagy-related gene Bcl-2 B-Zell Lymphom 2 DFS Disease-free survival
G Grading
IRS Immunreaktiver Score nach Allred ISUP International Society of Uropathology Ki-67 Kiel 67 Prolifertationsprotein
LC3 Light chain 3
n Anzahl
OS Overall survival
p62 Rezeptorprotein 62
pTNM pathologische Beurteilung des TNM Stadiums TMA Tissue Microarrays
TNM Tumorausdehnung, Nodus, Metastasen UICC Union internationale contre le cancer
1
1 Einleitung
1.1 Nierenzellkarzinom – Epidemiologie und Ätiologie 1.1.1 Epidemiologie
Maligne Erkrankungen der Niere machen insgesamt 10-15 % aller Krebsneuerkrankungen in Europa aus. Im Jahr 2008 wurden europaweit 88.400 neue Fälle von Nierenzellkarzinomen angegeben, von denen ungefähr 39.300 Fälle im gleichen Jahr nicht überlebt haben (Ferlay et al. 2010). Nierentumoren sind die sechsthäufigsten Tumoren des Mannes und die zehnthäufigsten der Frau (Kaatsch et al. 2015).
Die vom Robert Koch-Institut berechneten altersstandardisierten durch- schnittlichen Erkrankungsraten in Deutschland aus dem Jahr 2012 betrugen 16,9 männliche und 8,0 weibliche Fälle auf 100.000 Einwohner. Die Inzidenz des Nierenzellkarzinoms ist in den letzten Jahrzenten um 2-4 % stetig angestiegen, wobei die Ursache unbekannt ist (Murai und Oya 2004; Cairns 2010). Je nach histologischem Subtyp variieren die Häufigkeit und das mittlere Erkrankungsalter.
Das klarzellige Nierenzellkarzinom ist mit einer Häufigkeit von 75-80 % das häufigste Karzinom, wohingegen das papilläre Nierenzellkarzinom (10-15 %) und das chromophobe Nierenzellkarzinom (5 %) seltener zu beobachten sind (Mejean et al. 2003; Cairns 2010). Das mittlere Erkrankungsalter des Nierenzellkarzinoms liegt bei 72 Jahren für Frauen und 68 Jahren für Männer (Kaatsch et al. 2015).
Beim papillären Nierenzellkarzinom liegt das Erkrankungsalter zwischen 52 und 66 Jahren und das Geschlechterverhältnis (M:F) erstreckt sich von 2:1 bis 3:1 (Delahunt und Eble 1997; Ross et al. 2012).
Die Inzidenz des Nierenzellkarzinoms unterliegt weltweit einer hohen Variation.
Während sie in Europa und Nord-Amerika hoch ist, wird sie in Asien und Afrika niedrig beziffert. Deutschland liegt weltweit bei Männern auf Platz fünf und bei Frauen auf Platz neun (Kaatsch et al. 2015).
Das Nierenzellkarzinom wird in Deutschland bei Erstdiagnose mit einer Häufigkeit von 74-77 % vor allem in den frühen Stadien (pT1 und 2) erkannt (Kaatsch et al.
2015). Etwa ein Drittel aller Patienten mit Nierenzellkarzinomen weisen bei der Erstvorstellung ein lokal fortgeschrittenes Karzinom (pT3 und 4) oder Metastasen auf (Cairns 2010; Kaatsch et al. 2015).
2 Der wichtigste Faktor zur Einschätzung der Prognose ist das TNM-Stadium (Ljungberg et al. 1999; Delahunt et al. 2007). Abhängig vom Stadium bei Erstdiagnose und vom histologischen Subtyp liegt die 5-Jahres-Überlebensrate in Deutschland bei etwa 76-78 % (Kaatsch et al. 2015). Es ist anzumerken, dass die 5-Jahres-Überlebensrate mit circa 90 % bei dem sporadischen, lokal begrenzten papillären Nierenzellkarzinom günstiger ist als bei dem klarzelligen Nierenzellkarzinom (circa 70 %) (Cheville et al. 2003; Cohen und McGovern 2005;
Delahunt et al. 2007). Metastasierte oder fortgeschrittene Nierenzellkarzinome von papillärem und klarzelligem Typ dagegen weisen beide nur eine circa 10 %ige Überlebensrate über 5 Jahre und ein mittleres Überleben von 13 Monaten auf (Patard et al. 2005; Delahunt et al. 2007; Cairns 2010). Das chromophobe Nierenzellkarzinom hat von allen Typen die beste Prognose mit einer 5-Jahres- Überlebensrate von 80-100% (Amin et al. 2002; Cheville et al. 2003). Zudem ist festzuhalten, dass die Mortalität aufgrund der stetig verbesserten diagnostischen Bildgebung sinkt, da die Diagnose in früheren Stadien gestellt werden kann (Chow et al. 2010).
1.1.2 Ätiologie
Die wichtigsten Ursachen für das Entstehen eines Nierenzellkarzinoms sind der Nikotinkonsum, der Bluthochdruck und das Übergewicht.
Es besteht eine Dosis-Wirkung-Beziehung zwischen vermehrtem Zigaretten- konsum und erhöhtem Risiko für ein Nierenzellkarzinom (Hunt et al. 2005;
McGuire und Fitzpatrick 2011). Bei männlichen Rauchern erhöht sich das Risiko um 50 %, bei weiblichen Rauchern um 20 %, im Laufe des Lebens, an einem Nierenzellkarzinom zu erkranken. Einige Studien beobachteten bei steigendem Blutdruck eine Risikoerhöhung für das Auftreten des Nierenzellkarzinoms.
Wahrscheinlichste Ursache der Risikoerhöhung seien chronische Hypoxie der Niere sowie Fett-Peroxidation mit Entstehung von freien Radikalen (Chow et al.
2010).
In mehreren prospektiven und retrospektive Studien mit unterschiedlichen Populationen wurde ein positiver Zusammenhang zwischen dem Body Mass Index und dem Risiko für Nierentumoren beschrieben (Eble et al. 2004; Murai und Oya
3 2004; Chow et al. 2010; McGuire und Fitzpatrick 2011). Adipöse Patienten erkrankten doppelt so häufig wie normalgewichtige Patienten (Eble et al. 2004). Es wird geschätzt, dass in Europa etwa ein Drittel der Nierentumoren beider Geschlechter durch unter anderem extremes Übergewicht bedingt ist (Chow et al.
2010; McGuire und Fitzpatrick 2011).
Neben diesen Hauptursachen tragen auch unterschiedliche Vorerkrankungen der Niere, wie die erworbene Zystenniere, chronische Niereninsuffizienz im Endstadium mit Hämodialyse oder Nierentransplantation sowie die langjährige Exposition mit karzinogenen Stoffen wie Arsen, Cadmium, Pestizide und Pilzgifte zu einer erhöhten Inzidenz des Nierenzellkarzinoms bei (Eble et al. 2004).
Schließlich sind hereditäre Nierenzellkarzinome bekannt, von denen das klarzellige Nierenzellkarzinom bei Von-Hippel-Lindau-Syndrom, mit einer Penetranz von über 90 % ab dem 65. Lebensjahr, die häufigste Form darstellt (Lonser et al. 2003; Sudarshan et al. 2007). Daneben werden das Birt-Hogg-Dubé und die tuberöse Sklerose mit chromophobem Nierenzellkarzinom, das hereditäre papilläre Nierenzellkarzinom vom Typ 1 und das hereditäre papilläre Nierenzellkarzinom vom Typ 2 mit Leiomyomatose beschrieben (Schmidt et al.
1997; Zbar et al. 2002; Toro et al. 2003; Hartmann et al. 2010; Behnes et al.
2013).
1.2 Klinik, Diagnostik und Therapie
50 % der Patienten mit Nierenzellkarzinomen sind bei der Erstdiagnose symptomfrei und werden im Rahmen anderer Untersuchungen zufällig entdeckt.
Die Symptome treten meist erst spät auf und schließen Flankenschmerz, schmerzlose Makrohämaturie, tastbaren abdominellen Tumor oder para- neoplastische Symptome mit ein. Typische B-Symptomatik wie Gewichts-verlust, unklares Fieber, Nachtschweiß, Anämie und Abgeschlagenheit können auftreten.
Metastasen-bedingte Symptome entsprechen den Prädilektionsstellen, wie beispielsweise tastbare Knoten am Hals bei zervikalem Lymphknotenbefall, Knochenschmerzen bei Skelettmetastasen und neurologische Ausfälle bei zentralnervöser Beteiligung.
4 Da das Nierenzellkarzinom in früheren Stadien mit kleinerer Masse im Ultraschall oft Isoechogenität im Vergleich mit normalem Nierengewebe aufweist, wird der Tumor leicht übersehen. Mittels Computertomografie des Abdomens mit intravenöser Kontrastmittelgabe können in der Regel Nierenzellkarzinome mit einer charakteristischen Kontrastmittelanreicherung näher charakterisiert und ihre Ausbreitung in das umliegende Gewebe sowie in lokale Lymphknoten beschrieben werden.
Die Therapie des Nierenzellkarzinoms besteht nach aktuellen Leitlinien aus dem Jahre 2015 bei lokalen Stadien (pT1-2, < 7 cm Tumorausdehnung) aus einer partiellen Nephrektomie mit dem Ziel der R0-Resektion.
In fortgeschrittenen Stadien stellt die operative Totalresektion der Niere mit gegebenenfalls Resektion der Nebenniere und der regionalen Lymphknoten die Therapie der Wahl dar. Neoadjuvante oder adjuvante Therapien werden in nicht- metastasierten Stadien aufgrund der erhöhten Komplikationsrate nicht durchgeführt. Der Beginn einer Systemtherapie ist vom Risikoprofil des Patienten abhängig. In fortgeschrittenen Stadien mit oder ohne Metastasierung und geringem oder intermediärem Risiko werden als Erstlinientherapie vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor-Inhibitoren wie beispielsweise Sunitinib empfohlen, welche die Vaskularisierung und damit die Nährstoffzufuhr zum Tumor unterdrücken. Bei ungünstigem Risikoprofil wird beispielsweise Temsirolismus eingesetzt, welches über Hemmung des mTOR-Proteins (mammalian target of rapamycin) die Proliferation und das Wachstum der Zelle reduziert (Laplante und Sabatini 2012). Beim multipel metastasierten Nierenzellkarzinom kann Interleukin- 2 gegeben werden. Eine adjuvante Strahlentherapie wird aufgrund fehlenden Einflusses auf das Gesamtüberleben nicht durchgeführt (Leitlinie Nierenzellkarzinom 2017).
1.3 Histologische Subtypen und Klassifizierung
Die Karzinome der Niere werden in histologische Subtypen eingeteilt und entstehen aus den verschiedenen epithelialen Zelltypen, die entlang der Nephrone lokalisiert sind. Das klarzellige und das papilläre Nierenzellkarzinom entstehen aus den Epithelzellen des proximalen Tubulus, wohingegen sich das chromophobe
5 Nierenzellkarzinom, das Onkozytom und das Karzinom des Sammelgangs aus dem distalen Tubulus entwickeln (Mejean et al. 2003; Cairns 2010). Selten können sich einzelne Subtypen gleichzeitig in einer Niere bilden. Tabelle 1 zeigt die Häufigkeiten der einzelnen Subtypen.
Das Nierenzellkarzinom tritt typischerweise unifokal und unilateral auf. In 10-15 % der Fälle entwickelt es sich multifokal in einer Niere oder auch bilateral, was beim papillären Nierenzellkarzinom häufiger als beim klarzelligen Nierenzellkarzinom zu beobachten ist (Mejean et al. 2003; Cairns 2010).
Die Klassifikation der Nierenzellkarzinome erfolgt nach UICC (Union internationale contre le cancer) anhand der Größe und Ausbreitung des Tumors. In Tabelle 2 sind die einzelnen Stadien der Klassifikation nach UICC aufgeführt.
Eine internationale Einteilung ist auch das Gradingsystem nach ISUP (International Society of Uropathology, G1-4), welches Kerngröße, Kernmorphologie, mitotische Aktivität sowie Ähnlichkeit zum Ursprungsgewebe berücksichtigt (Srigley et al. 2013).
Tabelle 1: WHO-Klassifikation der histologischen Typen und Subtypen des Nierenzellkarzinoms (Lopez-Beltran et al. 2006)
Tumortyp Häufigkeit
Klarzelliges Nierenzellkarzinom 75 %
Papilläres Nierenzellkarzinom 10 %
Typ 1 ca. 60%
Typ 2 ca. 35%
Chromophobes Nierenzellkarzinom 5 %
Sammelgang-Karzinom (Ductus-Bellini-Karzinom) 1 % Multilokulär-zystisches Nierenzellkarzinom < 1 % Neuroblastom-assoziierte Nierenzellkarzinome < 1 % Muzinös-tubuläres und spindelzelliges Nierenzellkarzinom < 1 %
Undifferenzierte Karzinome 4 – 6 %
6
Tabelle 2: TNM-Stadien nach UICC (Wittekind 2010)
Tx Primärtumor kann nicht beurteilt werden T0 Kein Anhalt für Primärtumor
T1 Tumor </= 7 cm in größter Ausdehnung, begrenzt auf die Niere T1a Tumor 4 cm oder weniger in größter Ausdehnung
T1b Tumor > 4 cm, aber < 7 cm in größter Ausdehnung
T2 Tumor > 7 cm in größter Ausdehnung, begrenzt auf die Niere T2a Tumor > 7 cm – 10 cm, begrenzt auf die Niere
T2b Tumor > 10 cm, begrenzt auf die Niere
T3 Tumor infiltriert größere Venen, Nebenniere oder perirenale Invasion
T3a Tumor infiltriert Nierenvene oder perirenale Fettkapsel, aber nicht Gerota´sche Faszie
T3b Tumorausbreitung in Hohlvene unterhalb des Zwerchfells T3c Tumorausdehnung in Hohlvene oberhalb des Zwerchfells
T4 Tumorausdehnung über Gerota´sche Faszie hinaus oder ipsilaterale Nebenniere
NX Benachbarte (regionäre) Lymphknoten sind nicht beurteilbar N0 Kein Anhalt für Metastasen in benachbarten Lymphknoten N1 Metastase in einem benachbarten Lymphknoten
N2 Metastasen in mehr als einem benachbarten Lymphknoten MX Vorliegen von Fernmetastasen kann nicht beurteilt werden M0 Kein Anhalt für Fernmetastasen
M1 Fernmetastasen in Lunge, Skelett, Lymphknoten, Gehirn und Leber
1.4 Papilläre Nierenzellkarzinome
Das im Fokus dieser Untersuchung stehende papilläre Nierenzellkarzinom stellt die zweithäufigste Variante unter den Nierenzellkarzinomen dar.
Makroskopisch wird das papilläre Nierenzellkarzinom zumeist als hämorrhagisch, nekrotisch oder zystisch beschrieben. Bei lokalen gut abgrenzbaren Stadien kann es von einer bindegewebigen Pseudokapsel umgeben sein (Delahunt und Eble 1997).
7 Mikroskopisch unterteilt sich das papilläre Nierenzellkarzinom anhand morphologischer Kriterien in zwei Subtypen, die sich auch hinsichtlich Malignität und Prognose unterscheiden.
Papilläre Nierenzellkarzinome vom Typ 1 haben eine Inzidenz von 52-70 % (Waldert et al. 2008). Morphologisch präsentieren sie sich streng einreihig, haben einen basophilen, dünnen Zytoplasmasaum und weisen keine Nukleolen oder atypische Mitosen auf. Die Papillen sind häufig infiltriert von Makrophagen, der Malignitätsgrad ist eher niedrig und die Prognose besser als bei Typ 2.
Papilläre Nierenzellkarzinome vom Typ 2 weisen eine Inzidenz von 30-38 % auf.
Charakteristisch sind große eosinophile Tumorzellen mit scheinbarer Mehrreihigkeit (Pseudostratifikation). Es finden sich atypische Mitosefiguren sowie Zellen mit unterschiedlicher Kerngröße, deutlichen Nukleolen und teilweise Nekrosen. Makrophagen sind selten zu beobachten (Delahunt und Eble 1997;
Waldert et al. 2008; Behnes et al. 2012; Ross et al. 2012).
Eine eindeutige Subtypisierung der papillären Nierenzellkarzinome kann anhand der beschriebenen morphologischen Kriterien nicht immer festgelegt werden. Es werden einige immunhistochemische Marker wie Cytokeratin 7, membranöses Mukoglykoprotein 1 und N-Cadherin herangezogen, um die Subtypisierung zu ermöglichen (Delahunt und Eble 1997; Perret et al. 2008; Bonsip und Bhalodia 2010; Behnes et al. 2012; Ross et al. 2012).
Zytogenetisch werden in lokal begrenzten papillären Nierenzellkarzinomen hauptsächlich kombinierte Trisomien von Chromosom 7 und 17 und eine Deletion von Chromosom Y beobachtet. In fortgeschrittenen Stadien der Erkrankung kommen gehäuft komplexere Mutationen vor (Kovacs 1993; Delahunt et al. 2001).
Das papilläre Nierenzellkarzinom kann bilateral, solitär und multifokal vorkommen (Lopez-Beltran et al. 2006). Delahunt und Eble berichten, dass in 40 % der papillären Nierenzellkarzinome Typ 1 und in 10,5 % der Typ 2 eine Multifokalität nachzuweisen ist, diese jedoch keine Auswirkung auf das Überleben haben soll (Dimarco et al. 2004).
8 1.5 Autophagie
Autophagie beschreibt ein System von verschiedenen Mechanismen, die zu einem Abbau und einer Wiederverwertung von zelleigenen veralteten Proteinen führt.
Autophagie ist ein Bestandteil der physiologischen Zellhomöostase, an der Proteasomen und Lysosomen beteiligt sind. Neben dem Abbau von degenerierten Proteinen im Ubiquitin Proteasom-System, werden durch das lysosomale System Makromoleküle und Proteinaggregate zur erneuten Energiebereitstellung abgebaut (Baba et al. 1994; Dunn 1994; Klionsky und Ohsumi 1999; Mehrpour et al. 2010).
Der Mechanismus der Autophagie kommt ubiquitär physiologisch in eukaryoten und prokaryoten Zellen vor und wird darüber hinaus auch als Antwort auf zellschädigende oder -belastende Ereignisse verstanden (Tsukada und Ohsumi 1993; Ohsumi 2001; Klionsky 2007). Durch die physiologisch vorkommende Autophagie wird eine ständige Qualitätskontrolle der intrazellulären Bestandteile gewährleistet (Mizushima und Levine 2010). Neueste Studien vermuten, dass durch Autophagie Adenosintriphosphat gewonnen werden kann (Loos et al. 2013).
Physiologisch spielt die Autophagie eine Rolle beim programmierten Zelltod Typ II, welcher aufgrund intrinsischer Aktivierung von mehrerer Faktoren und Enzymen entsteht und die Zelle von innen heraus abbaut. Anders als beim programmierten Zelltod Typ I, bei dem äußere Faktoren die Apoptose einleiten. Zum anderen ist die Autophagie bei der Differenzierung und Lebensverlängerung von Zellen beteiligt (Yue et al. 2003; Levine und Klionsky 2004; Yu et al. 2004; Boya et al.
2005; Reggiori und Klionsky 2005; Dalby et al. 2010). Aus diesem Grund kann man die Autophagie in eine zytoreduktiv-apoptotische sowie in eine zytoprotektive Autophagie einteilen.
Unter pathologischen Bedingungen übt die Autophagie verschiedene Funktionen aus. Man vermutet, dass die Autophagie einen Mechanismus zur Abwehr von pathogenen Keimen und Tumoren, aber auch einen Mechanismus der Überlebensstrategie von Tumoren darstellt (Levine und Klionsky 2004; Shintani und Klionsky 2004; Levine 2005; Reggiori und Klionsky 2005; Dalby et al. 2010).
Darüber hinaus wird eine Interaktion zwischen Autophagie und Invasion von Viren und Mikroorganismen diskutiert, wie beispielsweise des Mykobakterium tuberkulosis (Liang et al. 1998; Gutierrez et al. 2004; Tallóczy et al. 2006).
9 Es wird zwischen Mikroautophagie, Chaperon-vermittelte Autophagie und Makroautophagie unterschieden. Die verschiedenen Formen unterscheiden sich hinsichtlich des Weges, auf dem die abzubauenden Proteine in das Lysosomen transportiert werden.
Mikroautophagie beschreibt einen Prozess, bei dem Zellorganellen direkt durch Einstülpung der lysosomalen Membran eingeschlossen werden (Mortimore et al.
1988; Klionsky und Ohsumi 1999; Levine und Klionsky 2004). Dagegen werden bei der Chaperon-vermittelten Autophagie Zellbestandteile durch Stimulierung von Chaperonen in Lysosomen zur anschließenden Proteolyse eingeschleust (Dice 2014). Die Makroautophagie implementiert eine Aufnahme von beschädigten Zellorganellen aus dem Zytoplasma in das Autophagosom und den anschließenden Transport in das Lysosom (Baba et al. 1994; Ohsumi 2001;
Reggiori und Klionsky 2002). In der vorliegenden Dissertation wurde das Augenmerk auf die Makroautophagie gelegt, da ihr in zahlreichen Studien ein Einfluss auf Tumoren zugesprochen wird.
1.5.1 Molekularer Mechanismus der Makroautophagie
Das autophagale System wurde erstmals durch Christian de Duve im Jahre 1955 beschrieben. Die experimentelle Erforschung des molekularen Mechanismus begann an Hefezellen in den 1990er Jahren (Baba et al. 1994; Thumm et al. 1994;
Tsukada und Ohsumi 1993; de Duve et al. 1955).
Molekularbiologisch ist bekannt, dass das Autophagosom durch eine Absonderung der sogenannten Phagophore oder aus einer isolierten Doppelmembran entsteht, die einen Teil des Zytoplasmas sowie beschädigte Zellorganellen umgibt und verschließt. Die äußere Membran verschmilzt am Ende mit Lysosomen, die die benötigten Enzyme für den Abbau liefern (Abbildung 1) (Ohsumi 2001; Sugawara et al. 2004; Reggiori und Klionsky 2005; Klionsky 2007).
Die neu entstandenen Moleküle werden durch die Membran über Kanäle freigesetzt und von der Zelle erneut verwendet. Durch Fusion des Autophagosoms und eines Endosoms entsteht ein Amphisom, welches einen heterophagischen Prozess darstellt, da es zelleigene und zellfremde Bestandteile mit einschließt (Klionsky und Ohsumi 1999; Klionsky 2007).
10 Bisherige Studien an der Hefe Saccharomyces cerevisiae konnten mehr als 30 an der Autophagie beteiligte Gene (ATG, autophagy-related gene) aufdecken, von denen 20 Gene ebenfalls eine Rolle in der Entstehung der Autophagie beim Menschen spielen (Tsukada und Ohsumi 1993; Thumm et al. 1994; Loos et al.
2013; Choi et al. 2014).
Abbildung 1: Entstehung des Autophagosoms (modifiziert nach Reggiori und Klionsky 2005). Die Verwendung erfolgt mit freundlicher Genehmigung des Elsevier-Verlags.
Die in unserer Studienarbeit relevanten Proteine, das Beclin-1, die light chain 3 (LC3) und das Rezeptorprotein p62, haben in den letzten Jahren im Zusammenhang mit der Autophagie vermehrt Aufmerksamkeit in der heutigen Forschung erhalten, auf die nachfolgend eingegangen wird.
Beclin-1 stammt aus dem Tumorsuppressorgen ATG6, das sowohl für die Apoptose als auch für die Autophagie in der Zelle verantwortlich ist. Es ist zu Beginn der Autophagie an der Formation einer isolierten Doppelmembran und an der Phagosombildung beteiligt (Pattingre et al. 2005; Miracco et al. 2007; Axe et al. 2008). Der Ursprung der Doppelmembran ist noch ungeklärt. Diskutiert werden Ursprungsorte wie endoplasmatisches Retikulum, Plasmamembran, Golgi-Apparat und Mitochondrium (Eskelinen 2008). Nach Mutation im Beclin-1-
Zell-
Bestandteile Autophagosom
Lysosom
Formation und Phagophorenbildung Isolierte
Doppelmembran
Verlängerung der Doppelmembran und Verschluss
Fusion mit Lysosom und Abbau des Autophagosoms
11 Tumorsuppressorgen kommt es zu einer verminderten Expression des physiologisch vorkommenden Beclin-1 oder zu einer Expression von verändertem Beclin-1 und damit zu einer gestörten Autophagie, die einst zytoreduktiv oder zytoprotektiv wirkte (Yue et al. 2003; Pattingre et al. 2005). Im Falle eines verminderten Nachweises von Beclin-1 in fortgeschrittenen Tumorzellen wird die Funktion von Beclin-1 häufig als zytoreduktiv interpretiert (Shintani und Klionsky 2004; Hao et al. 2014).
Das Mikrotubuli-assoziierte Protein LC3 kommt bei ausreichender Nährstofflage zytoplasmatisch vor (LC3-I) (Kabeya et al. 2000). Unter mangelnder Versorgung wird LC3 mithilfe von anderen autophagalen Proteinen an die innere und äußere Membran im Autophagosom gebunden (LC3-II). LC3 verbindet und verlängert in Zusammenarbeit mit einem an der Autophagie beteiligten Protein-Komplex kleinere Vesikel an die durch Beclin-1 entstandene Doppelmembran, die die Zellbestandteile umgibt, bis eine bläschenartige Phagophore entsteht (Ichimura et al. 2000; Kirisako et al. 2000; Ohsumi 2001; Kabeya et al. 2004; Sugawara et al.
2004; Deng et al. 2013). LC3-II ist das erste Protein, das in der Membran des Autophagosoms in Säugetieren gefunden wurde. Das membranständige Protein LC3-II entspricht in unserer Studienarbeit LC3. Es korreliert mit der Menge an Autophagosomen und spiegelt somit dessen Aktivität wider (Ichimura et al. 2000;
Kabeya et al. 2000; Kabeya et al. 2004).
p62 ist ein Autophagie-assoziiertes Rezeptorprotein, welches zytoplasmatisch sowie nukleär vorkommt, und sorgt für eine Aggregation der abzubauenden Zellbestandteile (Mathew et al. 2009; Choi et al. 2013; Gutierrez et al. 2014).
Durch die Bindung von LC3 an p62 können der selektive Transport und der Einschluss der abzubauenden Proteine aus dem Zellkern und aus dem Zytoplasma in das Autophagosom erfolgen. Nach Kopplung von p62 und LC3 im Zytoplasma kann die äußere Membran des Autophagosom mit dem Lysosom verschmelzen (Kim et al. 2014). Anschließend werden mithilfe der lysosomalen Enzyme die innere Membran des Autophagosoms aufgelöst und die Proteine abgebaut (Abbildung 1) (Klionsky 2007).
Im Falle einer Unterversorgung der Zelle, wie in Tumorzellen, kommt es zu einer Anhäufung von beschädigten Proteinen, welche mithilfe von p62 abgebaut und wieder verwertet werden können (Mathew et al. 2009).
12 1.6 Zielsetzung
Ziel dieser Doktorarbeit war es, die Rolle der Autophagie in papillären Nierenzellkarzinomen darzustellen.
Folgende Aspekte sollten charakterisiert werden:
1. Morphologische, pathologische und prognostische Unterschiede zwischen papillärem Nierenzellkarzinom Typ 1 und 2.
2. Expression von Beclin-1, LC3 und p62 in papillären Nierenzellkarzinomen unter Berücksichtigung der morphologischen Subtypen.
3. Beziehung zwischen klinischen/pathologischen Parametern (Typ 1 und 2, TNM-Stadien, Grading) und Expression der oben genannten Autophagie-assoziierten Proteine.
4. Einfluss der Autophagieaktivität auf das absolute und remissionsfreie Überleben in papillären Nierenzellkarzinomen.
13
2 Material und Methoden
2.1 PatientenkollektivFür diese retrospektive Studie wurden 38 Patienten herangezogen, die in dem Zeitraum von Jahr 2003 bis Jahr 2015 in der urologischen Abteilung der Universitätsklinik Göttingen an einem papillären Nierenzellkarzinom operiert wurden.
Es liegen schriftliche Einverständniserklärungen der Patienten vor, die zum Zeitpunkt der Studie noch gelebt haben, zur Nutzung der Präparate sowie der Patienteninformationen.
2.2 Untersuchungsmaterial
Die Tumorpräparate wurden in der Abteilung Pathologie der Universitätsmedizin Göttingen anhand von Paraffinblöcken und Schnittpräparaten in Typ und Subtyp des Nierenzellkarzinoms eingeteilt und nach TNM-Stadien und Grading klassifiziert. Einige ältere Tumoren mussten an die neue Klassifizierung nach UICC angepasst werden. In Tabelle 3 findet sich eine Aufstellung der hier untersuchten Tumoren. Es wurden alle Patientenakten durchgesehen und hinsichtlich nachfolgender Kriterien analysiert. Neben Alter bei Erstdiagnose und Geschlecht des Patienten wurden pTNM-Stadium, Typisierung und Grading des papillären Nierenzellkarzinoms, vorhandene Metastasen, gesamte Überlebenszeit und remissionsfreies Überleben dokumentiert. Darüber hinaus wurden der letzte Patientenkontakt und die Anzahl der verstorbenen Patienten bis zum Studienende festgehalten.
14
Tabelle 3: Pathologische Kenndaten des untersuchten Tumorgewebes (papilläres Nierenzellkarzinom Typ 1 und 2, T-Stadien und Grading)
Fall Typ T-Stadium Grading
1 2 3b 3
2 1 2a 2
3 2 4 2
4 1 1a 1
5 2 3b 3
6 2 3a 2
7 2 3b 3
8 1 1b 2
9 1 2a 2
10 1 1b 2
11 2 1a 2
12 1 1a 1
13 1 1b 2
14 2 1b 2
15 1 1a 2
16 1 1b 1
17 1 1b 1
18 1 1b 2
19 1 1a 2
20 1 1b 1
21 1 1a 1
22 1 2a 2
23 2 3a 2
24 1 3a 2
25 1 1a 2
26 1 1a 2
27 2 3b 3
28 1 1b 2
29 1 1b 1
30 1 1a 1
31 1 1a 1
32 2 1b 2
33 1 1a 2
34 1 1b 2
35 1 1a 2
36 1 1a 2
37 1 1b 2
38 1 1a 2
15 2.3 Untersuchung am Tumorgewebe
2.3.1 Tissue Microarrays (TMA)
Es wurden jeweils zwei 2 mm dicke Stanzen (Biopsie-Stanze, pfmmedical ag, 50996 Köln) aus den Gewebeproben entnommen, welche dann in den auf 37 °C aufgewärmten Empfängerblock (Tissue-Tek Prisma, Staufen, Germany) überführt wurden. So konnten mehrere Proben auf einem Block in einer vorher festgelegten Reihenfolge angebracht werden. Anschließend wurde der TMA-Block bei 50 °C für circa 2 Stunden in einer Ausgießform im Wärmeofen (Memmert) erwärmt, sodass die Gewebestanzen sich mit dem Paraffin des Empfängerblockes verbanden.
Darauf erfolgte das standardisierte Ausgießen des Paraffins in eine Gewebekapsel.
2.3.2 Präparation der Paraffinschnittpräparate
Schnittpräparate von 2 µm Gewebedicke wurden mit einem Schlittenmikrotom (Mikrom HM 430, Firma Thermo Fisher Scientific, 64292 Darmstadt, Deutschland) angefertigt, in einem ca. 20 °C kalten Wasserbad aufgefangen und gestreckt. Die Schnitte wurden auf einen beschichteten Objektträger glatt aufgezogen und abschließend bei 45 °C auf einem Strecktisch getrocknet (Strecktisch, Vogel ST 893, Vogel GmbH & Co., 35463 Fernwald).
2.3.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Alle Schnittpräparate wurden zur Darstellung der Tumormorphologie und zur Einteilung des Malignitätsgrades standardisiert und automatisiert (Tissue-Tek Prisma, Staufen, Germany) mittels der Hämatoxylin-Eosin-Färbungsmethode gefärbt. Zur Kerndarstellung wurden die histologischen Präparate mit Mayers Hämalaun und zur Zytoplasmadarstellung mit Eosin gefärbt. Nach Dehydratation in alkoholischen Lösungen in aufsteigender Konzentration wurden die Schnittpräparate mittels Cytoseal™ XYL Mounting Medium (Richard-Allan Scientific®, Kalamazoo) mit Xylol eingedeckt.
16 2.4 Immunhistochemie und Primärantikörper
Alle Inkubationsschritte wurden in einer feuchten Kammer und, wenn nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchgeführt. Die verwendeten Antikörper, deren Verdünnungen und Inkubationszeiten sowie Vorbehandlung der Schnittpräparate werden in der Tabelle 4 erläutert.
Die Demaskierung der durch Formalinfixation maskierten Antigene erfolgte in einem Dampfgarer (B. Braun, Melsungen) mit Citrat-Puffer (pH-Wert 6,0) über 15 min bei 700 Watt. Nach 20-minütiger Abkühlung wurde die endogene Peroxidaseaktivität mit dreiprozentigem Wasserstoffperoxid (Merck, Darmstadt) blockiert. Unspezifische Antikörperbindungen und unspezifische Färbungen wurden durch Applikation einer Puffersubstanz namens Tris (TBST®) mit einem pH-Wert von 7,4 und 0,5-prozentigen fötalem Kälberserum geblockt. Die Detektion der Primärantikörper erfolgte mit EnVision-Peroxidase™ (Dako, Hamburg) und rotem Substrat Kit (Fast-red, Dako Cytomation, Hamburg) beziehungsweise einem blau-violetten Peroxidase-Substrat Kit namens Vector® VIP (Vector Laboratories, Burlingame). Nach Abschluss der Färbereaktion mit entionisiertem Wasser wurde das Gewebe mit Mayers Hämalaun gegengefärbt und nach Dehydrierung mit Cytoseal™ XYL Mounting Medium (Richard-Allan Scientific®, Kalamazoo) mit Xylol eingedeckt.
17
Tabelle 4: Antikörper und Färbeprotokoll (RT = Raumtemperatur).
Anti- körper
Klon Quelle Vorbe-
handlung
Ver- dünnung
Inkubation
Ki-67 K-2 (Maus) Zytomed Systems, Berlin, Deutschland
Zitratpuffer pH 6.0
1:200 30 min RT
Beclin-1 EPR17334 (Kaninchen)
Abcam, Cambridge, Großbritannien
Zitratpuffer pH 6.0
1:100 30 min RT
p62 SQSTM1
(Maus)
Abcam, Cambridge, Großbritannien
Zitratpuffer pH 6.0
1:100 30 min RT
LC3 polyclonal (Kaninchen)
Abcam, Cambridge, Großbritannien
Zitratpuffer pH 6.0
1:50 30 min RT
2.5. Morphometrische Untersuchung
Die Untersuchungen der gefärbten Schnittpräparate wurden unter Anleitung und Kontrolle durch einen erfahrenen Pathologen hinsichtlich des Immunreaktiven- Scores nach Allred (IRS) und des Expressionsmusters an einem Diagnostiklichtmikroskop (BX 41, Olympus, Hamburg) durchgeführt.
2.6. Immunreaktiver Score
Bei der semiquantitativen Beurteilung der immunhistochemischen Präparate, angefärbt mit den Antikörpern Ki-67, Beclin-1, p62 und LC3, wurde der IRS herangezogen. Dieser ist die Summe aus dem prozentualen Anteil positiver Zellen und der Farbintensität und reicht von 0 bis 8 (Tabelle 5).
18
Tabelle 5: Immunreaktiver Score: Intensität der Zellsignale
Punkte Anteil positiver Zellen (%) Intensität der Anfärbung
0 0 keine
1 < 1 schwach
2 1-10 mäßig
3 11-33 stark
4 34-66
5 67-100
2.7 Statistik
Die Daten wurden mit Excel 2010 und Statistica Version 13 für Windows (StatSoft, Inc. 19847-2011, Tulsa, OK 74104, USA) dokumentiert, statistisch berechnet und analysiert. Für die Entscheidung über die statistische Auswertung der erhobenen Daten wurde die medizinisch-statistische Beratung der Universität Göttingen in Anspruch genommen. Die Berechnung und Deutung der Daten erfolgten selbständig.
Das T-Stadium musste zur Vereinfachung der Berechnung durch eine Nummerierung von 1-4 und durch eine Kodierung, gekennzeichnet durch pT*, angepasst werden (pT*: pT1(a,b) = 1, pT2(a,b) = 2, pT3(a,b,c) = 3, pT4 = 4).
Bei den statistischen Tests wurde der p-Wert ermittelt, wobei eine Signifikanz bei p
< 0.05 erreicht war.
Für jede immunhistochemische Beurteilung wurde der Median des IRS gebildet.
Dieser diente als Trenn- bzw. Schwellenwert für die Unterteilung in hohe und niedrige Expression (2 Gruppen: 0 < Median, 1 =/> Median). Diese Unterteilung wurde ebenfalls bei Ki-67, Beclin-1, LC3 sowie p62 angewendet und wurde mit folgenden Symbolen gekennzeichnet: Ki-67*, Beclin-1*, LC3*, p62*.
Zum Vergleich der Daten (TNM, Grading und Protein-Expression) mit papillärem Nierenzellkarzinom Typ 1 und 2 (in Tabellen und Graphiken mit Typ 1 und 2 gekennzeichnet) wurde der Mann-Whitney-U-Test verwendet. Die Korrelation zwischen der Protein-Expression und den klinisch-pathologischen Parametern wurde durch den Kendalls Tau-Test bei einem Signifikanzniveau p= 0,05 ermittelt.
Das Gesamtüberleben (overall survival = OS) wurde als die Zeit von Erstdiagnose bis zum Versterben oder letzter Patientenkontakt definiert. Das remissionsfreie
19 Überleben (disease-free survival = DFS) dagegen stellt die Zeit zwischen Erstdiagnose und Rezidiv dar. Unzensiert waren die vollständig erfassten Überlebenszeiten, bei denen in der OS-Gruppe das Versterben und bei der DFS- Gruppe ein Rezidiv auftrat. Zensierte Überlebenszeiträume endeten mit dem zuletzt erfassten Patientenkontakt. Ein Tod oder ein Rezidiv wurden in dieser Gruppe nicht festgestellt oder waren nicht bekannt. Das OS und DFS wurden durch die Kaplan-Meier-Kurve graphisch dargestellt und mittels des Log-Rank- Tests konnte ein Vergleich zwischen zwei Gruppen berechnet werden.
20
3 Ergebnisse
3.1. Klassifizierung und Subtypisierung
Die Klassifizierung und Subtypisierung der Tumorgewebe unserer Patienten ergab keine Fehlanalyse der bereits dokumentierten pathologischen Auswertung. Bei einigen älteren Tumoren musste die Einteilung an die neue UICC-Klassifikation angepasst werden. In Abbildung 2 und 3 sieht man einen Ausschnitt aus einem Schnittpräparat der HE-Färbung der einzelnen Subtypen des papillären Nierenzellkarzinoms mit der typischen Morphologie. Tabellen 3 und 6 führen unsere Ergebnisse auf. Von allen getesteten Personen waren bei Erstdiagnose der jüngste Patient 31 und der Älteste 86 Jahre alt gewesen. Das mediane Erkrankungsalter der für die Studie herangezogenen Patienten mit papillärem Nierenzellkarzinom lag bei 65 Lebensjahren. 9 Fälle aus dem gesamten Patientenkollektiv wiesen bei Erstdiagnose Metastasen auf. Davon lagen bei 6 Patienten mehrere Lymphknoten- und bei 2 Patienten Organmetastasen vor.
Es konnte ein signifikant höheres T-Stadium in Typ-2- als in den Typ-1-Tumoren festgestellt werden (Mann-Whitney-U-Test: p= 0,000232, Abbildung 4a).
Bei der Unterscheidung zwischen Typ 1 und 2 zeigten sich bei Typ 2 mehr Lymphknotenmetastasen als bei Typ 1 (Mann-Whitney-U-Test: p= 0,000714, Abbildung 4b). Darüber hinaus beobachteten wir in Typ-2-Tumoren mehr Organmetastasen als bei Typ 1 (Mann-Whitney-U-Test: p= 0,018462), und es konnte bei Typ 2 ein signifikant höheres Grading nachgewiesen werden (Mann- Whitney-U-Test: p= 0,001092).
21
Abbildung 2: Ausschnitt aus einem Schnittpräparat: HE-Färbung, 20fache Vergrößerung, papilläres Nierenzellkarzinom Typ 1
Abbildung 3: Ausschnitt aus einem Schnittpräparat: HE-Färbung, 20fache Vergrößerung, papilläres Nierenzellkarzinom Typ 2
22
Tabelle 6: Pathologische Kenndaten: Häufigkeitsverteilung der TNM-Stadien in Abhängigkeit von den Subtypen (Typ 1 und 2). Abkürzungen: n= Anzahl
Typ 1 Typ 2 Gesamt
n (Männer/Frauen) 28 (22/6) 10 (8/2) 38 (30/8) Durchschnittsalter
(Jahre) 62,7 63,2 62,8
n T1 (a/b) 24 (15/9) 3 (1/2) 27 (16/11)
n T2 (a/b) 3 (3/0) 0 3(3/0)
n T3 (a/b/c) 1 (1/0) 6 (2/4/0) 7 (3/4/0)
n T4 0 1 1
n Nx 27 5 32
n N1 1 0 1
n N2 0 5 5
n Mx 28 8 36
n M1 0 2 2
n G1 9 0 9
n G2 19 6 25
n G3 0 4 4
N G4 0 0 0
23
Abbildung 4: Histogramme: a) T-Stadium (1-4= pT*) gruppiert nach papillären Nierenzellkarzinom Typ 1 und 2 in Abhängigkeit von den beobachteten Fällen. Mann-Whitney-U-Test: p= 0,002320; b) N-Stadium (pN: 0=
pNx, 1= pN1, 2= pN2) gruppiert nach papillärem Nierenzellkarzinom Typ 1 und 2 in Abhängigkeit von den beobachteten Fällen. Mann-Whitney-U-Test: p= 0,023491.
a)
Histogramm
Variable: pT*, Gruppen: Typ 1 und 2
Anz. Beob.
Typ: 1
1 2 3 4
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Typ: 2
1 2 3 4
b)
Histogramm
Variable: pN, Gruppen: Typ 1 und 2
Anz. Beob.
Typ: 1
0 1 2
0 10 20 30 40 50 60
Typ: 2
0 1 2
24 3.2. Immunhistochemische Ergebnisse
Tabelle 7: Übersichtstabelle der Kendalls Tau-Korrelationen zwischen Autophagie-Marker und pTNM-Stadium und Grading. Signifikante Korrelationen (p< 0,05) sind rot markiert.
3.2.1 Ki-67
Das Ki-67-Protein wird von Zellen exprimiert, die sich in der in der G1-, S-, G2- oder in der M-Phase eines Zellzyklus befinden. Ki-67 ist ein Kernprotein und wird in der G0-Phase exprimiert. Es kann mittels eines Ki-67-Antikörpers angefärbt werden und zeigt somit die Proliferationsaktivität eines Tumors an. Diese wurde in Prozentwerten gemessen. Darüber hinaus lässt es Rückschlüsse auf das biologische Verhalten zu und wird meist in den prognostisch ungünstigen Tumoren vermehrt exprimiert.
Bei der Ki-67-Expression lag der mediane Prozentsatz bei 5%. In der vorliegenden Arbeit zeigte sich eine signifikant höhere Ki-67-Expression im papillären
Kendalls Tau-Korrelation
Markierte Korrelation signifikant ab p < 0,05 Variablenpaar
Gültige N
Kendalls Tau
Z p-Wert
Ki-67* & pT*
Ki-67* & pN Ki-67* & pM Ki-67* & G
Beclin-1 zytoplasmatisch* & pT * Beclin-1 zytoplasmatisch* & pN Beclin-1 zytoplasmatisch* & pM Beclin-1 zytoplasmatisch* & G Beclin-1 nukleär* & pT*
Beclin-1 nukleär* & pN Beclin-1 nukleär* & pM Beclin-1 nukleär* & G LC3* & pT*
LC3* & pN LC3* & pM LC3* & G
p62 zytoplasmatisch* & pT * p62 zytoplasmatisch* & pN p62 zytoplasmatisch* & pM p62 zytoplasmatisch* & G p62 nukleär* & pT*
p62 nukleär* & pN p62 nukleär* & pM p62 nukleär* & G
38 0,323378 2,85803 0,004263 38 0,574806 5,08017 0,000000 38 0,126773 1,12043 0,262532 38 0,430911 3,80842 0,000140 38 -0,087304 -0,77160 0,440354 38 -0,033795 -0,29869 0,765180 38 -0,248452 -2,19583 0,028104 38 0,061026 0,53935 0,589642 38 -0,425098 -3,75704 0,000172 38 -0,253164 -2,23747 0,025255 38 -0,291865 -2,57952 0,009894 38 -0,266357 -2,35408 0,018569 38 -0,086506 -0,76455 0,444540 38 0,111623 0,98653 0,323875 38 -0,109415 -0,96701 0,333538 38 0,158808 1,40355 0,160453 38 0,197889 1,74895 0,080300 38 0,405545 3,58423 0,000338 38 0,223607 1,97625 0,048127 38 0,504855 4,46193 0,000008 38 -0,331354 -2,92852 0,003406 38 -0,314618 -2,78061 0,005426 38 -0,346944 -3,06631 0,002167 38 -0,336703 -2,97580 0,002922
25 Nierenzellkarzinom Typ 2 als in Typ 1 (p= 0,000338). In Abbildung 5 ist der Vergleich der Ki-67-Antikörper-Färbung zwischen papillärem Nierenzellkarzinom Typ 1 und 2 als braune Anfärbung der Zellkerne zu sehen.
Eine signifikant positive Korrelation wurde zwischen dem Anteil Ki-67- exprimierender Tumorzellen und der Tumorgröße nach dem T-Stadium beobachtet (p= 0,004263, Kendalls Tau= 0,323378). Ferner zeigte sich eine signifikant höhere Ki-67-Expression bei Tumoren, die Lymphknoten aufwiesen (p= 0,000000, Kendalls Tau= 0,574806). Bei Auftreten von Fernmetastasen war eine nicht signifikante positive Korrelation festzustellen (p= 0,262532, Kendalls Tau=
0,126773).
Darüber hinaus ergab sich ein positiver Zusammenhang zwischen dem Anteil Ki- 67-exprimierender Tumorzellen und Grading eines Tumors (p= 0,000140, Kendalls Tau= 0,430911).
Abbildung 5: 1) Histogramm für niedrige (= 0) und hohe (= 1) Ki-67-Expression in papillären Nierenzellkarzinomen Typ 1 und 2. 2) Ausschnitte aus den Schnittpräparaten: Ki-67-Antikörper-Färbung in brauner Farbe, 20fache Vergrößerung, papilläres Nierenzellkarzinom Typ 1 und 2.
1)
Histogramm in Kategorien
Variable: niedrige (= 0) und hohe (= 1) Expression von Ki-67. Gruppen: Typ 1 und 2
Anz. Beob.
Typ: 1 0 1 0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Typ: 2 0 1
26
2) Typ 1
Typ 2
27 3.2.2 Beclin-1
Beclin-1 ist ein am Prozess der Autophagie beteiligtes Protein, welches für die Phagosombildung, insbesondere für die Bildung von isolierten Doppelmembranen in der Zelle, verantwortlich ist. Beclin-1 ist zum einen an der Apoptose und zum anderen an der Regulation der Autophagie beteiligt und kommt zytoplasmatisch sowie nukleär vor. Obwohl die Rolle von Beclin-1 als Bestandteil der Autophagie noch nicht bewiesen ist, vermutet man unter pathologischen Bedingungen eine zytoreduktive Wirkung, da es molekulargenetisch einem Tumorsuppressorgen entspricht.
Es konnte in allen papillären Nierenzellkarzinomen für die zytoplasmatische Be- clin-1-Expression ein Median von 7 und für die nukleäre Expression ein Median von 6 festgestellt werden, sodass man insgesamt von einer Hochregulation von Beclin-1 sprechen kann (Abbildung 6).
Abbildung 6: 1) Balkendiagramm: Beclin-1 zytoplasmatisch und nukleär in papillären Nierenzellkarzinomen.
Dargestellt ist die Proteinexpression nach dem IRS in Abhängigkeit von den beobachteten Fällen. 2) Ausschnitte aus den Schnittpräparaten: Beclin-1, zytoplasmatische sowie nukleäre Anfärbung, 20fache Vergrößerung, papilläres Nierenzellkarzinom Typ 1 und 2.
1)
Histogramm für multiple Variablen Beclin-1 zytoplasmatisch
Beclin-1 nukleär
Beclin-1 zytoplasmatisch Beclin-1 nukleär
3 4 5 6 7 8
IRS 0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Anz. Beob.
28
2) Legende: : zytoplasmatisch e Anfärbung : nukleäre Anfärbung
Typ 1
Typ 2
29 In Typ 1 zeigte sich für Beclin-1 zytoplasmatisch ein Median von 7, in Typ 2 ein Median von 6. Es ließ sich kein signifikanter Unterschied aufzeigen (p= 0,367872).
Bei der nukleären Beclin-1-Expression wurde ein Median von 7 in der Typ-1- Gruppe und ein Median von 5 in der Typ-2-Gruppe errechnet. Statistisch zeigte sich hier eine signifikant geringere Expression in Typ 2- als in Typ 1-Tumoren (p=
0,024408, Abbildung 7).
Es konnte eine signifikant negative Korrelation zwischen nukleäre Beclin-1- Expression und T-Stadium beobachtet werden (p= 0,001738, Kendalls Tau= - 0,354344, Abbildung 8). Bei niedriger nukleärer Beclin-1-Expression waren eher höhere T-Stadien und bei höherer nukleärer Beclin-1-Expression eher niedrigere T-Stadien zu beobachten. Der Zusammenhang zwischen zytoplasmatischer Beclin-1- Expression und Tumorgröße zeigte ebenfalls eine negative Korrelation, jedoch konnte keine ausreichende Evidenz festgestellt werden (p= 0,209827, Kendalls Tau= -0,141891). Bei Auftreten von Lymphknotenmetastasen war nicht signifikant weniger zytoplasmatisches Beclin-1 nachweisbar, jedoch signifikant weniger nukleäres Beclin-1 (zytoplasmatisch: p= 0,765180, Kendalls Tau= - 0,033795, nukleär: p= 0,025255, Kendalls Tau= -0,253163). Zusätzlich stellten wir eine signifikant negative Korrelation zwischen nukleärem und zytoplasmatischem Beclin-1 und pM-Stadium fest (zytoplasmatisch: p= 0,028104, Kendalls Tau= - 0,248452, nukleär: p= 0,009894, Kendalls Tau= -0,291865). Somit kann ein Lymphknoten- und Metastasennachweis mit geringerer Beclin-1-Expression in Zusammenhang gebracht werden. Außerdem konnte für die nukleäre Expression eine negative Korrelation zum Grading eines Tumors oberhalb des Signifikanzniveaus aufgezeigt werden (p= 0,001738, Kendalls Tau= -0,354344, Abbildung 9). Die zytoplasmatische Expression zeigte keinen signifikanten Zusammenhang zum Grading (p= 0,248743, Kendalls Tau= 0,130505).
30
Abbildung 7: 1) Balkendiagramm: niedrige (= 0) und hohe (= 1) nukleäre Beclin-1-Expression in papillären Nierenzellkarzinomen Typ 1 und 2. 2) Balkendiagramm: Beclin-1 nukleär in papillären Nierenzellkarzinomen Typ 1 und 2. Dargestellt ist die Proteinexpression nach dem IRS in Abhängigkeit von den beobachteten Fällen. p=0,004868.
1)
Histogramm
Variable: niedrige (= 0) und hohe (= 1) nukleäre Beclin-1 Expression, Gruppen: Typ 1 und 2
nukleäre Beclin-1 Expression
Anz. Beob.
Typ: 1 Typ: 2
0 1
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
2)
Histogramm
Variable: Beclin-1 nukleär nach dem IRS
Beclin-1 nukleär - IRS
Anz. Beob.
Typ: 1 Typ: 2
3 4 5 6 7 8
0 2 4 6 8 10 12
31
Abbildung 8: Korrelationsanalyse (Histogramm und Bubble-Plot) der nukleären Beclin-1-Expression nach dem IRS und dem T-Stadium (1-4= pT*) in papillären Nierenzellkarzinomen. p= 0,001738, Kendalls Tau= - 0,354344.
Bubble-Plot für Beclin-1 nukleär vs. pT*
Anzahl der beobachteten Fälle:
1 2 3 4 5 6 11
1 2 3 4
pT*
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Beclin-1 nukleär nach dem IRS
Abbildung 9: Korrelationsanalyse (Histogramm und Bubble-Plot) der nukleären Beclin-1-Expression nach dem IRS und dem Grading (1-3). P= 0,002321, Kendalls Tau= -0,322293.
Bubble-Plot f ür Beclin-1 nukleär v s. Grading
Anzahl der beobachteten Fälle:
1 2 3 7 9
0 1 2 3 4
Grading 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Beclin-1 nukleär nach dem IRS
32 3.2.3 Light chain 3
Light chain 3 (LC3) oder auch Mikrotubuli-assoziiertes Protein ist ein Marker für eine anhaltende Autophagie. Es ist für die Erweiterung und für den Zusammenschluss der Doppelmembran zum Autophagosom verantwortlich und befindet sich unter mangelnder Nährstoffversorgung jeweils an der inneren und äußeren Membran. Bei aktiven Umbauprozessen im Inneren des Autophagosoms ist LC3 der inneren Membran als Marker vermehrt nachweisbar. Unter pathologischen Bedingungen wie bei der Tumorentstehung wird eine zytoprotektive Wirkung von LC3 vermutet.
Nach immunhistochemischer Anfärbung sowie mikroskopischer Begutachtung mittels IRS konnte eine erhöhte Expression von LC3 in papillären Nierenzellkarzinomen Typ 1 sowie Typ 2 aufgezeigt werden (Abbildung 10). Der mediane IRS betrug 8. Bei der Unterteilung in Typ 1 und 2 zeigte sich kein signifikanter Unterschied der Expression (p= 0,486381).
Ebenfalls ergaben unsere Berechnungen keine ausreichende Evidenz für eine negative Korrelation zwischen LC3 und Höhe des T-Stadiums (p= 0,425967, Kendalls Tau= -0,090078). Im Zusammenhang mit einem Lymphknotenbefall stellte sich eine nicht signifikante positive Korrelation (p= 0,323875, Kendalls Tau=
0,111623), mit Auftreten von Metastasen eine nicht signifikante negative Korrelation (p= 0,333538, Kendalls Tau= -0,109415) und mit dem Grading eine nicht signifikante positive Korrelation heraus (p= 0,228707, Kendalls Tau=
0,136195).
33
Abbildung 10: 1) Balkendiagramm: LC3 in papillären Nierenzellkarzinomen. Dargestellt ist die Proteinexpression nach dem IRS in Abhängigkeit von der beobachteten Anzahl. 2) Ausschnitte aus den Schnittpräparaten: LC3-Anfärbung, 20fache Vergrößerung, papilläres Nierenzellkarzinom Typ 1 und 2
1)
Histogramm für LC3 (IRS) in Abhängigkeit von den beobachteten Fällen
5 6 7 8
IRS 0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Anz. Beob.
34
2) Typ 1
Typ 2
35 3.2.4 p62
Das Rezeptorprotein p62 tritt nukleär und zytoplasmatisch auf. Als Zellgerüst- Protein (zytoplasmatisch) stellt es die Verbindung zwischen den abzubauenden Proteinen aus dem Zytosol und dem Autophagosom her. Nachdem es sich an LC3 der äußeren Membran des Autophagosoms gebunden hat, kommt es zu einem Verschmelzen mit der lysosomalen Membran. Nach Entkopplung steht p62 im Zytosol erneut zur Verfügung. Als Zellkern-Protein (nukleär) ermöglicht es den Transport von nukleären Proteinen zum zytoplasmatischen p62. Je mehr beschädigte Proteine abzubauen sind, desto mehr p62 kann nachgewiesen werden. Es kann somit als Marker für eine zytoprotektive Autophagie und deren Aktivität in Tumorzellen herangezogen werden. In unserer Arbeit haben wir in papillären Nierenzellkarzinomen sowohl eine nukleäre als auch zytoplasmatische Expression beobachtet und diese mittels IRS mikroskopisch beurteilt. Es zeigte sich für p62 sowohl zytoplasmatisch als auch nukleär ein medianer IRS von 7.
Abbildung 11 stellt die Häufigkeit in Abhängigkeit vom IRS dar.
Abbildung 11: Balkendiagramm: p62-Expression in papillären Nierenzellkarzinomen. Dargestellt ist die Proteinexpression nach dem IRS in Abhängigkeit von den beobachteten Fällen.
Histogramm für multiple Variablen p62 zytoplasmatisch
p62 nukleär
p62 zytoplasmatisch p62 nukleär
4 5 6 7 8
IRS 0
5 10 15 20 25 30 35
Anz. Beob.
36 Abbildung 12 zeigt mittels Balkendiagramm sowie fotographisch den signifikanten Unterschied zwischen den Subtypen bei der zytoplasmatischen und der nukleären Expression von p62. Es konnte ein signifikanter Unterschied bei der zytoplasmatischen Expression zugunsten von Typ 2 (p= 0,048455) und bei der nukleären Expression zugunsten von Typ 1 festgestellt werden (p= 0,001358).
Darüber hinaus zeigte sich eine signifikante negative Korrelation zwischen der Höhe des T-Stadiums und der nukleären p62 Expression (p= 0,003030, Kendalls Tau= -0,335442), jedoch konnte keine ausreichende Evidenz in der positiven Korrelationsanalyse der zytoplasmatische Expression und der Tumorgröße festgestellt werden (p= 0,080300, Kendalls Tau= 0,197889). Das pM-Stadium wies ein signifikante positive Korrelation zur zytoplasmatischen Expression und eine negative Korrelation zur nukleären Expression von p62 auf (zytoplasmatisch: p=
0,048127, Kendalls Tau= 0,223607, nukleär: p= 0,002167, Kendalls Tau= - 0,346944).
In Bezug auf das Grading stellte sich eine signifikant positive Korrelation zur zytoplasmatischen p62-Expression (p= 0,000280, Kendalls Tau= 0,411072) und eine signifikant negative Korrelation zur nukleären p62-Expression heraus (p=
0,000165, Kendalls Tau= -0,426324, Abbildung 13).
Abbildung 12: 1) Balkendiagramm: niedrige (= 0) und hohe (= 1) zytoplasmatische (a) und nukleäre (b) p62- Expression nach dem IRS in papillären Nierenzellkarzinomen Typ 1 und 2. 2) Ausschnitte aus den Schnittpräparaten: p62-Färbung, 20fache Vergrößerung, papilläres Nierenzellkarzinom Typ 1 und 2.
1a)
Histogramm
Variable: niedrige (= 0) und hohe (= 1) zytoplasmatische p62-Expression, Gruppen: Typ 1 und 2
Anz. Beob.
Typ: 1
0 1
p62 zytoplasmatisch 0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Typ: 2
0 1
p62 zytoplasmatisch
37
1b)
Histogramm
Variable: niedrige (= 0) und hohe (= 1) nukleäre p62-Expression, Gruppen: Typ 1 und 2
Anz. Beob.
Typ: 1
0 1
p62 nukleär 0
5 10 15 20 25 30
Typ: 2
0 1
p62 nukleär
2) Legende: : zytoplasmatisch e Anfärbung : nukleäre Anfärbung
Typ 1
