Etablierung einer reversen Genetik zur Charakterisierung des Oberflächen-Glykoproteins HEF des Influenza-C-Virus

(1)

Aus dem

INSTITUT F ¨ UR VIROLOGIE

ZENTRUM F ¨ UR INFEKTIONSMEDIZIN

der TIER ¨ ARZTLICHEN HOCHSCHULE HANNOVER

Etablierung einer reversen Genetik zur

Charakterisierung des Oberfl¨ achen-Glykoproteins HEF des Influenza-C-Virus

INAUGURAL-DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterin¨ armedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tier¨ arztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Birthe Larisch

aus Reinbek

Hannover 2003

(2)

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. Georg Herrler

1. Gutachter: Prof. Dr. Herrler 2. Gutachter: Prof. Dr. Gruber

Tag der m¨undlichen Pr¨ufung: 24.11.2003

(3)

Meinem Bruder, meinen Eltern und Torsten

So eine Arbeit wird eigentlich nie fertig, man muss sie für fertig erklären, wenn man nach Zeit und Umständen

das m¨oglichste getan hat.

(J. W. Goethe, Italienische Reise, 16. M¨arz 1787)

(4)

(5)

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 17

1.1 Influenza-C-Virus . . . 17

1.1.1 Taxonomie . . . 17

1.1.2 Klinik und Epidemiologie . . . 19

1.1.3 Morphologie und Genomstruktur . . . 20

1.1.4 Virusproteine . . . 23

1.1.5 Replikation . . . 27

1.2 Reverse Genetik bei Influenza-Viren . . . 29

1.3 Das Virus der Vesikul¨aren Stomatitis . . . 30

2 Zielsetzung 33 3 Material 35 3.1 Zelllinien . . . 35

3.2 Zellkulturmedien . . . 36

3.3 Bakterienkulturmedien . . . 38

3.4 Viren . . . 38

3.5 Erythrozyten . . . 38

(6)

3.6 Restriktionsenzyme und andere Enzyme . . . 39

3.7 L¨angenstandards . . . 39

3.8 Oligonukleotide/Primer . . . 40

3.9 Plasmide . . . 41

3.10 Antik¨orper . . . 41

3.11 Transfektionsreagenzien . . . 42

3.12 Substrate . . . 42

3.13 Kits . . . 42

3.14 Chemikalien . . . 43

3.15 Puffer und L¨osungen . . . 45

4 Methoden 51 4.1 Molekulare Methoden . . . 51

4.1.1 RNA-Isolierung . . . 51

4.1.2 Reverse Transkription . . . 51

4.1.2.1 Reverse Transkription mit anschließenderExpand^{T M} long template PCR . . . 52

4.1.2.2 Titan One Tube RT-PCR . . . 53

4.1.3 Polymerasekettenreaktion (PCR) . . . 55

4.1.3.1 Rekombinante PCR . . . 55

4.1.3.2 Mutagenese . . . 57

4.1.4 Reinigung der PCR-Fragmente . . . 58

4.1.5 Bestimmung der RNA-/DNA-Konzentration . . . 58

4.1.6 Spaltung der DNA mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen . . . . 59

(7)

4.1.7 Dephosphorylierung von gespaltener Vektor-DNA . . . 60

4.1.8 Analytische Agarosegel-Elektrophorese . . . 60

4.1.9 Pr¨aparative Agarosegel-Elektrophorese . . . 60

4.1.10 Ligation von DNA-Fragmenten . . . 61

4.1.11 Herstellung elektrokompetenter E.coli-Bakterien . . . 62

4.1.12 Transformation elektrokompetenter E.coli-Bakterien durch Elektroporation . . . 62

4.1.13 Hitzeschocktransformation in chemokompetente Bakterien mittels TOPO TA Cloning^r Kit . . . 63

4.1.14 Kolonie-PCR . . . 63

4.1.15 Plasmidpr¨aparation mittels Qiagen-Kits . . . 65

4.1.16 F¨allung der DNA durch Alkohol . . . 65

4.1.17 Sequenzierung . . . 66

4.1.17.1 Sequenzierung nach Sanger . . . 66

4.1.17.2 Sequenzierung bei der Firma MWG Biotech-AG . . . 67

4.2 Zellbiologische Methoden . . . 67

4.2.1 Transfektion von eukaryotischen Zellen . . . 67

4.2.1.1 Transfektion mit Lipofectamine^{T M} 2000 Reagent . . . 67

4.2.1.2 Transfektion mit SuperFect^{T M} Transfection Reagent . . . . 68

4.2.2 Fixieren und Permeabilisieren von Zellen . . . 68

4.2.3 Indirekter Immunfluoreszenztest . . . 69

4.2.4 Erythrozyten . . . 69

4.2.5 H¨amadsorption . . . 70

4.2.6 Behandlung von Zellen mit Gangliosiden . . . 70

(8)

4.3 Proteinchemische Methoden . . . 70

4.3.1 Biotinylierung, Zelllyse, Immunpr¨azipitation . . . 70

4.3.1.1 Oberfl¨achenbiotinylierung von in Kulturschalen gewachsenen Zellen . . . 70

4.3.1.2 Biotinylierung von auf Filtern gewachsenen Zellen . . . 71

4.3.2 Bestimmung der O-Acetylesteraseaktivit¨at . . . 72

4.3.3 Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) . . . 72

4.3.4 Western Blot . . . 73

4.3.5 Detektion biotinylierter und nicht biotinylierter Proteine . . . 73

4.3.5.1 Biotinylierte Proteine . . . 73

4.3.5.2 Nicht biotinylierte Proteine . . . 74

4.4 Klassische virologische Methoden . . . 74

4.4.1 Zellkultur . . . 74

4.4.1.1 Passage von COS7-Zellen . . . 74

4.4.1.2 Passage von MDCK-I-Zellen . . . 75

4.4.1.3 Passage von MDCK-II-Zellen . . . 75

4.4.1.4 Passage von HeLa-Zellen . . . 75

4.4.1.5 Passage von BHK21-Zellen . . . 75

4.4.1.6 Anzucht auf Filter . . . 75

4.4.2 Viren . . . 76

4.4.2.1 Virusanzucht in Zellkultur . . . 76

4.4.2.2 Virusanzucht im embryonierten H¨uhnerei . . . 77

4.4.2.3 H¨amagglutinationstest . . . 77

(9)

4.4.2.4 Immunoplaquetest . . . 78 4.5 Reverse Genetik . . . 79

4.5.1 virus like particles (VLP) erzeugt von dem Matrixprotein und dem Glykoprotein HEF des Influenza-C-Virus . . . 79 4.5.2 Einbau von Fremd-Proteinen in VSV-Partikel . . . 79 4.5.3 Mini-Genomsystem mit GFP-Reportergen . . . 80 4.5.4 VLP erzeugt durch alle Influenza-C-Proteine mit GFP als

Reportergen . . . 80 4.5.5 Erzeugung rekombinanter Influenza-C-Viren mit dem GFP-

Reportergen als zus¨atzlichem Segment . . . 81 4.5.6 Erzeugung eines rekombinanten Influenza-C-Virus mit

mutiertem HEF als zus¨atzlichem Segment . . . 81 4.5.7 Erzeugung von rekombinanten Influenza-C-Viren aus

cDNA . . . 82

5 Ergebnisse 83

5.1 Versuche mit chimären HEF-Proteinen . . . 83 5.1.1 Erzeugung chimärer Proteine . . . 83 5.1.2 Nachweis der chimären Proteine . . . 85

5.1.2.1 Nachweis der exprimierten Proteine durch

Immunfluoreszenz . . . 85 5.1.2.2 Nachweis der exprimierten Proteine durch

Oberflächenbiotinylierung . . . 86 5.1.2.3 Gerichteter Transport in polarisierten Epithelzellen . . . . 87 5.1.2.4 Hämadsorption . . . 87 5.1.2.5 Esteraseaktivität . . . 89

(10)

5.1.2.6 Einbau der Chim¨aren in VSV-Partikel . . . 89

5.1.2.7 Virus¨ahnliche Partikel (VLP) aus HEF und M . . . 90

5.2 Versuche zur Erstellung einer reversen Genetik des Influenza-C-Virus . . . 91

5.2.1 Klonieren der einzelnen Segmente in das Expressionsplasmid pcDNA 3.1 . . . 91

5.2.1.1 Beispielhafte Beschreibung der Klonierung von Segment 1 in den Vektor pcDNA 3.1 . . . 92

5.2.2 Klonieren und Umklonieren der Segmente in pPolISapIRib . . . 94

5.2.2.1 Beispielhafte Beschreibung der Umklonierung von Segment 1 in den Vektor pPolISapIRib . . . 96

5.2.3 Klonieren von Reporter- und Markergenen . . . 97

5.2.3.1 GFP . . . 98

5.2.3.2 MutaHEF . . . 99

5.2.3.3 NPHEF . . . 100

5.2.4 Nachweis der Proteine und weiterf¨uhrende Untersuchungen . . . 100

5.2.4.1 Immunfluoreszenz-Test . . . 101

5.2.4.2 Nachweis des Matrixproteins im Western Blot . . . 101

5.2.4.3 Mini-Genomsystem . . . 102

5.2.4.4 Expression von Virusproteinen mit dem Mini-Genomsystem . . . 104

5.2.4.5 Erzeugung von VLP mit einem Segment . . . 106

5.2.4.6 Erzeugung rekombinanter Influenza-C-Viren mit dem GFP-Reportergen als zus¨atzlichem Segment . . . 107

5.2.4.7 Erzeugung eines rekombinanten Influenza-C-Virus mit mutiertem HEF als zus¨atzlichem Gen . . . 109

(11)

5.2.4.8 Erzeugung von rekombinanten Influenza-C-Viren aus

cDNA . . . 112

6 Diskussion 115 7 Zusammenfassung 125 8 Summary 127 Literaturverzeichnis 129 A Sequenzen der Primer 145 A.1 Primer zum Klonieren . . . 145

A.2 Primer zum Sequenzieren . . . 150

B Sequenzen der Konstrukte 153 B.1 Sequenzen der Chim¨aren . . . 153

B.2 Sequenzen der Segmente . . . 154

C Klonieren 177 C.1 Klonieren der Chim¨aren . . . 177

C.1.1 HEF-G-CT . . . 177

C.1.2 HEF-G-TM . . . 178

C.1.3 HEF-G-ST . . . 178

C.2 Klonieren der einzelnen Segmente in das Expressionsplasmid pcDNA 3.1 . 179 C.2.1 Segment 1 . . . 179

C.2.2 Segment 2 . . . 179

C.2.3 Segment 3 . . . 181

(12)

C.2.4 Segment 4 . . . 182

C.2.5 Segment 5 . . . 183

C.2.6 Segment 6 . . . 184

C.2.7 Segment 7 . . . 184

C.2.8 Klonierung der translatierten Bereiche von NS1 und NS2 in pcDNA 3.1 . . . 185

C.3 Klonieren und Umklonieren der Segmente in pPolISapIRib . . . 185

C.3.1 Segment 1 . . . 185

C.3.2 Segment 2 . . . 185

C.3.3 Segment 3 . . . 186

C.3.4 Segment 4 . . . 186

C.3.5 Segment 5 . . . 186

C.3.6 Segment 6 . . . 187

C.3.7 Segment 7 . . . 187

Abbildungsverzeichnis 189

Tabellenverzeichnis 191

(13)

Abk¨ urzungsverzeichnis

A Alanin

a Adenin, eine der vier Basen der DNA

AB Antibiotikum

ACE 3-amino-9-ethylcarbazol

APS Ammoniumpersulfat

Aqua bidest. Aqua bidestillata, zweifach destilliertes Wasser

AS Aminos¨aure

as Antisense

bp Basenpaare

BSA Bovines Serumalbumin

C Cystein

c Cytosin, eine der vier Basen der DNA CAT Chloramphenicol-Acetyltransferase cDNA copy DNA, komplemant¨are DNA

CMV Cytomegalievirus

CT Cytoplasmatischer Anteil

D Asparagins¨aure

dATP Desoxyadenosintriphosphat

DEPC Diethylpyrocarbonat

DFP Diisopropylfluorophosphat

DMEM Dulbecco’s modified Eagle medium

DMF Dimethylformamid

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleins¨aure

(14)

dNTP Desoxynucleotidtriphosphat

DTT Dithiothreitol

E Glutamin

EDTA Ethylendiamintetraessigs¨aure

EMEM Eagle’s Minimum Essential Medium

ER endoplasmatisches Retikulum

ECL Enzym-Chemolumineszenz

E. coli Escherichia coli

F Phenylalanin

FITC Fluoresceinisothiocyanat

FKS Fetales K¨alberserum

G Glycin

g Guanin, eine der vier Basen der DNA

×g ×Erdbeschleunigung

GFP green fluorescent protein, gr¨un fluoreszierendes Protein G-Protein Glykoprotein von VSV

H Histidin

HA H¨amagglutinin

HAU h¨amagglutinierende Einheiten

HEF-Protein H¨amagglutination-Esterase-Fusions-Protein HRP Peroxidase aus Meerrettich

H₂O Reinstwasser

I Isoleucin

ICTV International Committee of the Taxonomy of Viruses

IF Immunfluoreszenz

IPTG Isopropyl-1-thio-β-D-galactosid

K Lysin

kb Kilobasen

kDa Kilodalton

JHB Johannesburg

L Leucin

LB Luria Broth, Bakterienmedium

(15)

M Methionin

MM Master-Mix-Ans¨atze

MDCK Madin-Darby canine kidney cells

MKS Maul- und Klauenseuche

m.o.i. multiplicity of infection M-Protein Matrixprotein

mRNA messenger RNA, Boten-RNA

N Asparagin

NA Neuraminidase

Neu5Ac N-Acetylneuramins¨aure

Neu5,9Ac2 N-Acetyl-9-O-Acetylneuramins¨aure NEP nuclear export protein

NP Nukleoprotein

NS-Protein Nichtstruktur-Protein NTB nicht-translatierter Bereich

OD optische Dichte

ORF open reading frame, offener Leserahmen

P Prolin

PAGE Polyacrylamidgel-Elektrophorese PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzl¨osung PBSM PBS ohne Calcium und Magnesium

PCR polymerase chain reaction, Polymerasekettenreaktion

PFA Paraformaldehyd

PFU Plaque-bildende Einheiten

p.i. post infectionem

polI Polymerase-I

polII Polymerase-II

P-Protein Polymerase-Protein

Q Glutamin

R Arginin

rER raues endoplasmatisches Retikulum

RNA Ribonukleins¨aure

(16)

RNase Ribonuclease

RNP Ribonukleoprotein

RT Reverse Transkriptase

S Serin

s sense

SDS Natriumdodecylsulfat

Seg. Segment

ST Teil der Stielregion

SV40 Simianvirus Typ 40

T Threonin

t Thymin, eine der vier Basen der DNA

TAE TRIS-Acetat-Puffer

TBE TRIS-Borat-EDTA-Puffer

TBS TRIS-gepufferte Kochsalzl¨osung TEMED N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin TiHo Tier¨arztliche Hochschule

TM Transmembrananker

TRIS Tris-Hydroxymethylaminomethan

U unit, Einheit

V Valine

VLP virus like particles, virus¨ahnliche Partikel

vRNA virale RNA

VSV Virus der Vesikul¨aren Stomatitis

W Tryptophan

X-Gal 5-Brom-4-Chlor-3-indolyl- β-D-galactosid

Y Tyrosin

(17)

1. Einleitung

1.1 Influenza-C-Virus

1.1.1 Taxonomie

Bei den Vertretern der Familie der Orthomyxoviridae handelt es sich, wie bei denen der Familien derArenaviridae und Bunyaviridae, um behüllte Viren mit einem segmentierten Genom, dessen einzelsträngige RNA von negativer Polarität ist. Solche negativsträngi- gen RNA-Viren können die genomische RNA nicht als mRNA nutzen. Sie besitzen eine RNA-abhängige RNA-Polymerase im Viruspartikel, die das Genom in mRNA-Moleküle umschreibt.

Die Familie derOrthomyxoviridae erhielt ihren Namen (orthos, griech.: standard, korrekt;

myxa, griech.: Schleim) aufgrund der F¨ahigkeit ihrer Vertreter, an Mucus zu binden bzw.

wegen ihrer Affinität zu Schleimhäuten. Sie ist im 6. Report des internationalen Komi- tees für Virus-Taxonomie (ICTV) basierend auf verschiedenen molekularen und serologischen Charakteristika der NP- und M-Proteine in 4 Genera eingeteilt worden: Influenza- A-Virus, Influenza-B-Virus, Influenza-C-Virus und Thogotovirus (Leahy et al., 1997;

Pringle, 1998). Einen Überblick geben die Tabellen 1.1 und 1.2. Das Virus der infek- tiösen Anämie der Lachse zeigt einige Gemeinsamkeiten zu den anderen Vertretern der Familie derOrthomyxoviridae, das Genus Isavirus ist allerdings vom internationalen Ko- mitee für Virus-Taxonomie (ICTV) noch nicht offiziell der Familie der Orthomyxoviridae zugeordnet worden.

Das Wort Influenza wurde im 15. Jahrhundert in Italien gepr¨agt und bedeutet Einfluss (ital.: influenza). Dem Volksglauben nach stand die gleich lautende Seuche unter dem

17

(18)

18 1. Einleitung

Tabelle 1.1:Ubersicht ¨¨ uber die Vertreter der Familie derOrthomyxoviridae.

Familie Orthomyxoviridae

Genus Influenza-A- Virus

Influenza- B-Virus

Influenza- C-Virus

Thogoto- virus

Isavirus

Vertreter Humanes Influenzavirus

Influenza- B-Virus

Influenza- C-Virus

Thogoto- virus

Virus der infekti¨osen An¨amie der Lachse Equines Influenza-

virus

Dhorivirus

Porzines Influenza- virus

Avi¨ares Influenza- virus (Klassische Gefl¨ugelpest) Einfluss der Sterne.

Die Zuordnung des Influenza-C-Virus zur Familie derOrthomyxoviridae (damalsMyxovi- ridae) war zun¨achst umstritten, da die Enzymaktivit¨at (

”Rezeptor-zerst¨orendes Enzym“) andere Charakteristika aufwies als bei den damals bekannten Influenza-A-Viren (Hirst, 1950).

Tabelle 1.2:Ubersicht ¨¨ uber die Familie derOrthomyxoviridae.

Genus Wirte Segmentanzahl Oberfl¨achenproteine

Influenza-A-Virus Mensch, Schwein, Pferd, Robben, V¨ogel

8 HA, NA

Influenza-B-Virus Mensch, Robben 8 HA, NA

Influenza-C-Virus Mensch, Schwein, Hund 7 HEF

Thogotovirus Zecken, Rinder, Schafe, Ziegen, Nagetiere

6 1 Glykoprotein

(19)

1.1. Influenza-C-Virus 19

1.1.2 Klinik und Epidemiologie

Erste Hinweise darauf, dass es sich bei dem Erreger der so genannten Schweineinfluenza um ein Virus handelt, lieferteShope(1931). 1933 gelang esSmithet al. (1933) erstmalig, ein Influenza-A-Virus aus einem Menschen zu isolieren. Erst im nächsten Jahrzehnt, im Jahre 1940, entdeckte Francis das Influenza-B-Virus und 7 Jahre später konnte Taylor (1949) ein Virus isolieren, dessen antigene Eigenschaften nicht mit den zuvor entdeckten Influenza-A- und -B-Viren übereinstimmten. NachdemFranciset al. (1950) ein ähnliches Virus fand, wurde es aufgrund der klinischen, epidemiologischen und serologischen Daten

”Influenza-C-Virus“ getauft (Francis et al., 1950; Taylor, 1951). In China wurde das Virus aus Schweinen isoliert (Guo et al., 1983; Yuanji und Desselberger, 1984), w¨ahrend in verschiedenen Studien Antik¨orper bei Hunden entdeckt wurden (Yamaoka et al., 1991; Manuguerraund Hannoun, 1992; Manuguerra et al., 1993).

Das Virus wird wie alle Influenza-Viren aerogen übertragen (Tröpfcheninfektion) und infiziert die Epithelien des oberen Respirationstraktes (Taylor, 1951). Die Erkrankung tritt vor allem bei Kindern auf und äußert sich in milden respiratorischen, grippeähnlichen Symptomen, wie Fieber, Kopf- und Gliederschmerzen, Husten und Schnupfen (Francis et al., 1950;Minuseet al., 1954;Styk, 1955;Dykeset al., 1980;Katagiriet al., 1983).

H¨aufig kommt es zu einem inapparenten Verlauf der Erkrankung, nur selten zu schweren Verlaufsformen (Gerber et al., 1952; Grist, 1955; Darkeet al., 1957).

Das Influenza-C-Virus ist, wie serologische Studien ergaben, weltweit verbreitet (Andrews undMcDonald, 1955;Jennings, 1968;Gerthet al., 1975;El-Raiet al., 1977;Dykes et al., 1980; Homma et al., 1982). Ein Großteil der adulten Bevölkerung zeigt eine hohe Seroprävalenz (besitzt Antikörper gegen Influenza-C-Viren) (O’Callaghan et al., 1980;

Homma et al., 1982). Seroepidemiologische Studien zeigen, dass Influenza-C-Viren eine gr¨oßere genetische Stabilit¨at aufweisen als Influenza-A- und -B-Viren (Chakraverty, 1978;Meier-Ewertet al., 1981;Guoet al., 1983;Kawamuraet al., 1986), so dass weder antigenetic shifts (Neukombination der Segmente durch Doppelinfektionen mit Viren verschiedener Spezies) noch Pandemien wie bei Influenza-A-Viren zu beobachten sind.

(20)

20 1. Einleitung

1.1.3 Morphologie und Genomstruktur

Morphologie

Influenza-Viren treten in elektronenmikroskopischen Aufnahmen als pleomorphe, meist sph¨arische, aber auch filament¨ose Partikel mit einem Durchmesser von 80 - 120 nm auf.

Die umhüllende Lipiddoppelschicht entstammt der jeweiligen Wirtszelle, in der die Viren repliziert haben (Compans und Choppin, 1975). In die Lipidhülle sind viruskodierte, glykosylierte Oberflächenproteine (spikes) eingelagert (Abb 1.1). Das Influenza-C-Virus besitzt im Gegensatz zu Influenza-A- und -B-Viren, die über das HA- und NA-Protein verfügen, das Oberflächenglykoprotein HEF (Herrler et al., 1979, 1981; Pfeifer und Compans, 1984; Nakada et al., 1984a; Herrler et al., 1988). Die Virusspikes von Influenza-C-Viren haben eine Länge von 8 - 10 nm und einen Durchmesser von 4 - 5 nm (Herrleret al., 1981;Hewatet al., 1984). Das HEF-Protein liegt als trimerer Komplex vor und verleiht dem Virus durch eine regelmäßige hexagonale Anordnung ein charakteris- tisches Aussehen (Watersonet al., 1963; Flewettund Apostolov, 1967; Compans und Choppin, 1975; Compans et al., 1977; Herrler et al., 1981; Hewat et al., 1984;

Formanowski und Meier-Ewert, 1988). Dieses eine Glykoprotein vereinigt die drei biologischen Aktivitäten Hämagglutination, Esterase und Fusion, die bei Influenza-A- und -B-Viren auf zwei Glykoproteine aufgeteilt sind. Ein anderes integrales Membranprotein ist das CM2, das nur in wenigen Kopien in den Virionen vorhanden ist. Das virale Matrix- protein (M-Protein) ist an der Innenseite der Hülle lokalisiert (Kendal, 1975) und über hydrophobe Wechselwirkungen mit den Lipiden und durch elektrostatische Anziehungs- kräfte mit den Nukleokapsiden assoziiert (Zhirnov undGrigoriev, 1994). Bezogen auf die Zahl der Moleküle ist M das häufigste Protein im Viruspartikel. Innerhalb des Virions befindet sich das helikale Nukleokapsid, das aus vier Proteinen (P1, P2, P3, NP) und der RNA besteht. Die sieben einzelsträngigen Nukleinsäuresegmente sind über ihre gesamte Länge mit dem NP komplexiert. Zusätzlich ist jedes Segment mit dem Polymerasekom- plex assoziiert, der aus drei Proteinen besteht (P1, P2, P3) (Cox und Kendal, 1976;

Companset al., 1977; Petri et al., 1979b, 1980).

(21)

RNA

HEF M CM2

NP P3

P2 P1

Lipid- hülle

Abbildung 1.1: Schematische Darstellung eines Influenza-C-Virus-Partikels. P1 = P1-Protein, P2 = P2-Protein, P3 = P3-Protein, NP = Nukleoprotein, HEF = HEF-Protein, M = Matrixprotein, CM2 = CM2-Protein.

Genomstruktur

Die genetische Information, die bei Influenza-A- und -B-Viren auf acht Segmente verteilt ist, liegt bei Influenza-C-Viren auf sieben Segmenten kodiert (Cox und Kendal, 1976;

Ritchey et al., 1976;AirundCompans, 1983; Lamb, 1983). Alle sieben Segmente, die insgesamt 12.900 Nukleotide umfassen, wurden bereits vollst¨andig sequenziert (Pfeifer

(22)

22 1. Einleitung

undCompans, 1984; Nakada et al., 1984b, 1985, 1986;Yamashita et al., 1988, 1989).

An ihren 3’- und 5’-Enden weisen sie hochkonservierte Sequenzen von 11 - 12 Nukleotiden auf, die zudem eine große Homologie zu den entsprechenden Segmenten von Influenza-A- und -B-Viren zeigen (Desselberger et al., 1980; Clerx-van Haaster und Meier- Ewert, 1984). Diese konservierten Bereiche sind komplementär zueinander und können Doppelstränge ausbilden, so dass die Segmente eine quasizirkuläre, Pfannenstiel ähnli- che Form annehmen (sog. panhandle). Des Weiteren enthalten diese nicht kodierenden Bereiche Signalsequenzen für die Initiation von Transkription und Genomreplikation.

Jedes der Segmente kodiert für nur ein Protein, mit Ausnahme der Segmente 6 und 7, die für zwei bzw. drei Polypeptide kodieren, die z.T. durch Spleißvorgänge entstehen (s. Tabelle 1.3).

Die Segmente 1, 2 und 3 (ca. 2.350 - 2.150 Nukleotide) kodieren für die drei Proteine des Polymerasekomplexes (Racaniello und Palese, 1979; Yamashita et al., 1989), das Segment 4 (ca. 2.000 Nukleotide) für das HEF-Protein und das Segment 5 (ca. 1.750 Nukleotide) für das Nukleoprotein. Das 6. Segment (ca. 1.150 Nukleotide) kodiert für das M-Protein, welches von einer gespleißten mRNA translatiert wird, sowie für die beiden Proteine p31 und CM2 (Yamashita et al., 1988; Hongo et al., 1999; Pekosz und Lamb, 2000). Das Segment 7 (ca. 975 Nukleotide) kodiert für die beiden Nichtstruktur- proteine (NS1, NS2), wobei die mRNA für das kleinere durch einen Spleißvorgang entsteht (Nakada et al., 1985, 1986;Marschall et al., 1999).

Tabelle 1.3:Ubersicht ¨¨ uber die Genomsegmente und die Proteine, f¨ur die sie kodieren.

Segment Nukleotidgr¨oße Protein

1 ca. 2.350 P1

2 ca. 2.350 P2

3 ca. 2.150 P3

4 ca. 2.000 HEF

5 ca. 1.750 NP

6 ca. 1.150 M, CM2, p31

7 ca. 975 NS1, NS2

(23)

1.1.4 Virusproteine

P1, P2, P3

Die Proteine P1, P2 und P3 des Polymerasekomplexes bilden zusammen mit dem NP das Nukleokapsid. Sie werden nach ihrer Synthese im Zytoplasma in den Kern transportiert und als analoge Proteine zu denen des Transkriptionsapparates des Influenza-A-Virus betrachtet. Eine wesentliche Funktion ist die RNA-abh¨angige RNA-Polymerase (P2 bzw.

PB2) und das Binden der Cap-Struktur an die synthetisierte RNA mit positiver Polarit¨at (cap-binding, P1 bzw. PB1) (Bishop et al., 1971a,b; Petri et al., 1980; Nagele und Meier-Ewert, 1984; Yamashita et al., 1989).

NP

Das 565 AS lange Nukleoprotein (Stamm California/78) gehört ebenfalls zu den Kompo- nenten des Nukleokapsides und weist für jedes der drei Influenza-Viren unterschiedliche molekulare Charakteristika auf. Es wurden zwei Regionen mit hoher Homologie zu den Nukleoproteinen von Influenza-A- und -B-Viren gefunden (Nakadaet al., 1984a;Lamb, 1989). Eine davon ist die Karyophilie-Sequenz von Influenza-A- und -B-Viren (Davey et al., 1985). Das an basischen Argininresten reiche Nukleoprotein ist während des Repli- kationszyklus für den korrekten Ablauf der Genomreplikation wichtig.

HEF

Die komplette Nukleotidsequenz von Segment 4 wurde aus verschiedenen Isolaten bereits entschl¨usselt. Die HEF-Sequenz wurde zum einen an klonierter cDNA (Nakada et al., 1984b; Pfeifer und Compans, 1984), zum anderen durch Direktsequenzierung von vRNA ermittelt (Buonagurioet al., 1985; Adachi et al., 1989).

Das HEF-Protein wird als ein Polypeptid von 88 kDa synthetisiert (HEF₀) und durch zelluläre Trypsin ähnliche Proteasen in die beiden Untereinheiten HEF₁ (432 AS, 57 kDa) und HEF₂ (209 AS, 25 kDa) gespalten, die über Disulfidbrücken miteinander verbunden bleiben (Herrler et al., 1979; Rosenthal et al., 1998). HEF ist ein typisches Klasse- I-Membranprotein mit einer N-terminalen Signalsequenz, einem Fusionspeptid (Position

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24 1. Einleitung

447 - 474) und einem Membrananker (Position 627 - 652) (Herrleret al., 1981;Meier- Ewert et al., 1981; Formanowski und Meier-Ewert, 1988; Herrler und Klenk, 1991). Der sehr kurze cytoplasmatische Anteil besteht aus drei AS (Arginin, Threonin und Lysin) (Krystal et al., 1982). Im Gegensatz zum Influenza-A-HA-Protein wird die HEF₂-Untereinheit nicht mit Palmitinsäure modifiziert, sondern am Cystein in der Nähe des C-Terminus mit Stearinsäure acyliert (Veit et al., 1990, 1996). Von den acht potenziellen N-Glykosylierungsstellen werden sieben genutzt (Herrler und Klenk, 1991).

F¨ur das HEF-Protein sind drei Funktionen - Rezeptorbindung, Rezeptorinaktivierung und Fusionsaktivit¨at - bekannt (Vlasak et al., 1987; Herrler et al., 1988):

1. Rezeptorbindung:

Als Rezeptordeterminante wurde N-Acetyl-9-O-Acetylneuramins¨aure (Neu5,9Ac₂) identifiziert. Neu5,9Ac₂ kann seine Funktion als Bestandteil sowohl von Glyko- proteinen als auch von Glykolipiden (Ganglioside) wahrnehmen (Herrler et al., 1985b,c;Rogerset al., 1986;HerrlerundKlenk, 1987;Herrleret al., 1987a,b).

Durch Selektion auf MDCK-II-Zellen konnte eine Virusmutante identifiziert werden, die aufgrund einer Punktmutation an Nukleotid-Position 872 (an AS-Position 284 wurde ein Threonin (T) gegen ein Isoleucin (I) ausgetauscht) eine signifikante Veränderung der Rezeptorbindungsaktivität aufwies (Szepanskiet al., 1992). Die- se Virusmutante hatte eine höhere Affinität zu Neu5,9Ac2 als das parentale Virus vom Stamm JHB/1/66 und somit einen erweiterten Zelltropismus. Das Threonin (284) befindet sich in unmittelbarer Nähe der Sequenz G₂₇₉-Q-S-G₂₈₂, die auch in der Rezeptorbindungstasche von Influenza-A-HA-Proteinen gefunden wurde (Weis et al., 1988). Dieses Motiv G₂₇₉-Q-S-G-D-T₂₈₄ ist auch ein wesentlicher Bestandteil der Rezeptorbindungsstelle des HEF-Proteins (Herrler und Klenk, 1991). Die Rezeptordomäne des HEF-Proteins reicht von AS-Position 151 - 310 (Rosenthal et al., 1998).

2. Rezeptorinaktivierung:

Anders als Influenza-A- und -B-Viren haben Influenza-C-Viren keine Neuraminida- se als rezeptorinaktivierendes Enzym, sondern eine O-Acetylesterase, die N-Acetyl- 9-O-Acetylneuramins¨aure als Substrat erkennt und die hydrolytische Freisetzung des Essigs¨aurerestes an Position 9 katalysiert (Herrler et al., 1985a,c, 1987b).

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Allerdings werden eine Reihe synthetischer Verbindungen, wie z.B. α-Naphthyl- acetat oder p-Nitrophenylacetat, schneller umgesetzt als das physiologische Substrat (Schaueret al., 1988). Die O-Acetylesterase wird der Familie der Serin-Proteasen zugeordnet und kann durch Diisopropylfluorophosphat (DFP) irreversibel gehemmt werden (MuchmoreundVarki, 1987). Die Serin-Proteasen sind durch die kataly- tische Triade S-H-D charakterisiert. Bei HEF konnte das Serin im aktiven Zentrum an Position 57 lokalisiert werden, so dass sich die Triade aus S₅₇, H₃₅₅ und D₃₅₂ zusammensetzt (Rosenthal et al., 1998).

Die Esterasedom¨ane ist auf dem HEF-Protein auf zwei Stellen verteilt, AS-Position 41 - 150 sowie 311 - 366. Sie flankieren damit die Rezeptordom¨ane (Rosenthal et al., 1998).

3. Fusion:

Für die Fusionsaktivität des HEF-Proteins ist die Spaltung in die beiden Unterein- heiten HEF₁ und HEF₂ essenziell. Die Spaltung erfolgt durch zelluläre Proteasen und bewirkt die Freilegung des Fusionspeptids am neu entstandenen N-Terminus der HEF₂-Untereinheit (Kitame et al., 1982; Ohuchi et al., 1982). Eine weitere wichtige Voraussetzung für die Fusionsaktivität ist ein pH-Wert zwischen 5 und 6 (Formanowskiet al., 1990). Bei niedrigen pH-Werten kommt es zum Auflösen der hexagonalen Anordnung der Virusspikes, also zur Konformationsänderung (Hewat et al., 1984; Formanowski et al., 1990). Diese Merkmale zeigen deutliche Pa- rallelen zum Fusionsweg der Influenza-A-Viren, so dass die Fusion der viralen mit der endosomalen Membran auch für Influenza-C-Viren wahrscheinlich ist (Wiley und Skehel, 1987; Formanowski et al., 1990). Die Fusionsdomäne ist auf dem HEF-Protein dreigeteilt. Sie reicht von AS-Position 1 - 40 über AS-Position 367 - 432 bis hin zu der kompletten HEF₂-Untereinheit (Rosenthal et al., 1998).

Gegen das HEF-Protein werden neutralisierende Antik¨orper gebildet.

Matrixprotein, CM2, p31

Das 1.150 Nukleotide große Segment 6 (Yamashita et al., 1988) wird in eine mRNA transkribiert, die in einem einzelnen offenen Leserahmen (ORF) f¨ur ein Polypeptid (p42-

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26 1. Einleitung

Vorl¨aufer-Protein) von 374 AS L¨ange und einem Molekulargewicht von 41,7 kDa kodiert (Yamashita et al., 1988;Hongo et al., 1998; Pekoszund Lamb, 1998).

Das p42 Vorl¨aufer-Protein wird proteolytisch in das p31 (N-terminales Spaltprodukt) und CM2 (C-terminales Spaltprodukt) gespalten (Hongo et al., 1994, 1999; Pekosz und Lamb, 1997, 1998).

Das C-terminale Spaltprodukt CM2 ist ein kleines glykosyliertes integrales Membran- protein. Das 139 AS lange Polypeptid verk¨urzt sich nach Abspaltung des N-terminalen Signalpeptids auf 115 AS. Es teilt einige Strukturmerkmale mit dem M2-Protein von Influenza-A-Viren. Die Dimere und Tetramere, die von dem CM2 gebildet werden, sind

über Disulfidbrücken miteinander verbunden. Das CM2-Protein verfügt über eine Trans- membranregion sowie eine potenzielle N-Glykosylierungsstelle und wird an der Zellober- fläche von virusinfizierten wie von transfizierten Zellen exprimiert und in Influenza-C- Virionen inkorporiert (Hongo et al., 1997;Pekosz und Lamb, 1997).

Die Funktion des CM2-Proteins ist noch nicht gekl¨art. M¨oglicherweise handelt es sich um ein Ionenkanalprotein analog zum M2-Protein der Influenza-A-Viren.

Das p31-Protein ist mit der AS-Sequenz des M-Proteins identisch, enth¨alt aber zus¨atzlich 17 AS am C-terminalen Ende. Es bindet an Lipidmembranen und hat eher die Eigenschaf- ten eines integralen Membranproteins wie das CM2-Protein als die eines peripheren wie das M-Protein. In virusinfizierten Zellen wird es schnell abgebaut (Pekosz und Lamb, 1998, 2000).

Anders als bei Influenza-A- und -B-Viren, die das Matrixprotein direkt von einer un- gespleißten mRNA translatieren, wird das M-Protein der Influenza-C-Viren von einer gespleißten mRNA abgelesen. Das 242 AS lange Protein hat eine Molekularmasse von 27 kDa. Beim Spleißvorgang entsteht aus dem potenziellen Tryptophan-Kodon an AS- Position 243 (Nukleotid T₇₅₂, G₇₅₃, G₇₅₄) ein Stoppkodon. Die Nukleotide T₇₅₂ und G₇₅₃ bilden die 5’-Spleißstelle und das Nukleotid A₉₈₂ die 3’-Spleißstelle (Yamashita et al., 1988).

Die Sequenzhomologie zwischen den Matrixproteinen von Influenza-A- und -C-Viren be- tr¨agt ca. 20 %. Ein Kernlokalisationssignal, wie es bei Influenza-A-Viren gefunden wurde (Eisteret al., 1997), konnte bei Influenza-C-Viren noch nicht identifiziert werden. Trotz- dem wird ein Transport in den Zellkern (Patterson et al., 1988; Bucher et al., 1989)

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und sogar eine spezifische Assoziation mit demselben vermutet (Sugawara et al., 1991).

Die genaue Funktion des M-Proteins bei Influenza-C-Viren ist noch wenig untersucht. Es spielt vermutlich analog zu M1 von Influenza-A- und -B-Viren eine wichtige Rolle bei der Verpackung neusynthetisierter Nukleokapside (Yamashita et al., 1988).

Nichtstrukturproteine NS1, NS2

Bei Influenza-C-Viren wurden zwei Nichtstrukturproteine mit einem Molekulargewicht von 27 und 14 kDa gefunden (Nakada et al., 1985;Marschall et al., 1999).

Die ungespleißte mRNA enth¨alt einen einzelnen ORF, der in ein 246 AS langes Protein translatiert wird (Marschallet al., 1999).

Ein Teil der mRNA wird gespleißt, wobei ein 314 Nukleotid großes Fragment (Nukleotid 214 - 526) herausgeschnitten wird. Die Translation beginnt am selben Startkodon (aug) wie bei NS1. Beim NS1- und NS2-Protein sind die ersten 62 AS identisch. Nach der Spleiß- stelle (Nukleotidposition 527) folgen noch 120 AS, so dass das NS2-Protein insgesamt 182 AS lang ist (Hongo et al., 1992).

Es wird vermutet, dass das NS2 analog zu Influenza-A-Viren eine wichtige Rolle beim Ausschleusen des neu gebildeten Nukleokapsids aus dem Kern spielt (Paragas et al., 2001), und es deshalb NEP (nuclear export protein) genannt werden sollte (O’Neill et al., 1998).

1.1.5 Replikation

Die Influenzaviren dringen wie alle behüllten Viren durch spezifische Bindung an Zell- membran-assoziierte Rezeptormoleküle und anschließende Fusion mit der Membran in die Wirtszelle ein (Zimmeret al., 1995). Die Erkennung erfolgt bei Influenza-C-Viren über die Rezeptordeterminante N-Acetyl-9-O-Acetylneuraminsäure (HerrlerundKlenk, 1991).

Das Oberflächenglykoprotein HEF bindet an Neu5,9Ac₂ (Adsorption), und durch Endo- zytose wird das Virus internalisiert. Durch Ansäuerung der Endosomen kommt es wie beim HA-Protein der Influenza-A- und -B-Viren zur Konformationsänderung des HEF- Proteins und somit zur Aktivierung der fusogenen Domäne. Es folgt die Verschmelzung der viralen Membran mit der Endosomenmembran, wodurch der Vorgang der Penetration

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28 1. Einleitung

abgeschlossen wird (Kitameet al., 1982; Ohuchiet al., 1982). Anders als bei Influenza- A- und -B-Viren verl¨auft die Aufl¨osung der M-Proteinmatrix nicht im sauren, sondern im neutralen bis alkalischen Milieu (Zhirnov und Grigoriev, 1994).

Wie bei Influenza-A- und -B-Viren werden bei den Influenza-C-Viren nach der Fusion die internen Ribonukleoproteinanteile in den Zellkern transportiert. Gleichfalls folgt ein Actinomycin D-empfindlicher Replikationsprozess, da die Orthomyxoviren für die Tran- skription ihrer Genomsegmente die zelluläre DNA-abhängige RNA-Polymerase-II benöti- gen (Lambund Choppin, 1977; Petri et al., 1979a;Plotch et al., 1979).

Die viruseigene RNA-abh¨angige RNA-Polymerase kann weder Cap-Strukturen synthe- tisieren noch 5’-Methylierungen durchf¨uhren (Nagele und Meier-Ewert, 1984). Sie bedient sich eines Mechanismus, der als

”5’-Cap-Stehlen“ bezeichnet wird (Yamashita et al., 1989). Modifizierte zelluläre mRNA-Fragmente mit freien 3’-OH-Enden werden als Primer für die Initiation der Transkription verwendet. An der Elongation der mRNA sind alle drei Proteine des Polymerasekomplexes (P1, P2, P3) beteiligt. Die virale mRNA wird mit Hilfe zellulärer sowie viraler Komponenten (NS1) aus dem Kern ausgeschleust. Die Translation des Glykoproteins HEF erfolgt an der Membran des rauen endoplasmatischen Retikulums (rER), wo die Trimerisierung erfolgt und die Glykosylierung beginnt. Nach der weiteren Prozessierung im Golgi-Apparat kommt es zum Transport an die Zellmem- bran. Die anderen viralen Proteine werden an den freien Ribosomen des Zytoplasmas translatiert und in den Zellkern transportiert. Die Anreicherung des Nukleoproteins hat die Umschaltung von Transkription zu Replikation zur Folge. Jetzt assoziieren neusyn- thetisierte RNA-Stränge mit den Proteinen des Polymerasekomplexes sowie dem NP zu neuen Nukleokapsiden und werden nach Anlagerung des Matrixproteins ins Zytoplasma transportiert. Von hier gelangen sie zu Domänen der Zellmembran, in denen das HEF- Protein vermehrt eingelagert ist. Dort entstehen sich nach außen wölbende Areale. Es kommt zur Knospung reifer Virionen. Als Besonderheit unter den Influenza-Viren werden bei Influenza-C-Viren freie Viruspartikel ohne Nukleokapsid beobachtet. Bei Influenza-C- Viren scheint die Interaktion der Hüllkomponenten für die Knospung und Partikelfreiset- zung auszureichen (Herrler et al., 1981).

(29)

1.2. Reverse Genetik bei Influenza-Viren 29

1.2 Reverse Genetik bei Influenza-Viren

Die reverse Genetik, eine Technik, mit der man gezielt spezifische Mutationen in das virale Genom einbringen kann, hat das Wissen ¨uber Viren und ihre Interaktionen mit dem Wirtsorganismus enorm vergr¨oßert (Weissmann et al., 1979).

Bei den Negativstrang-RNA-Viren gestaltete sich die reverse Genetik zuerst schwierig, weil die RNA mit dem Polymerasekomplex assoziiert ist. Bei den Influenza-Viren kam der segmentierte Genomaufbau noch erschwerend hinzu.

Nachdem allerdings die Isolierung eines aktiven Polymerasekomplexes vom Influenza-A- Nukleokapsid durch CsCl-Glycerol-Zentrifugation gelungen war (Honda et al., 1988), eröffneten sich neue Möglichkeiten. Es konntenin vitro kurze synthetische RNA-Moleküle, die die 3’- und 5’-terminalen Nukleotidsequenzen enthielten, erzeugt werden (Parvin et al., 1989). Es wurde gezeigt, dass ein Genkonstrukt, bestehend aus dem kodierenden Be- reich des Chloramphenicolacetyltransferase-Gens (CAT) sowie den 3’- und 5’-terminalen Sequenzen von Influenza-A-Viren,in vivo in Zellen, die mit einem Helfervirus infiziert waren, vermehrt werden konnte. Das CAT-Gen wurde repliziert, in Virionen verpackt und konnte dann über eine gewisse Zeit in Zellen passagiert werden (Luytjes et al., 1989;

Neumann et al., 1994; Mena et al., 1996). Analog dazu konnten Virus ähnliche Parti- kel (VLP) mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) als Reportergen erzeugt werden (Neumannet al., 2000). Wagneret al. (2000) konnte solche VLP für das Thogotovirus erzeugen.

Dieses wichtige Experiment machte es m¨oglich, gezielt Mutationen im Genom von In- fluenza-A-Viren zu erzeugen (Enami et al., 1990).

Diese Technologie wurde später verbessert. Die Effizienz der Isolierung von Viren, die Fremdgene trugen, wurde vergrößert, indem die Transkription der synthetischen RNA in Anwesenheit des Polymerasekomplexes durchgeführt wurde (Enami und Palese, 1991).

Für die Isolierung von Viren mit künstlichen RNA-Segmenten benötigte man ein gutes Selektionssystem, das großen Selektionsdruck auf das Helfervirus ausübte. Aus diesem Grund konzentrierten sich die frühen Studien auf die Untersuchung der Oberflächenpro- teine, bei denen man einen Antikörper abhängigen Selektionsdruck ausüben konnte.

Viele wichtige Entdeckungen, welche die individuellen Influenza-Virus-Proteine betreffen, konnten durch die Anwendung der reversen Genetik gemacht werden. Auch die Nutzung

(30)

30 1. Einleitung

von Influenza-A-Viren als viraler Expressionsvektor wurde dadurch m¨oglich (Neumann und Kawaoka, 1999; Pekoszet al., 1999).

Es wurden zwei Systeme etabliert, die die Manipulation jedes einzelnen Genes des In- fluenza-A-Genomes ohne Benutzung eines Helfervirus erm¨oglichte.

1. Die Promotor- und Terminator-Sequenzen der zellulären DNA-abhängigen RNA- Polymerase-I (polI) flankieren die Gene, die in Antisense-Orientierung vorliegen und auch die 3’- und 5’-terminalen nicht-kodierenden Bereiche enthalten. Auf diese Art und Weise werden künstliche RNA-Segmente erzeugt. Es werden acht Plasmide, die für die acht RNA-Segmente kodieren und unter der Kontrolle der Promotor- und Terminator-Sequenzen der RNA-Polymerase-I stehen, zusammen mit den vier Plasmiden, die für den Polymerasekomplex und das NP kodieren und unter der Kontrolle von RNA-Polymerase-II (polII) stehen, in die Zelle transfiziert (Neumann et al., 1999).

2. Im anderen System werden die Promotor-Sequenz der RNA-Polymerase-I und ein Ribozym benutzt (Pleschka et al., 1996;Fodor et al., 1999).

Später wurde ein System etabliert, in dem infektiöse Viruspartikel durch die Transfek- tion von insgesamt nur acht Plasmiden gewonnen wurden. Diese Plasmide beinhalten die RNA-Polymerase-I Promotor- und Terminator-Sequenzen sowie den Promotor der RNA-Polymerase-II und eine Polyadanylierungsstelle. Die Orientierung der beiden Tran- skriptionseinheiten war so gewählt, dass sie die Synthese von negativsträngiger vRNA und positivsträngiger mRNA von ein und demselben viralen cDNA-Abschnitt ermöglich- te (Hoffmannet al., 2000, 2002).

1.3 Das Virus der Vesikul¨ aren Stomatitis

Das Virus der Vesikulären Stomatitis wird an dieser Stelle verkürzt dargestellt, da es im Rahmen eines Versuches verwendet wurde, für die Arbeit an sich aber eine untergeordnete Rolle spielt.

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1.3. Das Virus der Vesikul¨aren Stomatitis 31

Taxonomie

Das Virus der Vesikul¨aren Stomatitis geh¨ort der Familie der Rhabdoviridae an und ist dem Genus Vesiculovirus zugeordnet. Die Familie derRhabdoviridae wird wie die Fami- lie der Bornaviridae, Filoviridae und Paramyxoviridae der Ordnung der Mononegavira- les zugeordnet. In die Familie der Rhabdoviridae sind ebenfalls die Genera Lyssavirus, Ephemerovirus, Nukleorhabdovirus, Novirhabdovirus und Cytorhabdovirus eingeordnet.

Morphologie und Genomstruktur

Das unsegmentierte virale Genom besteht aus einer einzelsträngigen RNA von negativer Polarität. Die RNA umfasst insgesamt 11.000 Nukleotide, wobei es fünf offene Leserahmen (ORF) besitzt. Die Leserahmen sind in folgender Reihenfolge angeordnet: N-P-M-G-L.

Die Virionen der Vesikulären Stomatitis haben ein geschossförmiges Aussehen mit einer Größe von 70 x 180 nm. Das helikale Nukleokapsid besteht aus den Proteinen N, P und L sowie dem viralen Genom. Das Matrixprotein M ist mit dem Nukleokapsid assoziiert und liegt der Membranhülle des Virions von innen an. Des Weiteren spielt es bei der Regulation der viralen Transkription sowie beim Buddingprozess eine Rolle. Das Oberflächenglyko- protein G ist als trimerer Komplex mit der hydrophoben Transmembrandomäne in der Li- pidhülle verankert. Es besitzt eine 28 AS lange cytoplasmatische Domäne. Das G-Protein spielt beim Eindringen des Virions in die Zelle sowie beim Buddingprozess eine zentra- le Rolle. Nach der Prozessierung und Glykosylierung im Endoplasmatischen Retikulum erfolgt der Transport an die Zellmembran. Das M-Protein verbindet das G-Protein mit dem Nukleokapsid und induziert das Ausstülpen der Membran. Es kommt zur Freisetzung neuer Virionen (Rodriguez und Nichol, 1999;Rose und Whitt, 2001).

Nachdem die Klonierung der vollst¨andigen VSV-Sequenz gelungen war, wurde das System rekombinanter VS-Viren als viraler Vektor f¨ur die Expression von Fremdgenen benutzt.

Das H¨amagglutinin-Gen des Influenza-A-Virus (Roberts et al., 1998, 1999) und andere Gene viraler Glykoproteine wurden in das Genom von VSV eingesetzt und exprimiert (Kahn et al., 1999; Grigera et al., 2000; Schlereth et al., 2000; Rose et al., 2000, 2001; Ezelleet al., 2002; Haglund et al., 2002).

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32 1. Einleitung

Die große Toleranz gegenüber genetischen Veränderungen, der einfache Genomaufbau (fünf Gene) und die hochtitrige Vermehrung zeichnen das VSV-Vektorsystem aus.

Infektion, Klinik, Epidemiologie und Bedeutung

Das Virus der Vesikulären Stomatitis infiziert Pferde, Rinder, Schweine und in seltenen Fällen auch Menschen. Die Übertragung erfolgt durch den Biss oder Stich infizierter In- sekten. In der Regel verlaufen die Infektionen mit VSV subklinisch. Beim Ausbruch der Erkrankung kommt es zu charakteristischen bläschenartigen Hautläsionen im Bereich von Zunge, Lippen, Maulschleimhaut, Zitzen und am Kronsaum (Rodriguez und Nichol, 1999).

Die Verbreitung von VSV ist zur Zeit auf Nord-, Mittel- und S¨udamerika beschr¨ankt.

Die klinischen Ausbrüche liegen zum Teil weit auseinander, so können mitunter 10 Jah- re zwischen zwei Ausbrüchen liegen. In endemischen Gebieten werden Ratten, Mäuse, Fledermäuse, Brüllaffen, Hirsche und Wildschweine als Wildtierreservoir betrachtet. In- sekten gelten als Reservoir und Überträger von VSV (Rodriguez und Nichol, 1999).

Obwohl VSV-Ausbrüche verhältnismäßig selten vorkommen, führen diese in endemischen Gebieten durch den Leistungsrückgang der Tiere zu wirtschaftlichen Verlusten. Wegen der hohen Ähnlichkeit der Symptome der Vesikulären Stomatitis mit denen der Maul- und Klauenseuche (MKS) (klinisch nicht voneinander zu unterscheiden) ist die Vesikuläre Stomatitis differentialdiagnostisch von sehr großer Bedeutung und in Deutschland eine anzeigepflichtige Tierseuche.

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2. Zielsetzung

Das Influenza-C-Virus gehört zur Familie der Orthomyxoviridae und infiziert effektiv den oberen Respirationstrakt. Das Virus trägt das sog. HEF-Protein (Hämagglutination- Esterase-Fusion) in seiner Hülle, das die drei verschiedenen biologischen Aktivitäten - Rezeptorbindung, Rezeptorinaktivierung und Fusionsaktivität - besitzt, die bei Influenza- A- und -B-Viren auf die beiden Proteine HA (Hämagglutinin) und NA (Neuraminidase) verteilt sind. Das HEF-Protein ist im Hinblick auf Gentherapie am Respirationstrakt interessant. Bisherige Versuche einer Gentherapie mit Hilfe von Adenoviren und adeno- assoziierten Viren sowie retroviralen Vektoren lieferten nur unbefriedigende Ergebnisse.

Bei diesen Erregern ist die Effizienz der Infektion des Respirationstraktes sehr gering, weil die Rezeptoren auf der basolateralen Seite der respiratorischen Epithelzellen lokalisiert und somit für von außen applizierte Viren schwer zugänglich sind. Respiratorische Viren stellen hierzu eine Alternative dar, weil sie die Epithelzellen des Respirationstrak- tes effektiv von der apikalen Seite infizieren. Diese Viren kamen bisher in der Genthe- rapie nicht zum Einsatz. Aufgrund der negativsträngigen Genomstruktur ist die Erzeu- gung rekombinanter Viren aus cDNA schwieriger als bei anderen Viren. Bei Influenza- A-Viren steht erst seit kurzem ein effektives System zur genetischen Manipulation zur Verfügung (Neumann et al., 1999). Sowohl Influenza-A- und B- als auch Sendaiviren erkennen N-Acetylneuraminsäure (Neu5Ac) als Rezeptordeterminante, die auf dem respiratorischen Epithel weit verbreitet ist. Influenza-C-Viren erkennen dagegen die viel seltenere N-Acetyl-9-O-Acetylneuraminsäure (Neu5,9Ac₂) als Rezeptordeterminante und haben damit einen viel engeren Tropismus. Mit der Veröffentlichung der Röntgenstruktur (3-D-Struktur) des HEF-Proteins (Rosenthal et al., 1998; Zhang et al., 1999) wurde die Voraussetzung geschaffen, die Affinität des Proteins zu Neu5,9Ac₂ durch gezielte orts- gerichtete Mutationen in der Rezeptorbindungstasche zu verändern und auf diese Weise

33

(34)

34 2. Zielsetzung

den Tropismus des Virus einzuengen oder zu erweitern.

Im Hinblick auf eine sp¨atere gezielte ¨Anderung des Tropismus von Influenza-C-Viren sollte in der vorliegenden Arbeit ein System entwickelt werden, um die Wirkung gezielter Mutationen auf die Rezeptorbindung zu untersuchen.

Im ersten Schritt sollte die Eignung des Virus der Vesikulären Stomatitis als System zur Charakterisierung des HEF-Proteins geprüft werden. Im Hinblick auf den späteren Einbau in das VSV erschien es sinvoll, chimäre Proteine zwischen dem G-Protein des VS-Virus und dem HEF-Protein des Influenza-C-Virus herzustellen und diese auf Funktionalität unter besonderer Berücksichtigung der Bindungseigenschaften des HEF-Proteins zu untersuchen.

Im Weiteren sollte mit Hilfe der reversen Genetik, wie sie schon bei Influenza-A-Viren erfolgreich angewendet wurde (Neumann et al., 1999), ein rekombinantes Influenza-C- Virus erstellt werden. Dabei wird letztlich infekti¨oses Virus aus cDNA erzeugt.

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3. Material

3.1 Zelllinien

COS7:Nierenzellen der Afrikanischen Grünen Meerkatze (african green monkey), die mit dem SV40-T7-large-Antigen transformiert wurden, stammen aus dem Institut für Viro- logie der Tierärztlichen Hochschule Hannover (TiHo) und der Medizinischen Hochschule Hannover.

MDCK-I: Hundenierenepithelzellen (Madin-Darby canine kidney cells) MDCK-II: Hundenierenepithelzellen

MDCK-I- und MDCK-II-Zellen unterscheiden sich in Morphologie und Physiologie voneinander (Richardson et al., 1981;Simmons, 1981;Valentich, 1981; Hanssonet al., 1986; Zimmer et al., 1997).

HeLa:humane, epitheliale Zervixkarzinomzellen

BHK21:Nierengewebe des Syrischen GoldhamstersMesocricetus auratus (baby hamster kidney cells).

Die MDCK-I-, MDCK-II-, HeLa-, und BHK21-Zellen stammen aus dem Institut f¨ur Vi- rologie der Tier¨arztlichen Hochschule Hannover.

35

(36)

36 3. Material

3.2 Zellkulturmedien

Dulbecco’s Minimum Essential Medium (DMEM):

DEMEM-Pulvermedium 13,53 g GIBCO, Invitrogen

NaHCO₃ 2,20 g

Aqua bidest. ad 1,00 l

Der pH-Wert wurde durch CO₂-Begasung auf 6,9 eingestellt.

Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM):

EMEM-Fertigpulver 9,6 g GIBCO, Invitrogen

NaHCO₃ 2,2 g

Der pH-Wert wurde durch CO₂-Begasung auf 7,0 eingestellt.

Beide Medien wurden jeweils auch mit Antibiotikazusatz verwendet, je Liter:

Penicillin G 0,06 g Sigma Streptomycin-Sulfat 0,05 g Sigma

Phosphatgepufferte Salzl¨osung pH 7,0 - 7,2 (PBS) nach DULBECCO u. VOGT (1954):

NaCl 8,00 g

KCl 0,20 g

Na₂HPO₄ × 12 H₂O 2,37 g KH₂PO₄ × 2 H₂O 0,20 g

CaCl2 0,13 g

MgCl₂ × 6 H₂O 0,10 g Aqua bidest. ad 1,00 l

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3.2. Zellkulturmedien 37

Phosphatgepufferte Salzl¨osung ohne Calcium und Magnesium(PBSM):

NaCl 8,00 g

KCl 0,20 g

Na₂HPO₄ × 12 H₂O 2,37 g KH2PO4 × 2 H2O 0,20 g

Glucose 1,00 g

Phenolrot (1 %) 1,50 ml Aqua bidest. ad 1,00 l

Versen-Trypsin 0,125%:

NaCl 8,00 g

KCl 0,20 g

Na₂HPO₄ × 12 H₂O 2,31 g KH₂PO₄ × 2 H₂O 0,20 g

CaCl₂ 0,13 g

MgSO₄ × 7 H₂O 0,10 g

Trypsin 1,25 g

Versen (Titriplex III)(EDTA) 1,25 g

Streptomycin 0,05 g

Penicillin 0,06 g

Der pH-Wert wurde mit 1 N NaOH auf 7,0 eingestellt.

Alle o.g. Zellkulturkomponenten wurden sterilfiltriert.

Fetales K¨alberserum (FKS) GIBCO, Invitrogen Nicht essenzielle Aminos¨auren Biochrom AG

(38)

38 3. Material

3.3 Bakterienkulturmedien

LB-Medium:

Bacto-Trypton 10,0 g

NaCl 10,0 g

Hefe-Extrakt 5,0 g Reinstwasser ad 1,0 l

Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 7,0 eingestellt.

Das Medium wurde dann autoklaviert bei Raumtemperatur gelagert.

LB-Medium mit Agar-Agar f¨ur Agarplatten:

Zu o.g. Rezept wurden zusätzlich 20 g Agar-Agar/l zugefügt und anschließend autoklaviert. Zur Herstellung von Agarplatten musste das Medium in der Mikrowelle erhitzt, im Wasserbad auf ca. 48 °C abgekühlt und dann in entsprechende Petrischalen gegossen werden. Bei Bedarf wurden dem Medium kurz vor dem Gießen der Schalen 50 µg/ml Ampicillin zugefügt.

3.4 Viren

Das Influenza-C-Virus vom Stamm Johannesburg/1/66 sowie die von diesem Stamm abgeleitete Mutante T284I wurden von Prof. Herrler, Institut für Virologie, TiHo, zur Verfügung gestellt. Sie dienten als Ausgangsmaterial für die Virus-Anzucht sowie für In- fektionsversuche.

Das Virus der Vesikulären Stomatitis (VSV) vom Stamm Indiana wurde von Dr. Zimmer, Institut für Virologie, TiHo, zur Verfügung gestellt.

3.5 Erythrozyten

Vollblut von Hühnern sowie 10 %ige Hühnererythrozyten-Lösungen wurden von der Ge- flügelklinik der TiHo zur Verfügung gestellt.

(39)

3.7. L¨angenstandards 39

3.6 Restriktionsenzyme und andere Enzyme

AflII (10 U/µl) MBI-Fermentas

AvrII (4 U/µl) New England BioLabs

BamHI (10 U/µl) MBI-Fermentas

ClaI (10 U/µl) MBI-Fermentas

EcoRI (10 U/µl) GIBCO, Invitrogen EcoRV (10 U/µl) GIBCO, Invitrogen EcoT22i (AvaII) (10 U/µl) New England Biolabs

KpnI (10 U/µl) MBI-Fermentas

PflMI (8 U/µl) New England BioLabs

SapI (2 U/µl) New England BioLabs

XbaI (50 U/µl) MBI-Fermentas

XhoI (10 U/µl) MBI-Fermentas

Calf Intenstine Alkaline Phosphatase (1 U/µl) MBI-Fermentas

Steptavidin-Peroxidase(HRP)-Komplex Amersham/Pharmacia

T4 DNA Ligase (5 U/µl) MBI-Fermentas

Taq Polymerase (5 U/µl) Qiagen

Pfu DNA Polymerase, nativ (2,5 U/µl) Stratagene Pfu DNA Polymerase, rekombinant (2,5 U/µl) MBI-Fermentas

3.7 L¨ angenstandards

GeneRuler^{T M} 100 bp DNA Leadder Plus MBI-Fermentas Lambda DNA/EcoRI + HindIII Marker, 3 MBI-Fermentas

Proteinmarker (Rainbow) Amersham/Pharmacia

(40)

40 3. Material

3.8 Oligonukleotide/Primer

Die Sequenzen der Oligonukleotide sind in Anhang A aufgelistet.

Chim¨are Proteine HEF-s (KpnI)(9.11.99), VSV/HEF2, VSV/HEF3, VSVG-TA2, HEF/VSVTM-S, HEF/VSVTM-AS, HEF/VSV-STM-S, HEF/VSV-STM-AS,

VSVG-AS(XhoI)

Segment 1 FluC-PB1-KpnI-S, FluC-PB1-XhoI-AS Segment 2 FluC-PB2-AflII-S, FluC-PB2-XhoI-AS

Segment 3 FluC-PB3-AflII-S, FluC-PB3-XhoI-AS, MutaP3S, MutaP3AS

Segment 4 polIHEF-S, polIHEF-AS, HEF(M1)1s, HEF(M1)1as, rFlu2s, rFlu1as, XbaIpolIHEFs, XbaIploIHEFas

Segment 5 FluC/NPs, FluC/NPas, PPolINPs1, PPolINPas4, NPpPolIs3, NPpPolIas2

Segment 6 MatrixS(C/JJ/50), MatrixAS(C/JJ/50) Segment 7 sowie

NS1 und NS2

NSs, NSas, MutaNSs, MutaNSas, NS-ORF-s(AFLII), NS1-ORF-as(XhoI), NS2-ORF-as(XhoI)

GFP PolI/HEF/GFPs/II, HEF/GFPs/II, polI/HEF/GFP-

as/II, HEF/GFPas/II, GFPinHEF(AvrII)s, GFPin- HEF(AvrII)as, HEF-as (11.5.98)

MutaHEF HEF/SEQas2, HEF-s (11.5.98), MutaHEFA321G/

C324Gs, MutHEFA321G/C324Gas, REPMuta321/324- s, REPMuta321/324-as, HEF-S(94), HEFSeqAS3

(41)

3.9. Plasmide 41

Sequenzieren T7, BGHrev, M13/pUC-FOR, M13/pUC-REV, HEF-SEQ1, HEF-SEQ2, HEF-SEQ3, HEF-Seq-AS1, HEF-Seq4, HEF/SEQas2, HEF/Seq1as, NPs1-SEQ, P1 SEQ1s, P1SEQ2s, PB1SEQ1as, PB1SEQ2as, PB1SEQ3as, PB1SEQ3s, PB2SEQ1as, PB2SEQ2as, P2SEQ2s, PB2SEQ3as, PB2SEQ3s, PB3SEQ1as, PB3SEQ2as, PB3SEQ3as, P3 SEQ1s, PB3SEQ3s, P3SEQ2s

3.9 Plasmide

pcDNA 3.1/Zeo (+) Invitrogen pCR^r 2.1-TOPO^r vector Invitrogen

pPolISapIRib (pUC 18 mit dem Promotor der humanen RNA-Polymerase-I und dem Ribozym des Hepatitis-Delta-Virus) wurde von P. Palese aus New York zur Verf¨ugung gestellt.

HEF-M₁ in pCR^r 2.1 sowie M₀, CM₁ und CM₂ in pSG5 sowie VSVEGFP wurden von Dr. Zimmer, Virologie, TiHo, zur Verf¨ugung gestellt.

3.10 Antik¨ orper

Ein polyklonales Serum gegen Influenza-C-Viren (αInfluenza-C) aus dem Kaninchen ist, genauso wie ein monoklonaler Antik¨orper gegen das M-Protein (MABL4) aus der Maus, von Prof. Herrler, Virologie, TiHo, zur Verf¨ugung gestellt worden.

Ein polyklonales Serum gegen das NS1 (ZNS1) aus dem Kaninchen wurde von M. Marschall aus Erlangen zur Verf¨ugung gestellt.

(42)

42 3. Material

Anti-Kaninchen-Immunglobulin vom Esel, FITC-gekoppelt

Amersham/Pharmacia

Anti-Kaninchen-Immunglobulin vom Esel, biotinyliert

Amersham/Pharmacia

Anti-Maus-Immunglobulin vom Schaf, FITC-gekoppelt

Amersham/Pharmacia Anti-Maus-Immunglobulin vom Schaf,

biotinyliert

Amersham/Pharmacia

3.11 Transfektionsreagenzien

SuperFect^{T M} Transfection Reagent Qiagen Lipofectamine^{T M} 2000 Reagent Invitrogen

3.12 Substrate

SuperSignal^r West Dura Extended Duration Substrate Pierce BM Chemoluminescence Blotting Substrate (POD) Roche

3.13 Kits

ALFexpress AutoRead Sequencing Kit Amersham/Pharmacia Expand^{T M} long template PCR Roche

Expand^{T M} Reverse Transkriptase Roche QIAfilter Plasmid MIDI und MAXI Kit Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen QIAquick PCR Purification Kit Qiagen QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen

RNeasy Mini Kit Qiagen

Titan One Tube RT-PCR Roche

TOPO TA Cloning^r Kit Invitrogen

(43)

3.14. Chemikalien 43

3.14 Chemikalien

Aceton Merck

Acrylamidl¨osung 30 %

”rotiporese^r Gel 30“ Roth acytyliertes Trypsin (bovine Pancreas) Sigma

Agar-Agar Roth

Amberlite MB-150 Sigma

Aminocaprons¨aure Sigma

Ammoniumpersulfat (APS) BIO-RAD

Ampicillin Roth

Bacto-Trypton Roth

Blocking-Reagenz Roche

Bors¨aure Roth

Bovines Serumalbumin Roth

Calciumchlorid Roth

Complete, Proteinaseinhibitorcocktail Roche 1,4-Diazobicyclo[2.2.2]octane (DABCO) Sigma

1,4-Dithiotreitol (DTT) Roth

DEPC-behandeltes Wasser MBI-Fermentas

Dinatriumhydrogenphosphat Merck

Dimethylsulfoxid(DMSO) Merck

dNTP Set (4 × 0,25 ml of 100 mM Solution) MBI-Fermentas

Essigs¨aure Roth

Ethanol Merck

Ethylendiamin-Tetracetat (EDTA) Roth

FastRedTR Sigma

Ganglioside (Rinderhirn Ganglioside Typ III) Sigma

Glucose Roth

Glutaraldehyd Sigma

Glycerin Roth

Glycin Roth

Harnstoff Merck

(44)

44 3. Material

Hefeextrakt Roth

IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid ) Roth

Kaliumchlorid Merck

Kaliumhydrogenphosphat Merck

6× Loading Dye Solution MBI-Fermentas

Long Ranger^r Gel Solution (Acrylamidl¨osung) BMA

β-Mercaptoethanol Fluka

Magnesiumchlorid Roth

Methanol Roth

Methylcellulose (4.000 centipoises) Sigma

Mowiol Hoechst

α-Naphthylacetat Sigma

Natriumacetat Merck

Natriumchlorid Roth

Natriumdesoxycholat Roth

N, N-Dimethylformamid (DMF) Merck

Natriumdodecylsulfat (SDS) Roth

Natriumhydrogenphosphat Merck

N,N,N’,N’-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Roth Nonidet^r P40 (4-Nonylphenolpolyethylenglycol) Roth

2-Propanol (Isopropanol) Roth

Paraformaldehyd Sigma

Pepton Roth

Protein-A (Immobilized on Sepharose CL-4B) Sigma

Saccharose Roth

Salzs¨aure Roth

Sulfo-NHS-Biotin Pierce

TRIS-Hydroxymethylaminomethan (TRIS) Roth

Triton-X-100 Roth

Tween 20 Roth

X-Gal (5-Br-4-Cl-3-Indolyl-β-D-Galaktopyranosid) Roth

(45)

3.15. Puffer und L¨osungen 45

Alle anderen nicht aufgef¨uhrten Chemikalien waren ebenfalls vom Reinheitsgrad p.A. oder gleichwertiger Qualit¨at und wurden von den bereits angegebenen Firmen bezogen.

3.15 Puffer und L¨ osungen

10 ×TBE-Puffer:

TRIS 108,0 g

Bors¨aure 53,4 g

EDTA 7,4 g

Reinstwasser ad 1,0 l

10 ×TAE-Puffer:

TRIS 40 mM

Natriumacetat ×3 H2O 20 mM

Der pH-Wert wurde mit konzentrierter Essigs¨aure auf 8,0 eingestellt.

10 ×SDS-Laufpuffer:

SDS 10,0 g

TRIS 30,0 g

Glycin 144,0 g

Sammelgel (5 ml-Ansatz):

H₂O 3,40 ml

TRIS/HCl (1M) pH 6,8 0,63 ml

Acrylamidl¨osung 30 % 0,83 ml

SDS 10 % (in H₂O) 50µl

APS 10 % (in H2O) 50µl

TEMED 10µl

(46)

46 3. Material

Trenngell¨osung (10 %) f¨ur Polyacrylamidgele (10 ml-Ansatz):

H2O 4,0 ml

TRIS/HCl (1,5M) pH 8,8 2,5 ml

Acrylamidl¨osung 30 % 3,3 ml

SDS 10 % (in H2O) 100 µl

APS 10 % (in H₂O) 100 µl

TEMED 16µl

TRIS gepufferte Kochsalzl¨osung (TBS):

TRIS 50 mM

NaCl 150 mM

Der pH-Wert wurde mit HCl auf 7,5 eingestellt.

NP40-Lysispuffer pH 7,5:

NaDesoxycholat 0,5 %

TBS pH 7,5 50,0 ml

Nonidet P 40 (bei 37 °C erw¨armt) 1 %

Bei Bedarf wurden Proteinaseinhibitoren (1 Tbl. Complete) zugesetzt.

Zu 50 ml NP 40 Lysis-Puffer wurde 1 Tablette Inhibitoren (Leupeptin, Pepstatin, PEFA Block 1:1000) gegeben.

2× SDS-Probenpuffer f¨ur Proteingele:

TRIS/HCl, pH 6,8 100 mM

SDS 4 %

Glycerin 20 %

Bromphenolblau 0,02 %

Anoden-Puffer I f¨ur Semi-Dry-Western Blot:

TRIS (1M) 300 ml

Ethanol 200 ml

H₂O 500 ml

(47)

Anoden-Puffer II f¨ur Semi-Dry-Western Blot:

TRIS (1M) 25 ml

Ethanol 200 ml

H2O 770 ml

Kathodenpuffer f¨ur Semi-Dry-Western Blot:

Aminocaprons¨aure 5,25 mg

TRIS (1M) 25 ml

Ethanol 200 ml

H₂O 770 ml

Phosphat gepufferte Kochsalzl¨osung ohne Calcium und Magnesium (PBSM)(pH 7,5):

NaCl 8,00 g

KCl 0,20 g

Na₂HPO₄ 1,15 g

KH₂PO₄ 0,20 g

Phosphat gepufferte Kochsalzl¨osung (PBS)(pH 7,5):

NaCl 8,00 g

KCl 0,20 g

Na₂HPO₄ 1,15 g

MgCl2 ×6 H2O 0,10 g

KH₂PO₄ 0,20 g

CaCl₂ × 2 H₂O 0,13 g

(48)

48 3. Material

Sequenziergel:

H2O 32,00 ml

Harnstoff 21,60 g

Acrylamidl¨osung (Long Ranger) 7,15 ml

Amberlite ca. 1,00 cm³

Das Gemisch wurde 30 Min. in einem verschlossenen Gef¨aß ger¨uhrt, 9,75 ml 10× TBE-Puffer wurden zugegeben und filtriert,

Ammoniumpersulfat (APS) 330 µl

TEMED 33µl

wurden zugegeben, kurz ger¨uhrt und das Gel gegossen.

Die Polymerisierung dauerte ca. 2 - 3 Std..

Mowiol:

Mowiol 2,5 g

Glycerol 6,0 g

Wasser 6,0 ml

Das Gemisch wurde mehrere Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, 12 ml 0,2 M TRIS (pH 8,5) zugegeben und mind. 10 Min. bei 50 °C ger¨uhrt; anschließend bei 5.000×g f¨ur 15 Min. zentrifugiert, 1,4-Diazobicyclo[2.2.2]octane (DABCO) zugegeben, so dass die Endkonzentration 2,5 % betrug, aliquotiert und bei -20°C gelagert.

PBSM + 0,1 % Tween:

PBSM 2,0 l

Tween-20 2,0 ml

Protein-A-Sepharose (50 %)

Protein-A (an Sepharose gekoppelt) wurde in Wasser gel¨ost. ¨Uber Nacht ließ man es quellen, wusch es anschließend dreimal mit Wasser und lagerte es bei 4°C.

acetyliertes Trypsin:

1 mg wurde in 1 ml Medium ohne FKS gel¨ost, sterilfiltriert, aliquotiert und bei -20 °C gelagert.

(49)

1M DTT-L¨osung:

3,09 g DTT wurden in 20 ml einer 0,01 M Natriumacetat-L¨osung gel¨ost, sterilfiltriert, aliquotiert und bei -20 °C aufbewahrt.

Ethidiumbromid:

Stamml¨osung: 1 g/100 ml H₂O

Diese wurde zum F¨arben 1:20.000 verd¨unnt (0,5µg/ml).

3 % Paraformaldehyd:

3 g Paraformaldehyd wurden in 100 ml H2O bei 80 °C gel¨ost, aliquotiert und bei -20 °C aufbewahrt.

Substrat f¨ur die Bestimmung der Esteraseaktivit¨at (10 ml-Ansatz):

9,8 ml PBSM wurden mit 0,2 ml 1 % α-Naphthylacetat und 10 mg FastRedTR gemischt und sterilfiltriert. Die L¨osung wurde immer frisch angesetzt.

25 %ige Saccharose-L¨osung:

2,5 g Saccharose wurden in 10 ml PBSM gel¨ost und bei 50°C gemischt.

Methylcellulose:

2 g Methylcellulose wurden autoklaviert und mit 250 ml zellspezifischem Medium (hier EMEM) mit AB und ohne FKS ca. drei Tage bei 4 °C vermischt.

ACE-Stockl¨osung und ACE-Gebrauchsl¨osung:

Stockl¨osung:

2 mg 3-amino-9-ethylcarbazol wurden in 300 µl Dimethylformamid gel¨ost.

Gebrauchsl¨osung:

Auf 5 ml 50 mM Natriumacetatpuffer (pH 5,0) gab man 300 µl Stockl¨osung und 25 - 50 µl 3 % H₂O₂.

(50)

(51)

4. Methoden

4.1 Molekulare Methoden

4.1.1 RNA-Isolierung

Mit Hilfe des Qiagen RNeasy Kits wurde die Gesamt-RNA nach Angaben des Hersteller- protokolls aus infizierten Zellen gewonnen. Das Prinzip des Kits beruht auf der Tatsache, dass Nukleinsäuren in der Gegenwart von chaotropen Salzen reversibel an Silikate binden. Die infizierten Zellen (siehe Abschnitt 4.4.2.1) wurden zweimal mit PBS gewaschen, mit Hilfe eines Zellschabers (Greiner) von der Unterlage abgelöst und bei 700 × g für 5 Min. bei 4 °C zentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen, die Zellpellets in 350µl Lysis-Puffer (RLT) aus dem Kit, der zuvor mit 1 % β-Mercaptoethanol versetzt wurde, resuspendiert. Es wurde die gleiche Menge, also 350 µl 70 % Ethanol zugefügt und vermischt. Anschließend wurden die Säulen des Kits mit den Proben beschickt. Es folgten Waschschritte, und schließlich wurde die RNA mit RNase-freiem Wasser von den Säulen abgelöst. Die RNA-Konzentration wurde bei 260 nm, wie unter 4.1.5 beschrieben, ermittelt.

4.1.2 Reverse Transkription

Die reverse Transkription dient dem Umschreiben von RNA in eine komplementäre DNA (cDNA), die wiederum sehr effektiv mittels PCR amplifiziert werden kann. Es können entweder Random-Primer (ein Gemisch aus verschiedenen Oligonukleotiden mit Sequenzen zufälliger Basenabfolge) verwendet werden oder, wie in diesem Fall, spezifische Primer.

51

(52)

52 4. Methoden

4.1.2.1 Reverse Transkription mit anschließender Expand ^{T M} long template PCR

Für die Klonierung der Segmente des Influenza-C-Virus wurde die Expand Reverse Tran- skriptase verwendet und alle Schritte auf Eis durchgeführt. Ca. 3 - 4 µg RNA wurde in einem PCR-Reaktionsgefäß mit 2 µl (1 µM) spezifischen Primern gemischt und mit DEPC-behandeltem Wasser auf 11,5 µl aufgefüllt. Nun wurde das Reaktionsgefäß für 10 Min. bei 65°C im Thermocycler und anschließend sofort für 2 Min. auf Eis inkubiert und folgende Substanzen zugefügt:

5 x Puffer 4,0 µl

100 mM DTT 2,0 µl

10 mM dNTP 2,0 µl

RNasin 0,5 µl

reverse Transkriptase 1,0 µl

Nach dem Mischen des Inhaltes wurde das Reaktionsgef¨aß 10 Min. bei 30 °C und dann 45 Min. bei 42 °C inkubiert und anschließend sofort auf Eis gestellt. Die so erhaltene cDNA wurde entweder bei -20 °C gelagert oder sofort f¨ur eine Amplifikation per PCR weiterverwendet.

In dieser Arbeit wurde die Expand^{T M} Long Template PCR angeschlossen:

Nach der Vorbereitung von zwei Master-Mix-Ansätze (MM 1 und MM 2) wurden wieder alle Schritte eisgekühlt durchgeführt.

MM 1:

Wasser ad 22,5 µl

10 mM dNTP 2,5 µl

10µM Primer s 2,5 µl

cDNA 1,5 - 3,0 µl

(53)

4.1. Molekulare Methoden 53

MM 2:

Wasser 17,75 µl

Puffer 3 5,0 µl

25 mM MgCl₂ 1,5 µl Polymerase-Mix 0,75 µl

25 µl MM 2 wurden in das Reaktionsgef¨aß von MM 1 gegeben, vermischt und in einen Thermocycler (der Firma MWG) bei 75 °C f¨ur kurze Zeit inkubiert (sog.hot start).

Dann wurden 2,5µl von dem as-Primer (10 µM) hinzugef¨ugt, gemischt und in den Ther- mocycler gestellt, welcher folgendes Programm durchf¨uhrte:

1 × 94°C 2 Min.

94°C 10 Sek.

10× 58°C 30 Sek., pro Zyklus -0,2 °C 68°C 2 Min./3 kb

94°C 10 Sek.

15× 56°C 30 Sek.

68°C 2 Min./3 kb, pro Zyklus +20 Sek.

1 × 68°C 7 Min.

4°C bis zur weiteren Verwendung

Die Gr¨oße der PCR-Produkte wurde mit Hilfe der analytischen Agarosegelelektophorese uberpr¨¨ uft.

4.1.2.2 Titan One Tube RT-PCR

Für die Helfervirus-gestützten Versuche wurde ein neuerer Kit, der Titan One Tube RT- PCR Kit, verwendet, der die Umschreibung der RNA in cDNA sowie die anschließende Amplifikation in einem Schritt und damit in einem Reaktionsgefäß ermöglichte, welches die Kontaminationsgefahr erheblich verminderte und die Arbeit vereinfachte.

Es wurde mit folgendem Ansatz gearbeitet:

(54)

54 4. Methoden

MM 1:

Wasser ad 25,0 µl

dNTP mix 4,0 µl

DTT 2,5 µl

RNase Inhibitor 1,0 µl 10µM Primer s 2,0 µl 10µM Primer as 2,0 µl

RNA max. 1,0 µg

MM 2:

Wasser 14,0 µl

5 × RT-PCR Puffer 10,0 µl

Enzym-Mix 1,0 µl

MM 2 wurde mit MM 1 gemischt und unter folgenden Bedingungen inkubiert:

1 × 50°C 30 Min.

1 × 94°C 2 Min.

94°C 30 Sek.

10 × 55°C 30 Sek.

68°C 45 Sek., wenn <1 kb 94°C 30 Sek.

25 × 55°C 30 Sek.

68°C 45 Sek.

1 × 68°C 7 Min.

4 °C bis zur weiteren Verwendung

Sp¨atere Variationen von 25 ×: 55°C -0,2 °C pro Zyklus

68°C 45 Sek. + 10 Sek. pro Zyklus