Aus der Klinik für Pferde der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Computermikrographische Analyse morphofunktioneller Veränderungen an flüssig- und tiefgefrierkonserviertem Pferdesamen und deren Beziehung
zur Fertilität
INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von Frauke Reinstorf
aus Lüneburg
Hannover 2003
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. Dr. E. Klug
1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. E. Klug
2. Gutachter: Apl.- Prof. Dr. Dr. Meinecke-Tillmann
Tag der mündlichen Prüfung: 3. Juni 2003
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ...11
2 Literatur...12
2.1 Das Spermatozoon...12
2.2 Morphologie des Spermiums ...12
2.3 Kapazitation ...15
2.4 Akrosomreaktion...18
2.5 Methoden zur qualitativen und quantitativen Beurteilung von Spermien...20
2.6 Bezug einzelner Parameter zur Fertilität ...30
3 Eigene Untersuchungen...34
3.1 Material und Methoden...34
3.1.1. Versuchstiere ...34
3.1.2 Samengewinnung ...35
3.1.3. Samenuntersuchung ...35
3.1.4. Versuchskonzeption...36
3.1.5. Untersuchungsparameter ...41
3.1.5.1. Computermikrographische Motilitätsanalyse ...41
3.1.5.2. Morphologische Auswertung ...41
3.1.5.3. Hypoosmotischer Schwelltest (HOST) ...43
3.1.5.4. Fluoreszenzfärbungen ...44
3.1.5.4.1. Färbungen des Frischsamens des Hauptversuchs ...44
3.1.5.4.1.1. Carboxyfluoreszeindiazetat-Propidiumiodid-Färbung (CFDA/PI)...44
3.1.5.4.1.2. Fluoreszeinisothiocyanat- PNA/ Propidiumiodid-Färbung (FITC/PNA-PI) ...45
3.1.5.4.2. Färbungen des Tiefgefriersamens ...47
3.1.5.4.2.1 SYBR-14®/PI-Färbung...47
3.1.5.4.2.2. FITC-PNA/PI-Färbung...49
3.1.5.4.2.3. JC-1-Färbung...52
3.1.5.4.3. Färbungen für die durchflusszytometrische Auswertung...55
3.1.6. Fertilitätsparameter...56
3.1.7. Computermikrographische Auswertung mittels analySIS®3.0... ...57
3.1.8. Statistische Methoden ...59
4 Ergebnisse ...59
4.1 Reproduzierbarkeit der Untersuchungsmethoden...59
4.2 Einfluss von Aufbereitungsverfahren auf flüssig- und tiefgefrierkonservierten Pferdesamen...61
4.2.1 Einfluss von Verdünnung und Zentrifugation auf flüssigkonservierten Frischsamen und Einfluss der Tiefgefrierung nach unterschiedlichen Lagerungszeiten auf die Qualität von Tiefgefriersamen...61
4.2.2 Effekte der Lagerungsdauer auf die Qualität von verdünntem und zentrifugiertem Frischsamen...64
4.3. Einfluss der Saison auf die spermatologischen Parameter...66
4.3.1. Jahreszeitliche Unterschiede in der Morphologie des Nativsamens ...66
4.3.2. Jahreszeitliche Unterschiede der Spermienfunktion im Frischsamen...67
4.3.3. Jahreszeitliche Unterschiede der Spermienfunktion im Tiefgefriersamen ...68
4.4. Vergleich der Untersuchungsparameter...70
4.4.1. Korrelation der Frischsamenergebnisse untereinander ...70
4.4.2. Korrelation der Tiefgefriersamenergebnisse untereinander ...71
4.5. Vergleich der Frischsamenergebnisse und der Tiefgefriersamenergebnisse ...74
4.6. Interindividuelle Schwankungen der Samenparameter...76
4.7. Bezug zur Fertilität...78
5 Diskussion ...93
6 Zusammenfassung... 108
7 Summary... 111
8 Literaturverzeichnis ... 114
9 Anhang ... 132
9.1 Verzeichnis der Abbildungen...132
9.2. Verzeichnis der Tabellen...133
9.3. Parametereinstellungen der Motilitätsanalyse...134
9.4. Zusammensetzung der Stamm- und Färbelösungen...135
9.5. Geräte und Einstellungen der computermikrographischen Auswertung...139
Verzeichnis der Abkürzungen
Abb.= Abbildung
ATP = Adenosintriphophat bidest. = bidestillata
BSA = Bovines Serum Albumin bzw. = beziehungsweise
ca. = circa
cAMP = zyklisches Adenosinmonophosphat CASA = Computer-Assisted Sperm Analysis CASY = Cell Analyser System
CFDA = Carboxyfluoreszeindiazetat CRISPs = Cystein- Rich-Secretory-Proteins CTC = Chlortetracyclin
CV = coefficient of variation; Variationskoeffizient d.h. = das heißt
DMSO = Dimethylsulfoxid DNA = Desoxyribonukleinsäure et al. = und andere
FITC = Fluoreszeinisothiocyanat
fluo 3-AM = Fluoreszenzsonde (Ca2+-Indikator) g/l = Gramm/Liter
GSZ = Gesamtspermienzahl h = Stunde
H = Heparin
HOST = Hypoosmotischer Schwelltest HSP 1- 2 = Horse Seminal Protein 1- 2 HZA = Hemizona Assay
IP3 = Inositol-1,3,5-triphosphat
JC-1 = Tetrachlorotetraethylbenzimidazolylcarbocyaniniodid kg = Kilogramm
L = Länge
Mio = Million ml = Milliliter mm = Millimeter mM = Millimolar mOsmol = Milliosmol Mrd = Milliarden n = Anzahl nm = Nanometer
P = Irrtumswahrscheinlichkeit PBS = Phosphate Buffered Saline PI = Propidiumiodid
PKA = Proteinkinase A PNA = Peanut Agglutinin PSA = Pisum sativum Agglutinin r = Korrelationskoeffizient Rh 123 = Rhodamin 123 RNA = Ribonukleinsäure
ROS = Reactive Oxygen Species
SCSA = Sperm Chromatin Structure Assay sec = Sekunde
SYBR-14® = DNA-Farbstoff für lebende Zellen SYTO-17 = Lebendfarbstoff
SZ = Samenzellen TG = Tiefgefrierung
V = Anteil vorwärtsbeweglicher Samenzellen z.B. = zum Beispiel
z.T. = zum Teil
± SD = Standardabweichung µl = Mikroliter
µm = Mikrometer X
=
Mittelwert Ø = Durchmesser1 Einleitung
Die Untersuchung biologischer Spermienfunktionen ist in der andrologischen tierärztlichen Praxis nach wie vor ein wesentlicher Teil der Beurteilung der zu erwartenden Fruchtbarkeitsleistung von Zuchthengsten. Seit vielen Jahren werden verschiedene In-vitro- Tests an Spermien durchgeführt, um eine möglichst genaue Befruchtungsfähigkeit vorauszusagen. Dabei widersprechen sich die Ergebnisse hinsichtlich der Korrelationen zur Fertilität. Beziehungen spermatologischer Befunde zu den Fertilitätsergebnissen sind häufig gering. Dieses ist meist darauf zurückzuführen, dass nur einige der spermatologischen Funktionen überprüft werden, die das Spermium zur Befruchtung einer Eizelle benötigt. Ein weiteres Problem der Korrelation von Laboruntersuchungen und der Fertilität ist, dass die Fertilität nicht nur von der Samenqualität, sondern auch von der Anzahl an inseminierten Spermien abhängt. Weiterhin unterliegen einige Untersuchungen der Subjektivität des Untersuchers und hängen von der Wiederholbarkeit der Methoden und der Schnelligkeit der Versuche ab. Kombiniert man mehrere Tests miteinander, so erhöhen sich häufig die Korrelationen (GRAHAM 2001).
In dieser Arbeit wird die Morphologie von Nativsamen sowie die Motilität, die Vitalität, die Intaktheit der Plasmamembran, das hypoosmotische Schwellvermögen, der akrosomale Zustand und die Mitochondrienaktivität von flüssig- und tiefgefrierkonservierten Spermien ausgewertet. In verschiedenen Versuchsabschnitten soll neben der Reproduzierbarkeit der Beurteilungsmethoden, der Einfluss verschiedener Aufbereitungsmethoden auf die Qualität des Samens sowie der saisonale Einfluss an Ejakulaten von 69 Hengsten zu drei unterschiedlichen Jahreszeiten (November, März, Juli) untersucht werden. Die spermatologische Auswertung erfolgt mittels computergestützter Motilitätsanalyse (MIKA Motion Analyser, Windows Version 1.1., Stroemberg Mika Medical, Montreux, Belgien), Messung des hypoosmotischen Schwellvermögens (Cell Analyser System Casy 1, Modell TTC, Schärfe System GmbH, Reutlingen), computergestützter fluoreszenzmikroskopischer Analyse (analySIS®3.0, Fa. Soft Imaging System GmbH; Deutschland, Münster) sowie Durchflusszytometrie (FACScan®, Becton-Dickinson, Heidelberg). Die Ergebnisse werden einander gegenübergestellt und deren Beziehung zur Fertilität soll herausgestellt werden.
2 Literatur
2.1. Das Spermatozoon
Das Spermatozoon ist das Produkt der Spermiogenese. Zu Beginn der Spermiogenese vermehren sich Spermatogonien, die einen diploiden Chromosomensatz besitzen, durch mitotische Teilung und werden zu den Spermatozyten I. Ordnung. Durch meiotische Teilung erlangen sie einen haploiden Chromosomensatz und werden zu Spermatozyten II. Ordnung.
Nach einer zweiten Reifeteilung entstehen jeweils vier haploide Spermatiden. Die Spermatiden unterliegen einer vierphasigen Umwandlung, so dass das hochdifferenzierte Spermium mit chromatin-enthaltendem Spermienkopf, Akrosom und Geißel entsteht.
(SINOWATZ 2000).
2.2. Morphologie des Spermiums
Das Spermium wird in drei hochspezialisierte Regionen unterteilt: den DNA–enthaltenden Kopf, das Mittelstück mit den darin enthaltenden energieproduzierenden Mitochondrien und die Geißel, welche die Motilität ermöglicht (GADELLA 2001). SETCHEL (1982) unternimmt eine Unterteilung des Spermiums in Spermienkopf und Spermienschwanz, wobei der Schwanz in Halsstück, Mittelstück, Haupt- und Endstück gegliedert ist. Das Spermium ist komplett von der Plasmamembran umgeben, die in ihrer Struktur dem Fluid-Mosaik-Modell für Biomembranen (SINGER u. NICHOLSEN 1972) entspricht. Sie besteht aus einer Lipiddoppelschicht, in die in regelmäßigen Abständen globuläre Proteine, Cholesterin und Kohlenhydrate einbettet sind. Das Cholesterin übernimmt hierbei die Aufgabe der Membranstabilisierung.
Dem Spermienkopf liegt das Akrosom auf, dessen hydrolytische Enzyme für die Penetration der Zona pellucida notwendig sind. Das Akrosom besteht aus der akrosomalen Matrix, welche von der inneren kernnahen akrosomalen Membran und der äußeren akrosomalen Membran umgeben ist. Am Äquatorialsegment gehen diese beiden Membranen ineinander über.
Zwischen der Kernmembran und der inneren akrosomalen Membran befindet sich der subakrosomale Zytoplasmaraum. BAUMGARTL (1980) nimmt eine weitere Einteilung des
Akrosoms in Apikal-, Haupt- und Äquatorialsegment vor. Die kraniale Akrosomregion und das Äquatorialsegment sind entscheidend bei der Bindung der Spermien an die Zona pellucida der Eizelle (YANAGIMACHI 1988).
Der Zellkern nimmt den größten Anteil des Kopfes ein. Seine Kernmembran liegt der inneren Akrosommembran direkt an. Das Chromatin des Kernes ist stark kondensiert und weist einen haploiden Chromosomensatz auf.
Zwischen Kopf und Mittelstück befindet sich das kurze und verjüngte Halsstück. Es handelt sich um eine gelenkartige Verbindung zwischen Kopf und Schwanz. Dabei ist der Gelenkkopf die Verbindung zwischen der Implantationsgrube des Kernes und dem proximalen Zentriol.
An der sogenannten Basalplatte kommt es oft zu Brüchen. Aus dem proximalen Zentriol geht der Achsenfaden hervor, welcher radialsymmetrisch aufgebaut ist. Dabei ordnen sich neun Doppelmikrotubuli um zwei zentrale Mikrotubuli. Im Bereich des Mittelstückes legen sich neun Außenfibrillen um die Doppelmikrotubuli sowie eine einfache Schicht von Mitochondrien.
Die Mitochondrien bestehen aus einer glatten äußeren Membran und einer stark gefalteten inneren Membran. Als Kraftwerke der Zelle sorgen sie für die Energiebereitstellung im Spermium. Sie synthetisieren über die Glykolyse und die oxidative Phosphorylierung ATP- Moleküle (MANN u. LUTWAK-MANN 1981), die in erster Linie für die Fortbewegung gebraucht werden (GRAVANCE et al. 2000). Zwischen der Innenseite und der Außenseite der inneren Mitochondrienmembran besteht ein elektrochemischer Gradient, das sogenannte Mitochondrienmembranpotential (MMP), welches bei –180 mV bis –200 mV liegt (COSSARIZZA et al. 1996). Das MMP gibt Informationen über die mitochondriale Funktion und somit über den Energiestatus im Spermium (COSSARIZZA et al. 1993).
Das Mittelstück wird durch das distale Zentriol von dem Hauptstück abgegrenzt.
Das Hauptstück verjüngt sich durch eine Umfangsabnahme der Fibrillen und ist von einer Schicht fibrillärer Proteine umgeben. Diese sogenannte Ringfaserscheide besteht aus zwei durch Ringfasern verbundene Halbschalen. Schließlich folgt das Endstück, welches aus dem Achsenfaden besteht und von Plasmalemm umgeben ist (SETCHEL 1982).
Hengstspermien gleichen in ihrem morphologischen Aufbau dem anderer Säugetierspezies.
Dabei sind asymmetrische Köpfe, ein abaxialer Schwanzansatz, ein relativ geringes Volumen des Akrosoms und die Anwesenheit von Mikrotubuli im Bereich des Halses hengst- spezifische Charakteristika (HANCOCK 1957; DOTT 1975)
In Abbildung 1 ist der schema tische Aufbau eines equinen Spermiums dargestellt.
Abb. 1. Aufbau eines Spermiums ( modifiziert nach GADELLA et al. 2001)
A: Darstellung der einzelnen Abschnitte des Spermiums
B: Darstellung der Subdomänen der Plasmamembran des Spermienkopfes
1. Plasmamembran, 2. äußere akrosomale Membran, 3. akrosomaler Inhalt, 4. innere akrosomale Membran, 5. Kernmembran, 6. Kern, 7. Verbindungsstück, 8. Mitochondrien, 9. proximaler Teil des Schwanzes (Mittelstück), 10. Schlussring, 11. distaler Teil des Schwanzes (Hauptstück und Endstück), 12. Ringfaserscheid,e, 13-15: Akrosom,
13. Apikalsegment, 14. prääquatoriales Segment, 15. äquatoriales Segment, 16.
postäquatoriales Segment
Größenangaben einzelner Abschnitte equiner
Spermatozoen
Kopf (L) 7µm
Mittelstück (L) 10µm Mittelstück (Ø) 0,9µm Hauptstück (L) 40µm Hauptstück (Ø) 0,6µm Endstück (L) 4µm
A B
2.3. Kapazitation
Nach dem Verlassen des Hodens und der Passage des Nebenhodens kommt es zu einem Reifungsprozess, durch den das Spermium seine Befruchtungsfähigkeit erlangt und sich progressiv fortbewegen kann. Mit Verlassen des Hodens stellt das Spermium die Produktion von Plasmamembranproteinen und Plasmamembranlipiden, sowie den vesikelgebundenen Transport ein (GADELLA et al. 2001), wodurch es zu einer für das reife Spermium spezifischen Organisation der Lipide in der Plasmamembran kommt.
Nach der Ejakulation verliert das Spermium diese Befruchtungsfähigkeit zunächst wieder. Es stellt sich der Zustand der „Dekapazitation“ ein, der durch verschiedene epididymale und seminale Komponenten hervorgerufen wird. Die Dekapazitation führt zu einer Plasmamembranstabilisierung, so dass eine frühzeitige Degeneration und eine verfrühte Kapazitation und Akrosomreaktion verhindert wird (TÖPFER-PETERSEN et al. 1996, Übersichtsartikel).
Im weiblichen Genitaltrakt schließt sich die Kapazitation an, ein von AUSTIN und CHANG (1952) erstmals beschriebener weiterer Reifungsprozess des Spermiums. Dieser Prozess ist für das Spermium notwendig, um eine Eizelle befruchten zu können und umfasst sämtliche biochemischen Umwandlungen, die einerseits zu einer hyperaktiven Bewegung des Spermiums führen und andererseits die Struktur der Plasmamembran komplex verändern.
Die Plasmamembran des Hengstes besteht zu 57% aus Phospholipiden, zu 37% aus Cholesterin und zu 6% aus Glykolipiden (GADELLA et al. 2001). Im Vergleich dazu ist die Zusammensetzung der Plasmamembran des Ebers zu 67% aus Phospholipiden, zu 25% aus Neutrallipiden und zu 8% aus Glykolipiden aufgebaut (VOS et al. 1994).
Die Spermienoberfläche ändert sich während des Kapazitationsvorganges durch Beseitigung einiger Bestandteile der Glykokalix (SAXENA et al. 1986), durch Adsorption neuer Komponenten aus dem weiblichen Genitalfluid und durch enzymatische Veränderungen von Glykokalixkomponenten (MAHMOUD u. PARRISH 1996; REVAH et al. 2000).
Der Umbau der Plasmamembran erfolgt stufenweise. Als Ort der Umwandlungen der Spermatozoen wird der kaudale Isthmus des Eileiters angegeben (TÖPFER-PETERSEN u.
WABERSKI 2001, Übersichtsartikel). Die Destabilisierung der Plasmamembran wird durch den Efflux von Cholesterol und durch die Veränderung des Cholesterin-Phospholipid- Verhältnisses erreicht. Diese Prozesse werden durch sterolbindende Proteine des weiblichen
Genitalsekretes induziert und führen zu einer gesteigerten Fluidität der Membran (ZARINTASH u. CROSS 1996). Als weitere Folge der Destabilisierung der Plasmamembran kommt es zu einer Konformationsänderung der Membranproteine und zur Freilegung Zona pellucida-bindender Strukturen (TÖPFER-PETERSEN et al. 1996, Übersichtsartikel).
Eine wichtige Rolle im Kapazitationsprozess spielt der Einstrom von Kalzium in die Zelle, der von mehreren Substraten beeinflusst wird und von einem pH-Anstieg und einer Veränderung in der Plasmamembran begleitet wird. So wird vom Endometrium ein Sialinsäure-bindendes Protein sezerniert, das sich an die Kopfregion des Spermiums bindet und bei nicht kapazitierten Spermien einen Einstrom von extrazellulärem Kalzium bewirkt (ROVAN 2000a, Übersichtsartikel). Das Protein dient dem Spermium weiterhin als Energiequelle, da es durch N-Azetyl-Neuraminsäure-Aldolase zu Pyruvat abgebaut wird (BANERJEE u. CHOWDHURY 1995). Der Kalziumeinstrom und die Bereitstellung energiereicher Substrate sind eine Voraussetzung für die Hyperaktivierung der Geißelbewegung. Nur ein hyperaktives Spermium mit lateral ausgeprägter Schlagfrequenz der Geißel hat die Möglichkeit sich vom Schleimhautepithel des Oviduktes zu befreien und die Oozyte mit den Kumuluszellen zu finden (ROVAN 2000b, Übersichtsartikel).
Während das Spermium sich auf dem Weg zur Oozyte befindet, kommt es mit freien Radikalen in Kontakt. Dieses verursacht eine Lipidperoxidation der Spermienmembran durch reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species = ROS) ( PLANTE et al. 1994; WOLFF et al. 1990). Die Sauerstoffspezies werden sowohl von Leukozyten gebildet als auch von Samenzellen als Folge der Geißelaktivität (GAVELLA u. LIPOVAC 1992; AITKEN et al.
1997). In der Folge wird die Spermienfunktion auf zwei verschiedene Wege beeinflusst. Zum einen wirkt sich eine milde Peroxidation positiv auf die Kapazitation aus, indem die spermienspezifische PKA (Proteinkinase A) (LECLERC et al. 1997; AITKEN et al. 1995) und die Tyrosinkinase aktiviert werden (LECLERC et al. 1997). Die Superoxidanionen induzieren die Hyperaktivität der Spermien und erhöhen ihre Affinität für die Zona pellucida (GADELLA et al. 2001). Zum anderen bewirkt die Lipidperoxidation eine Destabilisierung der Spermienmembran, die sich in einer Erhöhung der Permeabilität und in einem damit verbundenden Verlust von intrazellulären Bestandteilen wie Enzymen, Koenzymen und Elektolyten äußert. Im weiteren Verlauf kommt es zum Agglutinieren der Spermien (SIEGEL et al. 1986), einem Aufbrauchen des ATP-Gehaltes (GRIVEAU et al. 1995) und einer Hemmung der Mitochondrienaktivität (BECONI et al. 1993). Diese drei Komponenten
wirken einer Befruchtung entgegen. BAUMBER et al. (2000) untersuchen den Einfluss von ROS auf die Motilität, die Lebensfähigkeit, die akrosomale Integrität, das mitochondriale Potential und die Lipidperoxidation der Membran von Hengstspermien mittels eines Xanthin- Xanthinoxidase-Systems (X-XO-System). Es kann von ihnen lediglich ein Einfluss von ROS auf die Motilität ermittelt werden. Zur Reduzierung des negativen Einflusses der ROS auf das Spermium kann das Enzym Katalase einer Spermiensuspension zugesetzt werden, welches eine Abnahme der Motilität verhindert. Weiterführende Untersuchungen von BALL et al.
(2001) können keinen signifikanten positiven Einfluss von Katalase oder verschiedenen fett- oder wasserlöslichen Antioxidantien auf die Spermienmotilität nachweisen.
In der Abbildung 2 ist der Kapazitationsprozess schematisch dargestellt.
Abb. 2: Schematische Darstellung der initialen Vorgänge des Kapazitationsprozesses (nach TÖPFER-PETERSEN u. WABERSKI 2001)
(a) Oberflächenassoziierte Proteine schützen die Spermienoberfläche
(b) Oberflächenassoziierte Proteine werden entfernt; die Membran wird permeabel für Kalziumionen; Cholesterin kann mit Hilfe lipidbindender Proteine des weiblichen Genitaltraktes aus der Spermienmembran entfernt werden.
(c) Die Spermienmembran besitzt nun eine erhöhte Fluidität, die die Reorganisation mobiler Membranproteine und die Bildung von proteinfreien Mikrodomänen fördert.
4. Akrosomreaktion
Die Akrosomreaktion folgt der Kapazitation und ist durch die Freisetzung der im Akrosom gespeicherten lytischen Enzyme gekennzeichnet. Dabei erfolgt eine Verschmelzung der Plasmamembran mit der äußeren Akrosommembran, eine Vesikulierung und Auflösung der Membran, in deren Folge die lytischen Enzyme freigesetzt werden. Das Spermium ist erst danach in der Lage, die Zona pellucida zu penetrieren, um mit der Eizelle zu verschmelzen (YANAGIMACHI 1988).
Der eigentliche Auslöser der akrosomalen Reaktion ist die spezifische Bindung der Plasmamembran des Spermiums an die Glykoproteine der Zona pellucida (FLORMAN u.
FIRST 1988). Dabei werden die Oberflächenrezeptoren des Spermiums aktiviert, welche eine Öffnung von Kalziumkanälen und somit den Kalziumeinstrom in die Zelle bewirken (FLORMAN et al. 1993; FRAZER 1993). Diese Erhöhung des intrazellulären Kalziumspiegels bewirkt einen Anstieg des pH-Wertes in der Zelle, eine Abnahme der negativen Ladung der Spermienoberfläche und in der weiteren Folge eine Destabilisierung der Plasmamembran.
An humanen Spermien konnte festgestellt werden, dass intrazellulär verschiedene second- messenger-Systeme aktiviert werden. Guaninnukleotid-bindende-Proteine (G-Proteine) regulieren die Aktivität von Adenylatzyklase und Phospholipase C. Die Aktivierung der Adenylatzyklase bewirkt über eine Anreicherung von cAMP in der Samenzelle, dass die Proteinkinase A verschiedene Proteine phosphoryliert. Nach einer Aktivierung der Phospholipase C entstehen Inositoltriphosphat (IP3) und Diacylglycerin. Diacylglycerin aktiviert die Proteinkinase, die wiederum über die Aktivierung der Phospholipase A2
Membranphospholipide zu Arachidonsäure abbaut, welche die Fusionsprozesse auslösen (CHAN u. TUCKER 1991).
Die freigesetzten Enzyme Akrosin und Hyaluronidase spielen eine wichtige Rolle bei der Akrosomreaktion. Proakrosin wird durch Kontakt mit der Zona pellucida in die aktive Form Akrosin umgewandelt. Akrosin haftet aufgrund seiner kohlenhydratbindenden Eigenschaft an der inneren Akrosommembran und bewirkt somit sekundär die Bindung des akrosomreagierten Spermiums an die Zona pellucida, sowie die Penetration der Zona pellucida als sogenannter sekundärer Rezeptor (TÖPFER-PETERSEN u. HENSCHEN 1987).
In Abbildung 3 sind die Veränderungen am Spermatozoon im Verlauf der Akrosomreaktion schematisch dargestellt.
Abb. 3: Schematische Darstellung einiger morphologischer Veränderungen im Verlauf der Akrosomreaktion von Säugetierspermatozoen (nach YANAGIMACHI 1981)
A: Das akrosomintakte Spermatozoon;
B: Fusion der äußeren akrosomalen Membran und der Plasmamembran;
C, D: Membranvesikel, bestehend aus Resten der Plasmamembran und äußerer akrosomaler Membran
PM: Plasmamembran AM: Akrosommembran
2.5. Methoden zur qualitativen und quantitativen Beurteilung von Spermatozoen
Zur Bewertung von Spermien stehen konventionelle Methoden und neue Methoden zur Verfügung. Die Bewertung von Spermien soll eine möglichst genaue Aussage über die Fähigkeit des Spermiums, eine Befruchtung durchführen zu können, bringen. Für MAGISTRINI (2000) sind die Voraussetzungen hierzu Intaktheit von Akrosom und Plasmamembran, intaktes Chromatin, intakte Mitochondrien sowie ein normal ausgebildeter Schwanz. Nur das Vorhandensein und die Intaktheit aller dieser Bereiche des Spermiums befähigt das Spermium zur Befruchtung.
Als konventionelle Parameter werden bei Hengsten das gelfreie Volumen, das gelenthaltende Volumen, die Spermienkonzentration in einem Milliliter, die Gesamtspermienzahl pro Ejakulat sowie der pH-Wert bestimmt. Makroskopisch werden die Farbe und die Konsistenz untersucht. Die Farbe sollte weiß sein. Abweichungen in Richtung rot, gelb und braun lassen auf Blutbeimengungen, Urin sowie Entzündungsprodukte schliessen. Die Konsistenzangaben wässrig, molkig, milchig und rahmig lassen einen Schluß auf die Dichte des Ejakulates zu (WEITZE 2000a, Übersichtsartikel).
Eine qualitative Aussage über die Spermien geben die prozentualen Anteile von vorwärtsmotilen und ortsmotilen Spermien in rohem Samen und frischverdünntem Samen, Halteproben zu bestimmten Zeitpunkten (6, 12, 24, 48 und 72 Stunden) nach Verdünnen und eine morphologische Beurteilung von Nativausstrichen. VIDAMENT et al. (1999) sehen die Motilitäten von Hengstsamen nach Lagerung für 24 h und 48 h bei 4°C als ein wichtiges Kriterium zur Auswahl von Hengsten an, deren Samen für die Tiefgefrierung genutzt werden soll. Die lichtmikroskopische Untersuchungsmethode wird mit einem Phasenkontrast- mikroskop (Vergrößerung 150 bis 200- fach) mit beheizbarem Tisch (37°C) durchgeführt.
Der pH-Wert liegt im Hengstejakulat zwischen 6,8 und 7,4 und kann leicht mit einem pH- Papier bestimmt werden. Routinemäßig wird der Schleim durch einen Papierfilter von der gelfreien Phase getrennt, da sich der Schleim negativ auf die Haltbarkeit des Samens in vitro auswirkt. Zur Ermittlung der Dichte werden eine Zählkammer, ein Photometer oder ein Cell Counter genutzt. Die Gesamtspermienzahl ist im Hinblick auf das Spermien- bildungsvermögen und den Spermienausstoß eines Hengstes ein wichtiges Kriterium und korreliert eng mit der Leistungsfähigkeit der Hoden (PICKETT 1993).
Neben der schon beschriebenen konventionellen Methode der subjektiven Motilitätseinschätzung nach vorwärts-, orts- und unbeweglichen Spermien, ist die objektive, computergestützte Motilitätsanalyse eine gängige Methode zur Spermabeurteilung. Hierzu stehen das Cellsoftsystem (Stroemberg Mika) oder der Hamilton Thorne Motility Analyser zur Verfügung. Das System CASA (Computer Assisted Sperm Analysis) bewährt sich nach JASKO et al. (1988) und BLACH et al. (1989) zur Untersuchung von Motilitätskriterien von Hengstsamen. Es wird der prozentuale Anteil der vorwärts- und ortsbeweglichen Spermien (STR = straightness; CIR = circular motile spermatozoa), die Linearität der Bewegung (LIN = linearity; VSL = straight line velocity; VCL = curvilinear velocity) und die Spermiengeschwindigkeit beurteilt (VAP = velocity-average-path). MALMGREN et al.
(1997) sehen in einem weitergehenden Vergleich der konventionellen, mit dem Auge beurteilten Motilitätseinschätzung und der computergestützten Methode eine Möglichkeit, eine bessere Aussage hinsichtlich der Fertilität zu bekommen. In vergangenen Studien gibt es unterschiedliche Aussagen, die von keiner Korrelation der Motilität zur Fertilität (DOWSETT u. PATTIE 1982) bis zu einer positiven Korrelation reichen (SAMPER et al 1991, JASKO et al. 1992).
Die Beurteilung des morphologischen Status ist ein weiterer wichtiger Parameter zur Einschätzung der Spermienqualität. LEIDL et al. (1971) unterscheiden zwischen normalen und anomalen Spermien. Die anomalen Spermien werden wiederum in Spermien mit primären und sekundären Veränderungen unterteilt. Die primären Veränderungen beinhalten zum einen seltene, vermutlich angeborene und generalisierte Defekte, zu denen Akrosomdefekte, spezifische Kopfdeformationen und ausgefranste Mittelstücke gehören.
Zum anderen treten unspezifische Defekte auf, die häufig durch Noxen bedingt sind und nicht generalisiert vorkommen. Diese Veränderungen beinhalten Kopfveränderungen, wie Birnen-, Zwerg- und Riesenform, Veränderungen des Mittelstückes und des Schwanzes, sowie Doppelmissbildungen. Die sekundären Veränderungen in dieser Einteilung beinhalten abgelöste Köpfe und Kopfkappen, sowie Krümmlinge. PARLEVLIET (1999) unternimmt in Anlehnung an diese Beurteilung der Spermiendefekte eine Einteilung in „major defects“
(Hauptdefekte) und „minor defects“ (kleine Defekte). Zu den „major defects“ zählen abnorme Köpfe, ein proximaler Plasmatropfen und abnorme Mittelstücke. Als „minor defects“ werden ein abgelöstes Akrosom, distale Plasmatropfen und Schwanzfehler angesehen. Die geringe Kopfgröße des Hengstspermiums macht eine morphologische Beurteilung des Akrosoms im
Phasenkontrastmikroskop zu unsicher (AURICH et al. 1995). Als kennzeichnende Merkmale für Hengstspermien können HANCOCK (1957) und DOTT (1975) asymmetrische Köpfe, abaxiale Schwanzansätze, das relativ geringe Volumen des Akrosoms und die Anwesenheit von Mikrotubuli im Bereich des Halses herausstellen.
Die morphometrische Untersuchung von Spermienkopfanomalien wird in Speziallaboratorien mittels computergestützter Mikroskopie durchgeführt. Es werden hierzu die ASMA-Software (automated sperm morphology analysis, Hamilton Thorne Research, Beverly, MA, USA) und die SAMBA-TM2005-Software (cell image analyser systems, BioLogics.inc., Gainesville, USA) und überwie gend Feulgen- oder Hämatoxylin-Färbungen eingesetzt (DAVIS et al.
1993, BALL u. MOHAMMED 1995). Morphometrische Untersuchungen von CASEY et al.
(1997) zeigen eine Vergrößerung des Spermienkopfes in der Länge, Breite, Fläche und im Umfang bei subfertilen Hengsten.
Eine weitere Betrachtung des Zellkerns ist besonders wichtig, da er die Erbmasse mit ihren Informationen enthält. MAGISTRINI (2000) vermutet, dass ein abnormales Chromatin für Spermienkopfanomalien ursächlich ist.
Eine Methode zur Beurteilung des Chromatins ist der SCSA (sperm chromatin structure assay), bei dem die Empfindlichkeit der DNA auf Säuredenaturierung mikroskopisch oder durchflusszytometrisch beurteilt wird. Dabei wird zwischen der mit Akridin-Orange angefärbten einsträngigen, denaturierten DNA und der sich grün anfärbenden, normalen DNA unterschieden. EVENSON et al. (1980 u. 1994) und BALLACHEY et al. (1988) finden eine direkte Beziehung von der Chromatinstruktur zur Fertilität bei Bullen und Ebern heraus.
KENNEY et al. (1995) beschreiben bei der Beurteilung von Pferdesamen, dass ein hoher COMPat- Wert (Prozentzahl an anormalen Spermien mit denaturierter DNA) negativ mit der Trächtigkeitsrate, morphologisch normalen Spermien und den motilen Spermien in Prozent korreliert.
Die Lebensfähigkeit der Spermien wird durch die Plasmamembranintegrität bestimmt, welche man mit Hilfe von Lebend/Tot-Färbungen ermitteln kann. Lebende und tote Spermien werden hierbei unterschiedlich angefärbt, indem intakte und defekte Plasmamembranen unterschiedlich durchlässig für Farbstoffe sind. Bei der Eosin-Nigrosin-Färbung wird eine intakte Zelle aufgrund ihrer unversehrten Plasmamambran nicht angefärbt. Im Gegensatz dazu ermöglicht eine defekte Plasmamembran das Eindringen des Farbstoffes und somit eine Färbung des Zellinneren (DOTT und FOSTER 1972). Die neueren Lebend/Tot-Färbungen
basieren auch auf diesem Ausschlussprinzip. Dabei stehen Fluoreszenzfarbstoffe zur Verfügung, die eine sicherere und genauere Aussage ermöglichen, da sie sich nicht nur zur mikroskopischen Auswertung eignen, sondern auch zur durchflusszytometrischen Analyse.
Zur Anwendung gelangen zum einen eine kombinierte DNA-Färbung aus CFDA/PI (6- Carbofluoreszeindiazetat/Propidium- iodid) und zum anderen SYBR-14®/PI.
Das CFDA ist nicht fluoreszierend. Es ist in der Lage die intakte Zellmembran zu durchdringen, wird intrazellulär durch Esterasen zu 6-Carbofluoreszein umgewandelt und fluoresziert grün. Als Kontrafärbung dient Propidiumiodid (PI), welches durch die defekte Plasmamembran in das Zellinnere gelangt und die DNA rot färbt (HARRISON u. VICKERS 1990). Die CFDA/PI-Färbung gibt einen Aufschluss über den Zustand der Zellkompartimente Akrosom, Spermienkopf, Mittelstück und Spermienschwanz. Sie ermöglicht es, eine prozentuale Einschätzung der funktionsfähigen Spermien zu erlangen. ALTHOUSE und HOPKINS (1995) berichten über eine aussagefähigere Einschätzung funktionsfähiger Spermien mittels CFDA/PI- Färbung als mittels Motilitätsbewertung.
Die SYBR-14®/PI-Färbung ist eine schnelle und einfache Methode, eine Aussage über die lebende und tote Population von Spermien zu erlangen und wurde von GARNER et al. (1994) entwickelt. SYBR-14® ist membranpermeabel, erscheint hellgrün und zeigt den Anteil lebender Spermien. Es emittiert Licht nach optischer Anregung von 488 nm bei einem Emissionsmaximum von 516 nm. Neben der grünen, lebenden und der roten, toten Population wird noch eine moribunde Population beschrieben, wobei bei absterbenden Spermien der zunächst grüne Farbstoff durch den roten Farbstoff ersetzt wird. Die Ausbreitung des roten PI-Farbstoffes erfolgt von posterior nach anterior. Da die moribunden Spermien bereits Defekte in der Plasmamembran aufweisen, werden sie von GARNER und JOHNSON (1995) zu den toten Spermien gezählt.
VIDAMENT et al. (1998) weisen an Hengstspermien eine signifikante Korrelation zwischen der Motilität und den intakten Spermien der SYBR-14®/PI-Kombinationsfärbung nach.
Eine weitere wichtige Methode zur Beurteilung der Plasmamembranintegrität ist der hypoosmotische Schwelltest (HOST), der von JEYENDRAN et al. (1984) entwickelt wurde.
Dieser Test basiert auf dem osmotischen Prinzip. Der Flüssigkeitsaustausch an einer intakten Zellmembran erfolgt dabei unter hypoosmotischen Bedingungen solange, bis ein Ausgleich zwischen dem Innen- und Außenraum der Zelle erreicht ist (SONG et al., 1991). Es werden Volumenänderungen der Samenzellen in isotoner und hypotoner Lösung gemessen, um eine
Aussage über die osmotische Belastbarkeit zu treffen. Somit entspricht die Anzahl der angeschwollenen Zellen der Anzahl der osmotisch kompetenten Spermien. Optisch zeigen sich typische morphologische Veränderungen, wobei Anschwellen und Aufrollen der Schwanzregion zu beobachten sind. Ein fehlendes Anschwellen oder Aufrollen ist ein Kriterium für eine gestörte Plasmamembranintegrität zu sehen (JEYENDRAN et al. 1984).
Zusätzlich zeigen tote Spermien, deren Plasmamembran noch intakt ist, ein unkontrolliertes Anschwellen, infolgedessen es zur Ruptur der Membranen kommt (MORTIMER 1994).
Eine signifikante Korrelation zwischen dem HOST und der Auftaumotilität vo n Hengstspermien beschreiben WATSON (1995) und PETZOLD et al. (1996). VIDAMENT et al. (1998) vergleichen an Hengstspermien die Ergebnisse des HOST direkt nach der Samenentnahme mit den Motilitäten von Tiefgefriersperma zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Auftauen und können eine hohe Korrelation der Ergebnisse feststellen. Der HOST stellt somit ein wichtiges Kriterium zur Beurteilung der Einfrierbarkeit von Hengstspermien dar.
Der Vorgang der Kapazitation kann beispielsweise durch Fluoreszenzsonden wie Chlortetracyclin (WARD u. STORY 1984; VARNER et al. 1987), fluo3 –AM (HARRISON et al. 1993) und Merocyanin 540 (RATHI et al. 2001) dargestellt werden. RATHI et al. (2001) bevorzugen zur Darstellung der Kapazitation die Färbung mit Merocyanin 540. Nach Meinung der Autoren ist die fluoreszenzmikrosokopische Auswertung der CTC-Färbung aufwendig und ungenau. Die Färbung mit Merocyanin 540 erlaubt eine durchflusszytometrische Auswertung und kann mit Färbungen zur Darstellung des akrosomalen Status oder Vitalitätsfärbungen kombiniert werden (RATHI et al. 2001). Der Kapazitationsprozess lässt sich durch die Inkubation von Spermiensuspensionen mit Heparin nachempfinden (PARRISH et al. 1988).
Zur Erfassung des akrosomalen Status haben sich einige verschiedene Untersuchungs- methoden etabliert. So stellen GRØNDAHL et al. (1994) den Unterschied des Akrosoms von frischem und tiefgefrorenem/wiederaufgetauten Samen mit Hilfe des Elektronenmikroskopes dar.
Monoklonale Antikörper zur Darstellung des akrosomalen Status sind für Hengstspermien von BLACH et. al (1989) und MALMGREN et al. (1997) beschrieben worden. Hierbei wird ein indirekter Immunfluoreszenznachweis genutzt, bei dem sich bestimmte monoklonale
Antikörper an ein Antigen in der akrosomalen Grundsubstanz binden. Ein Bezug zwischen Fertilität und der akrosomalen Schädigung kann von ihnen jedoch nicht beschrieben werden.
Mit Hilfe der Lektine PSA (Pisum sativum Agglutinin) und PNA (Peanut Agglutinin) in konjugierter Form mit FITC (Fluoreszeinisothiocyanat) ist die Beurteilung des akrosomalen Status von frischem und tiefgefrorenem Samen möglich. FARLIN et al. (1992) und CASEY et al. (1993) setzen bei Hengstspermien PSA ein, das sich an a-Mannose- und a-Galaktose- Reste der akrosomalen Matrix defekter Spermien bindet und diese zum Fluoreszieren bringt.
PNA bindet und färbt ß-Galaktose-Reste, die der äußeren akrosomalen Membran angehören (FLESCH et al. 1998). PNA ist das Mittel der Wahl geworden, da es weniger unspezifische Bindungen zu anderen Bereichen in der Zelle zeigt und somit weniger falsch positive Ergebnisse entstehen lässt (DALIMATA u. GRAHAM 1997).
CHENG et al. (1996) zeigen mittels einer Immuno- Elektronen-Mikroskopie, dass sich FITC- PNA an die äußere akrosomale Membran der akrosomalen Kappe und sich nicht an die Plasmamembran bindet. Sie teilen ethanolpermeabilisierte Hengstspermien, die mit FITC- PNA gefärbt wurden, in vier Gruppen ein. In früheren Untersuchungen wurde bisher zwischen akrosomreagiert und nicht akrosomreagiert unterschieden (FARLIN et al. 1992 u.
CASEY et al. 1993). Zu Klasse I werden bei CHENG et al. (1996) die Spermien mit intakter äußerer akrosomaler Membran gezählt (akrosomintakt). Sie zeichnen sich durch eine helle grüne Fluoreszenz der akrosomalen Kappe aus. In Klasse II werden Spermazellen mit unterbrochener Fluoreszenz eingestuft, bei denen die Fusion der Plasmamembran mit der äußeren akrosomalen Membran gerade beginnt (akrosomreagierend). In Klasse III werden Spermien mit Resten einer Fluoreszenz in der Äquatorialebene eingeordnet und zu Klasse IV gehören Samenzellen mit fehlender Fluoreszenz. Die Klassen III und IV werden als akrosomreagiert bewertet.
Die Akrosomreaktion kann durch verschiedene Methoden in vitro ausgelöst werden. So setzen MEYERS et al. (1995) kapazitierte Spermien Progesteron aus und zeigen Unterschiede in der Akrosomreaktion von subfertilen und fertilen Hengsten auf. VARNER et al. (1987 u. 1993) verwenden hierzu Kalziumionophore wie Ionomycin oder A23187. Auf eine gleichermaßen gute Induktion der Reaktion des Akrosoms durch Heparin und A23187 weisen CHRISTENSEN et al. (1996) hin.
Die Mitochondrienaktivität ist durch Rhodamin 123 (Rh 123) (JOHNSON et al. 1980) und mit 5,5`-Tetrachloro-1,1`-3,3`-tetraethylbenzimidazol-carbocyanin- iodid (JC-1) (GARNER et
al. 1997, GRAVANCE et al. 2000) darzustellen, oder anhand des ATP-Gehaltes (FOULKES u. MACDONALD 1979, WOODS et al. 1986) zu ermitteln.
Nachdem die Zellen dem Farbstoff Rh 123 ausgesetzt wurden, lässt sich abhängig von der Anzahl der funktionsfähigen Mitochondrien eine unterschiedliche Intensität der Färbung bewerten. EVENSON et al. (1994) zeigen eine direkte Korrelation der Mitochondrienaktivität und der Motilität zur Lebensfähigkeit der Spermien. Eine hohe Korrelation von der mittels Hoechst 33258® dargestellten Lebensfähigkeit und der mittels Rh 123 dargestellten mitochondrialen Aktivität bei Hengstspermien finden CASEY et al. (1993) heraus.
GARNER et al. (1997) etablierten den Farbstoff JC-1 zur Bestimmung der mitochondrialen Aktivität zunächst an Bullenspermien. Eine Bestimmung der relativen Fluoreszenz von JC-1 gefärbten Proben können GRAVANCE et al. (2000) durchflusszytometrisch an Hengstspermien aufzeigen. Bei dem Farbstoff JC-1 handelt es sich um ein lipophiles, positiv geladenes Cyanid, welches membranpermeabel ist (REERS et al. 1991). JC-1 kann in monomerer Form vorliegen und in diesem Zustand in die Mitochondrienmatrix eingeschle ust werden oder reversibel in die Aggregatform übergehen (COSSARIZZA et al. 1996). Je höher das Membranpotential ist, desto höher ist der Einstrom der JC-1 Monomere in die Mitochondrienmatrix. Die JC-1-Aggregate bilden sich ab einem Schwellenwert von -80 mV bis -100 mV. Nach einer Anregung bei 488 nm kommt es zu einer Grün-Fluoreszenz der Monomere bei einer Wellenlänge von 527 nm und einer Orange-Fluoreszenz der Aggregate bei 590 nm (SMILEY et al. 1991; REERS et al. 1991). Dieser Farbstoff ermöglicht es, Mitochondrien mit hohem Membranpotential von Mitochondrien mit niedrigem Membranpotential zu unterscheiden und Veränderungen im Membranpotential zu erfassen.
Mit Hilfe der Biolumineszenz ist es aufgrund einer Luziferase-Reaktion möglich, den ATP- Gehalt in der Zelle zu messen. Des weiteren wird von Korrelationen zwischen dem ATP- Gehalt und der Motilität berichtet (FOULKES u. MACDONALD 1979, WOODS et al. 1986).
MAGISTRINI et al. (1997) finden Korrelationen zwischen der Plasmamembranintegrität, die durch den hypoosmotischen Schwelltest (HOST) bestimmt wird, und dem ATP-Gehalt heraus. Eine geringere Motilität ist nach MCLAUGHLIN et al. (1994) jedoch nicht durch eine zu geringe ATP-Produktion zu erklären. Sie können in ihren Untersuchungen an frischem und tiefgefrorenem, wieder aufgetauten Samen keine Beziehung zwischen dem ATP-Gehalt und der Motilität nachweisen.
PANTKE et al. (1995) entwickeln einen Spermien-Ovozyten-Bindungstest zur Fertilitäts- einschätzung beim Hengst. Die Fähigkeit des Spermiums, sich an die Zona pellucida zu binden, sowie die Plasmamembranintegrität sind laut MAGISTRINI et al. (1996) für eine Befruchtung essentiell.
Bei der Durchführung eines Spermien-Ovozyten-Bindungstests werden Oozyten sowohl mit einer bestimmten Anzahl von Spermien von Hengsten einer Kontrollgruppe als auch mit Spermien von Hengsten einer Testgruppe inkubiert. Die Spermien der Kontrollgruppe werden mit FITC und die der Testgruppe mit TRITC (Tetramethyl- Rhodamin- isothiocyanat) gefärbt.
Anschließend wird das Verhältnis der Testgruppe zur Kontrollgruppe hinsichtlich der Spermienbindung an die Zona pellucida bewertet. Die Spermien subfertiler Hengste weisen eine geringere Bindungsfähigkeit auf. Die Korrelation der Bindungsfähigkeit zur Fertilität ist hoch. Mit diesem Test kann somit eine gute Aussage über die Befruchtungsfähigkeit getroffen werden. Es ist jedoch ein relativ teures Equipment für diese Auswertung notwendig (PANKTE et al. 1995).
FAZELI et al. (1995) untersuchen die Unterschiede der Spermienbindung an die Eizelle anhand des Hemizonabindungstests (Hemi Zona Assay; HZA). Dabei werden Oozyten halbiert, Spermien einer Testgruppe sowie Spermien einer Standardlösung mit Hoechst 33258® markiert und anschließend das Bindungsvermögen der Spermien an die Hemizonae verglichen. Die Autoren berichten über eine hohe und signifikante Korrelation zwischen der Anzahl Spermien, die sich an die Zona pellucida gebunden haben und der Fertilität. Dieser Hemizonabindungstest wird von MALMGREN (1997) als wichtiges und aussagekräftiges Untersuchungsmittel angesehen, vorausgesetzt, dass ein bisher unbekannter Hengst im Test mit einem Hengst bekannter Fruchtbarkeit verglichen wird.
Das Seminalplasma besteht aus den Sekreten der akzessorischen Geschlechtsdrüsen und mischt sich während der Ejakulation mit den Spermatozoen (TÖPFER-PETERSEN et al.
1998 und Referenzen darin). Es ist zum einen für den Transport, Schutz und die Ernährung des Samens zuständig und zum anderen moduliert es die Funktionen der Spermien auf verschiedenen Ebenen der Befruc htungskaskade. Weitere Untersuchungen haben gezeigt, dass die Zugabe von Seminalplasma fertiler Bullen zu epididymalen Spermien subfertiler Bullen die Trächtigkeitsrate erhöht (HENAULT et al. 1995). Das Seminalplasma enthält verschiedene Ionen, Aminosäuren, Monosaccharide, Lipide, Polyamine, Prostaglandine, Steroidhormone und Proteine (MANN u. LUTWAK-MANN 1981). Mit Hilfe der
Magnetresonanzspektroskopie wurden von MAGISTRINI et al. (1995a) und SEGUIN et al.
(1995) bestimmte Bestandteile aus den akzessorischen Geschlechtsdrüsen im Seminalplasma genauer identifiziert und quantifiziert. Mit Hilfe dieser Technik ist es möglich, die Zusammensetzung von Seminalplasma und damit auch das Fehlen verschiedener Plasmabestandteile aufzuzeigen (MAGISTRINI et al. 1995b). Drei bestimmte Familien der Seminalplasmaproteine sind tierartspezifisch an der Regulation von Spermienfunktionen beteiligt. Dieses sind heparinbindene Proteine vom Fibronektin- Typ II (FnII-Typ), Spermadhäsine und CRISP-Proteine (cysteinreiche Sekretproteine).
Beim Rind werden die heparinbindenden Proteine als „bovine seminal proteins“ (BSPA 1-3 und BSP-30) von CALVETE et al. (1995b,c) beschrieben. Beide Proteine werden in der Samenblasendrüse gebildet, lagern sich nach der Ejakulation durch eine spezifische Bindung an die Samenzellmembran und ermöglichen die Bindung von Heparin während des Kapazitationsprozesses. Als „horse seminal protein“ eins und zwei (HSP-1, HSP-2) werden die heparinbindenden Proteine des Hengstes von CALVETE et al. (1995b,c) beschrieben. Sie werden hauptsächlich in der Samenleiterampulle gebildet. Die Bildung des HSP-1 findet zusätzlich schon im Nebenhodenkopf statt. Die Spermadhäsine sind besonders gut beim Schwein untersucht. Sie binden sich an die Kohlenhydratseitenketten der Zona pellucida und können als Lektine bezeichnet werden. Zudem besitzen sie ähnliche Eigenschaften wie FnII- Typ-Proteine, indem sie Heparin und Phosopholipide binden (CALVETE et al. 1995a;
TÖPFER-PETERSEN et al. 1997). Sie werden beim Schwein in der Samenblasend rüse gebildet und schützen das Akrosom während der Ejakulation durch im Seminalplasma gebildete hochmolekulare Aggregate. Beim Pferd können von REINERT et al. (1996) ähnliche Spermadhäsine nachgewiesen werden. Nach REINERT et al. (1997) binden sich die equinen Spermadhäsine schon im Hoden an das Äquatorialsegment und können mit der Zona pellucida interagieren. Die CRISP-Proteine (Cystein- Rich-Secretory-Proteins) werden in der Samenleiterampulle und im Nebenhoden synthetisiert (SCHAMBONY et al. 1998) und binden an die postakrosomale Region und das Mittelstück.
In Tabelle 1 ist ein Überblick der oben aufgeführten Quellenangaben zur spermatologischen Untersuchung equiner Spermatozoen dargestellt.
Tab.1: Darstellung verschiedener Parameter zur spermatologischen Untersuchung equiner Spermatozoen
Konventionelle Parameter
Parameter Methode Quelle(n) Quelle(n) Hengst
Motilität
Schätzung CASA Halteproben
JASKO et al. (1988) BLACH et al. (1989) VIDAMENT et al. (1999) Morpho-
logie
Nativ Morpho- metrie
HANCOCK 1957 DOTT (1975)
PARLEVLIET (1999) LOVE et al. (2000) CASEY et al. (1997) Funktionelle Untersuchung der Samenzellkompartimente Parameter Methode Quelle(n) Quelle(n) Hengst Zellkern SCSA EVENSON et al. (1980) KENNEY et al. (1995)
LOVE et al. (2000)
Plasma- membran- integrität
EN CFDA/PI SYBR- 14®/PI HOST
HARRISON u. VICKERS (1990) GARNER et al. (1994)
JEYENDRAN et al. (1984)
DOTT u. FOSTER (1972) VIDAMENT et al. (1998) DE ALBUQUERQUE LAGARES (1995) WATSON (1995) ; PETZOLD et al. (1996) ; VIDAMENT et al. (1998) Kapazita-
tion
CTC fluo 3-AM Merocyanin
WARD u. STORY (1984)
HARRISON et al. (1996)
VARNER et al. (1987) HARRISON et al. (1993) MAGISTRINI et al. (1997) RATHI et al. (2001)
Akrosom
SEM MAT
FITC/PSA
FITC-PNA DALIMATA u. GRAHAM (1997)
GRØNDAHL et al. (1994) BLACH et al. (1989) MALMGREN et al. (1997) FARLIN et al. (1992) CASEY et al. (1993) CHENG et al. (1996)
Fortsetzung Tab.1:
Induktion der Akrosom- reaktion
Progesteron Heparin Kalzium- ionophore
PARRISH et al. (1988)
MEYERS et al. (1995) VARNER et al. (1993) CHRISTENSEN et al. (1996) VARNER et al. (1987) Mitochon-
drienaktivi- tät
ATP RH 123 JC-1
FOULKES u. MACDONALD (1979)
JOHNSON et al. (1980) GARNER et al. (1997)
CASEY et al. (1993) MAGISTRINI et al. (1997) GRAVANCE et al. (2000) Zona
pellucida- Bindung
HZA Oozyten- Bindungstest
FAZELI et al. (1995) PANTKE et al. (1995)
Seminal- plasma- proteine
ELISA SCHAMBONY et al. (1997)
REINEKE et al. (1999)
SZ/ml = Samenzellen in einem Milliliter; GSZ = Gesamtspermienzahl; CASA = Computer Assisted Sperm Analysis; SCSA = sperm chromatin structure assay; EN = Eosin- Nigrosin; CFDA/PI = 6- Carbofluoreszindiazetat /Propidiumiodid; SYBR-14®/PI = Lebend/Tot-Färbung ; HOST = hypoosmotischer Schwelltest; CTC = Chlortetracyclin; fluo 3-AM = Fluoreszenzsonde (Ca2+-Indikator) ; REM = Rasterelektronenmikroskopie; MAT = monoklonale Antikörpertechnik; ATP = Adenosintriphosphat; FITC = Fluoreszein; PSA = Pisum sativum agglutinin; PNA = Peanut agglutinin; JC-1 = 5,5`-Tetrach loro-1,1`-3,3`- tetraethylbenzimidazol-carbocyanin-iodid; Rh123 = Rhodamin 123; HZA = hemizona binding assay
2.6. Bezug einzelner Parameter der Spermienbeurteilung zur Fertilität
CLEMENT et al. (1991) berichten, dass die Fertilität eines Hengstes vom Alter abhängig ist und nach dem 15. Lebensjahr abnimmt. MERKT et al. (1979) berichten in ihrer Auswertung von Deckregistern (1815-1973) von einer Abnahme der Fertilität ab einem Alter von 12 Jahren. Es zeigen sich jedoch große individuelle Unterschiede.
Bei der Beurteilung der Motilität hinsichtlich einer Fertilitätsaussage sind die Untersuchungsergebnisse voneinander abweichend. So finden VOSS et al. (1981) in ihren Untersuchungen an drei Hengsten keinen Bezug der Motilität und der Morphologie zur Fertilität. Andere Studien ergeben eine sehr geringe Korrelation dieser Parameter hinsichtlich der Fruchtbarkeit. In den Untersuchungen von DOWSETT u. PATTIE (1982) an 47 Hengsten korreliert die Gesamtspermienzahl an lebenden Spermien positiv mit der Trächtigkeitsrate.
Bei JASKO et al. (1992) ergaben die Untersuchungen an 64 Hengsten jeweils eine signifikant
positive Korrelation von motilen Spermien (r = 0,4), von progressiv motilen Spermien (r = 0,46) und motilen Spermien der computergestützten Auswertung (r = 0,34) zur Fertilität.
SAMPER et al. (1991) zeigen wiederum eine signifikante positive Korrelation zwischen der Vorwärtsmotilität in Frischs amen und der Fruchtbarkeit an Ejakulaten von 4 Hengsten (r = 0,8), können in ihrer Studie mit Tiefgefriersperma (9 Hengste) jedoch keine signifikante Korrelation zwischen Fertilität und Motilität nachweisen. Die höchste Korrelation mit der Fertilität zeigt der Prozentsatz verdünnter vorwärtsmotiler Spermien nach 24 und 48 Stunden bei einer Lagerung von 4°C (CLEMENT et al. 1995).
PALMER und MAGISTRINI (1992) können keine Korrelation der Fertilität zur Linearität, zum Prozentsatz schneller Spermatozoon und zur Motilität nachweisen (60 Hengste) . Diese Parameter werden mit Hilfe von CASA (Computer Assisted Sperm Analysis) ausgewertet.
Betrachtet man die morphologischen Veränderungen, ist eine hohe Anzahl veränderter Samenzellen mit einer geringeren Fertilität verbunden. Nach BIELANSKI et al. (1975) korrelieren Spermien mit primären Anomalien negativ (r = -0,5) mit der Fertilität. Bei JASKO et al. (1990) zeigen morphologisch anomale Spermien von Ejakulaten von 66 Hengsten eine Korrelation von r = -0,36 zur Fertilität. LOVE et al. (2000) können in ihren Untersuchungen eine Beziehung von normal ausgebildeten Spermien zur Trächtigkeitsrate, sowie signifikante negative Korrelationen zwischen Spermienanomalien und der Trächtigkeitsrate feststellen (17 Hengste).
Der SCSA scheint ein guter Test zur Spermienbeurteilung hinsichlich der Fertilität zu sein.
KENNEY et al. (1995) etablieren den SCSA bei Hengstspermien und finden eine negative Korrelation der Trächtigkeitsrate pro Saison zu dem SCSA-Parameter COMPat (Prozentsatz an Spermien außerhalb der Hauptpopulation des at -Wertes, der das Verhältnis von Spermien mit einsträngiger DNA zur Gesamtpopulation angibt), zu morphologisch normalen Spermien und zur Motilität heraus. KENNEY et al. (1995) können in ihren Untersuchungen an 106 Hengsten einen höheren COMPat-Wert bei Spermien subfertiler Hengste, als bei Spermien fertiler Hengste feststellen. BALLACHEY et al. (1988) finden bei Bullen eine direkte Beziehung von der Chromatinstruktur zur Fertilität heraus (n = 9; r = -0,94). LOVE et al.
(2002) vergleichen mittels SCSA Samen fertiler und subfertiler Hengste (18 Tiere) hinsichtlich ihres denaturierten Anteils bei unterschiedlichen Lagerungen und Temperaturen und können höhere Werte bei Spermien subfertiler Hengste feststellen, wenn sie vor der Färbung 20 h bzw. 31 h bei 5°C gelagert wurden.
Einige Hengste sind infertil, obwohl die konventionellen Methoden der Spermienbeurteilung eine gute Fruchtbarkeitsprognose liefern. Hier bieten sich andere Methoden an, wie die Beurteilung des Akrosoms bzw. die Messung der Fähigkeit zur Akrosomreaktion, um eine bessere Aussage über die mögliche Befruchtungsfähigkeit zu erlangen.
VARNER et al. (2000) ermitteln den akrosomalen Status von Spermien von vier Hengsten mit ungeklärter Infertilität und fertiler Hengste mittels TEM (Transmissionselektronen- mikroskopie) und induzieren die Akrosomreaktion mit dem Kalziumionophor A23187. Die Spermien fertiler Hengste sind in ihren Untersuchungen zu 80 % in der Lage eine Akrosomreaktion durchzuführen, während die Spermien der Hengste unerklärter Unfruchtbarkeit nur zu 20 % eine Akrosomreaktion zeigen.
MEYERS et al. (1995) färben das Akrosom mittels FITC/PNA und induzieren die Akrosomreaktion durch Progesteron. Sie können ein besseres Ansprechen der Spermatozoen fertiler Hengste als subfertiler Hengste auf Progesteron darlegen (n = 10). Eine Korrelation von akrosomal defekten Spermien, die mit Hilfe der monoklonalen Antikörpertechnik ausgewertet wurden, zur Fertilität wird bisher noch nicht beschrieben (MAGISTRINI 2000).
Nach DE ALBUQUERQUE LAGARES (1995) sind die Ergebnisse des hypoosmotischen Schwelltests (HOST) positiv mit der Fertilität korreliert (Spermien der Verdünnungsstufen 100 und 200 mOsmol/kg; r = 0,66 bzw. 0,73; 9 Hengste). Hingegen bestätigen MAGISTRINI et al. (1997) die Ergebnisse von WATSON (1995) und PETZOLD et al. (1996), indem sie eine signifikante Korrelation zwischen den Ergebnissen des HOST und der Auftaumotilität von Hengstspermien feststellen können. Eine direkte Aussage über die Fertilität kann von ihnen jedoch nicht getroffen werden.
WOOD et al. (1986) weisen nach, dass der ATP-Gehalt im Spermium und die Motilität mit der Fertilität korrelieren. Sie untersuchten Ejakulate (n = 66) von 12 Bullen und konnten eine signifikant positive Korrelation von r = 0,42 herausfinden.
Negative Korrelationen können zwischen toten Spermien (PI-Färbung) und der Mitochondrie naktivität (Rh 123-Färbung) von KRAMER et al. (1993) aufgezeigt werden.
ERICSSON et al. (1993) berichten von einer positiven Korrelation morphologisch normaler Spermien zu Spermien mit funktionellen Mitochondrien, die mit Rh 123 dargestellt wurden.
Eine positive Korrelation der Fertilität zur mitochondrialen Funktion kann von ihnen nicht nachgewiesen werden. DIGRASSIE (2000) kann anhand eines Regressionsmodells eine hohe
Korrelation von Rhodamin 123 in Kombination mit dem SCSA zur Fertilität herausstellen (r= 0,78).
Für die neuere Färbung JC-1 können HOSHI et al. (2002) eine positive Korrelation eines hohen Membranpotentials zur Motilität herausfinden und somit eine bessere Aussage über das Befruchtungspotential menschlicher Spermien nachweisen.
Bei einem direkten Vergleich subfertiler Hengste mit Spermien fertiler Hengste (n = 12) mittels Oozyten-Bindungstest stellen PANTKE et al. (1995) fest, dass bei den subfertilen Hengsten ein niedrigeres Verhältnis (0,22) von gebundenen Testspermien zu gebundenen Kontrollspermien besteht, als bei fertilen Hengsten (0,77). FAZELI et al. (1995) berichten von einer positiven Korrelation von im Rahmen eines Hemizonabindungstests (HZA) an die Zona pellucida gebundenen Spermien und der Fertilität (n = 20). Der HZA wird von MALMGREN (1997) als wichtiges und aussagekräftiges Untersuchungsmittel angesehen.
SCHAMBONY et al. (1997) können eine direkte Korrelation zwischen an das Spermium gebundenen CRISP-Proteinen nach Kochsalzwaschung oder Akrosomreaktion und der Befruchtungs- bzw. Abfohlrate nachweisen. Nach REINEKE et al. (1999) korrelieren die Anteile der an die Spermienmembran gebundenen CRISP-Proteine mit der Fertilität von Hengsten.
3 Eigene Untersuchungen
3.1. Material und Methoden
Die Untersuchungen bestanden aus drei Versuc hsabschnitten und wurden im Rahmen der routinemäßigen Tiefgefriersamengewinnung und während der Besamungssaison im Niedersächsischen Landgestüt in Celle durchgeführt. Die Ejakulatgewinnung erfolgte für den Versuch I (Reproduzierbarkeit der Methode) im Mai 2001. Der Versuch II (Einfluss von Behandlungsverfahren) wurde während der Besamungssaison im März 2002 durchgeführt.
Für den Versuch III (Hauptversuch) wurden die Proben im Winter 2000 (November), Frühjahr 2001 (März) und Sommer 2001 (Juli) gewonnen. Der Probengewinnung im Winter gingen drei tägliche Samenentnahmen voraus, deren Ejakulate verworfen wurden. Erst ab der vierten Samenentnahme wurden die gewonnenen Ejakulate für die Versuchsdurchführung aufbereitet. Vor der Probennahme im März waren die Hengste auf einen Samenentnahmerhythmus von 48 h konditioniert. Mit Bezug der Besamungs- bzw.
Deckstationen erfolgte eine Umstellung auf einen täglichen Samenentnahmerhythmus. Im Juli hatten die Hengste wieder ihre Boxen im Gestüt bezogen und waren auf einen täglichen Samenentnahmerhythmus eingestellt.
Die benötigten Stammlösungen und Pufferlösungen für die verschiedenen Färbungen sowie die Geräte und Einstellungen der computermikrographischen Auswertungen sind im Anhang dargestellt.
3.1.1. Versuchstiere
Für die Versuche standen insgesamt 64 Warmbluthengste und 5 Vollbluthengste des Niedersächsischen Landgestütes Celle im Alter zwischen 5 und 24 Jahren (X = 11,29, ± SD
= 5,08) zur Verfügung.
Der Versuch I wurde mit Ejakulaten von 4 Hengsten unterschiedlichen Alters (7-18 Jahre;
X =12, ± SD =5,05) durchgeführt. Der Versuch II erfolgte mit Ejakulaten von insgesamt 10 Hengsten, die 5- bis 15-jährig (X = 8,5, ± SD = 3,75) waren. Für den Versuch III wurden Ejakulate von allen 69 Hengsten gewonnen. Die Tiere wurden in Einzelboxen mit
Stroheinstreu aufgestallt und erhielten eine Fütterung, die aus Heu, Hafer und pelletiertem Mischfutter bestand. Aus Selbsttränken stand jederzeit Wasser zur Verfügung.
3.1.2. Samengewinnung
Die Samengewinnung erfolgte an einem Phantom (Modell „Celle“, KLUG 1990) mit einer künstlichen Scheide (Modell Hannover) in Anwesenheit einer rossigen Stute. Als Auffanggefäß diente eine skalierte Glasflasche. Die Trennung von Schleim und Schmutzpartikeln wurde durch einen Filter (Fa. Minitüb, Landshut) erreicht.
3.1.3. Samenuntersuchung
Der Samen wurde unmittelbar nach der Entnahme verarbeitet. Zunächst wurde ein Ausstrich des nativen Samens angefertigt, der nach Lufttrocknung in einer Lösung (Verhältnis 9:1 aus 0,9 %igem NaCl u. 37 %igem Formaldehyd) fixiert wurde.
Es wurden des weiteren das Volumen und die Dichte bestimmt, sowie die Farbe (grau, weiß, gelb) und die Konsistenz (wässrig, molkig, milchig, rahmig). Zur Bestimmung der Dichte diente ein Pho tometer („Spermacue®“, Fa. Minitüb, Landshut), welches die Anzahl an Samenzellen pro ml angibt. Aus dem Produkt von Volumen und Dichte wurde die Gesamtspermienzahl errechnet. Zur Beurteilung der Motilität des Nativsamens wurden ein Phasenkontrastmikroskop (Fa. Zeiss, Okular 10fach, Objektiv 20fach) mit einem auf 37°C beheizten Mikroskoptisch sowie auf 37°C vorgewärmte Objektträger und Deckgläschen verwendet. Eine Schätzung der Motilität erfolgte nach Vorwärtsbeweglichkeit, Ortsbeweglichkeit und Unbeweglichkeit. Anschließend wurde der Samen mit modifiziertem Magermilchverdünner (INRA 82, IJAZ und DUCHARME 1995) auf eine Dichte von 25 Millionen Samenzellen/ Milliliter (mio SZ/ml) verdünnt und bis zur weiteren Verarbeitung und Analyse bei Raumtemperatur gelagert. Im März wurden die Samenproben nach Verdünnung in einer Hengstfrischspermaversandbox (Fa. NET, Leverkusen), die ein Kühlakku enthielten, von den Besamungsstationen zum Zentrallabor nach Celle transportiert.
Anschließend wurden sie bei Raumtemperatur bis zur Analyse gelagert.
Die folgende Behandlung des Spermas ist den einzelnen Versuchsbeschreibungen sowie den entsprechenden Färbeprotokollen zu entnehmen.
3.1.4. Versuchskonzeption
Im ersten Versuch sollten anhand einer identischen Probenwiederholung die Reproduzierbarkeit der Methode und der Messfehler der Methode überprüft werden. Es wurden die Ejakulate von vier Hengsten an drei aufeinanderfolgenden Tagen gewonnen. Die Untersuchung erfolgte zum einen an frischverdünntem Samen und zum anderen an tiefgefrorenem/wiederaufgetauten Samen, wobei von einer Probe jeweils zwei Ansätze angefertigt und ausgewertet wurden. Zudem wurden jeweils zwei Nativausstriche je Ejakulat eines Hengstes angefertigt und untersucht. Das Tiefgefriersperma wurde nach Auftauen für 30 Sekunden in einem 37°C warmen Wasserbad analysiert. Es wurden folgende Färbungen durchgeführt: SYBR-14®/PI-Färbung als Lebend/Tot-Färbung, FITC-PNA/PI-Färbung zur Bestimmung des akrosomalen Status vor und nach Induktion der Akrosomreaktion mittels Heparin und JC-1-Färbung zur Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials. Die Auswertung der SYBR-14®/PI-Färbung erfolgte mittels eines Fluoreszenzmikroskops (Axioskop der Fa. Zeiss, Deutschland) in Kombination mit dem Bildanalysesystem analySIS®3.0 (Fa. Soft Imaging System GmbH; Deutschland, Münster). Die Analyse der akrosomalen Färbung und der Mitochondrienfärbung wurde subjektiv mit dem Fluoreszenzmikroskop durchgeführt. Die Motilitätsbestimmung erfolgte mit dem MIKA Motion Analyser, Windows Version 1.1. (Stroemberg Mika Medical, Montreux, Belgien). Für die Auswertung der Morphologie stand ein Phasenkontrastmikroskop (Fa. Zeiss, 100er Objektiv; Ölimmersion) zur Verfügung. Anschließend wurden die Ergebnisse miteinander verglichen.
Der zweite Versuch wurde zur Untersuchung des Einflusses von Zentrifugation, Tiefgefrierung und Lagerung auf die Spermienqualität durchgeführt. Es wurden an einem Tag die Ejakulate von 10 Hengsten gewonnen und aufbereitet. Die Auswertung der Proben erfolgte für den frisch verdünnten Samen und das resuspendierte Zentrifugat sofort und nach Lagerung der Proben bei 5°C an den zwei darauffolgenden Tagen, sowie an tiefgefrorenem/
wiederaufgetauten (bei 37°C für 30 sec) Samen. Es wurden die Färbesubstanzen und Geräte entsprechend dem Versuch I genutzt und die Untersuchungsergebnisse miteinander verglichen.
Im Hauptversuch wurde Frischsamen und wiederaufgetauter Tiefgefriersamen (bei 37°C für 30 sec) von 69 Hengsten im Alter von 5-24 Jahren zu drei verschiedenen Zeitpunkten (vor,
während und nach der Decksaison) untersucht. Der Frischsamen (CFDA/PI-Färbung, FITC/PNA-PI-Färbung) und der Tiefgefriersamen (SYBR-14®/PI-Färbung, FITC/PNA-PI- Färbung, JC-1-Färbung) wurde mittels Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Für die SYBR- 14®-Färbung wurde die Auswertung in Kombination mit dem Bildanalysesystem analySIS®3.0 vorgenommen. Zusätzlich erfolgte eine Auswertung des Tiefgefrierspermas mittels Durchflusszytometer (FACScan®, Becton-Dickinson, Heidelberg) in der Gynäkologischen und Ambulatorischen Tierklinik der Ludwig-Maximilian-Universität in München. Eine Motilitätsbestimmung erfolgte mit dem MIKA Motion Analyser, Windows Version 1.1. (Stroemberg Mika, Montreux, Belgien). Zudem wurde ein Hypoosmotischer Schwelltest des Nativsamens mit dem „Cell Analyser System Casy 1“ Modell TTC (Schärfe System GmbH, Reutlingen) durchgeführt. Es wurden die saisonalen Unterschiede und die Korrelationen der Parameter untereinander ermittelt. Ein Vergleich erfolgte zwischen Frischsamenergebnissen und Tiefgefriersamenergebnissen. Letztendlich wurden die Korrelationen der Untersuchungsparameter zu den Fertilitätsparametern ermittelt.
Für die Parameter der FITC-Färbung und der JC-1-Färbung erfolgte die Auswertung subjektiv nach einer Klasseneinteilung, da die Software von ana lySIS®3.0 nicht über eine Möglichkeit verfügte, bestimmte Regionen des Spermiums als eine Einheit zu erfassen und in dieser Einheit Differenzierungen vorzunehmen.
I. Versuchsplan zur Prüfung der Reproduzierbarkeit der Untersuchungsmethoden
1.Nativsamen
a. Motilitätsschätzung b. Dichtebestimmung
c. Nativausstrich , morphologische Auswertung
2. Verdünnung auf 25 Mio SZ/ml
3. Aufteilung des verdünnten Samens in zwei Fraktionen
a. Färben (SYBR-14®-PI, FITC/PNA-PI, JC-1) und Auswerten
b. Zentrifugation bei 700 x g; Dekantierung des Überstandes, Resuspension des Retentats mit Tiefgefrierverdünner (INRA 82 + 2,0% Eidotter + 2,5% Glycerol) ? Abfüllung in Pailletten (0,5 ml) ? Kühlung auf 5°C ? Tiefgefrierung ? Auftauen (30 sec im Wasserbad bei 37°C) ? Färben und Auswerten
Die genaue Einfrierprozedur wird im Folgenden beschrieben und wurde auch für Versuch II und III angewandt:
Nach der Resuspension des Retentats mit ca. 3 ml Tiefgefrierverdünner (INRA 82 + 2,0%
Eidotter + 2,5% Glycerol) erfolgt eine Dichtebestimmung mittels Hämozytometerverfahren (Thoma neu®, Hecht, Sontheim). Unter weiterer Verwendung von Tiefgefrierverdünner wird der Samen auf 200 Millionen SZ/ml verdünnt. Eine Abfüllung in 0,5 ml Pailletten (Fa.
Minitüb, Landshut) erfolgt automatisiert mit Hilfe einer Abfüllmaschine (MRS-1®, Fa. IMV, L`Aigle, Frankreich). Anschließend werden die Pailletten zwei Stunden im Kühlschrank gelagert und bei einer Temperatur von 5°C gekühlt. Die Tiefgefrierung von 4°C auf –160°C erfolgt im Gefrierautomaten (Minidigitcool ®, Fa. IMV, L`Aigle, Frankreich) mit einer Einfriergeschwindigkeit von 60°C/min. Nach Erreichen von -160°C wird das TG-Sperma in flüssigen Stickstoff überführt und in entsprechenden Containern gelagert.
II. Versuchsplan zur Prüfung des Einflusses von Aufbereitungsverfahren auf flüssig- und tiefgefrierkonservierten Pferdesamen
1.Nativsamen
a. Motilitätsschätzung b. Dic htebestimmung
c. Nativausstrich , morphologische Auswertung 2. Verdünnung auf 25 Mio SZ/ml
3. Aufteilung des verdünnten Samens in zwei Fraktionen a. Motilitätsanalyse, Färben und Auswerten
- sofort (0h), nach 24 h und nach 48 h
- Zentrifugation bei 700 x g; Dekantierung und anschließende Färbung und Auswertung des Überstandes
4. Aufteilung des zentrifugierten Samens in zwei Fraktionen
a. Resuspension des Retentats mit modifiziertem Magermilchverdünner; Verdünnung auf 50 Mio SZ/ml ? Motilitätsanalyse, Färben und Auswerten
- sofort (0h), nach 24 h und nach 48 h
b. Resuspension des Retentats mit Tiefgefrierverdünner (INRA 82 + 2,0% Eidotter + 2,5% Glycerol) ? Abfüllung ? Lagerung 0h und 3h bis Einfrierprozedur bei Raumtemperatur ? Kühlung auf 5°C ? Tiefgefrierung ? Auftauen (30 sec im Wasserbad bei 37°C) ? Färben und Auswerten
Es wurden die SYBR-14®/PI-Färbung, die FITC/PNA-PI-Färbung sowie die JC-1- Färbung durchgeführt.
III. Versuchsplan der Analyse des Hauptversuches
1.Nativsamen
a. Motilitätsschätzung b. Dichtebestimmung
c. Hypoosmotischer Schwelltest
d. Nativausstrich , morphologische Auswertung
2. Verdünnung auf 25 Mio SZ/ml ? Aufteilen in zwei Fraktionen 3. Frischsamen
a. Fluoreszenzmikroskopische Auswertung
- CFDA/PI-Färbung (Bestimmung der Plasmamembranintegrität) - FITC-PNA/PI- Färbung (Bestimmung des akrosomalen Status)
4. Tiefgefriersamen a. Motilitätsanalyse
b. fluoreszenzmikroskopische Auswertung in Kombination mit Bildanalysesystem SIS - SYBR-14®/PI-Färbung
c. subjektive Auswertung mittels Fluoreszenzmikroskop - FITC-PNA/PI- Färbung
- JC-1
d. durchflusszytometrische Auswertung - SYBR-14®/PI-Färbung - FITC-PNA/PI- Färbung - JC-1
3.1.5. Untersuchungsparameter
3.1.5.1. Computermikrographische Motilitätsanalyse
Die Beurteilung der Spermienmotilität erfolgte durch den MIKA Motion Analyser, Windows Version 1.1. (Stroemberg Mika, Montreux, Belgien). Für die Motilitätsanalyse wurde das aufbereitete Sperma auf 25 x 106 Samenzellen/pro Milliliter mit auf 37°C vorgewärmten modifiziertem INRA 82 verdünnt. Die zwei Kammern einer zuvor auf 37 °C erwärmten Mika-Zählkammer (Fa. Minitüb, Tiefenbach) wurden mit insgesamt 5 µl der Spermiensuspension befüllt. Es erfolgte eine Übertragung von 10 Gesichtsfeldern (fünf pro Kammer) mittels Videokamera auf den Monitor. Anschließend wurden von den 10 Messungen die Mittelwerte errechnet und als Gesamtergebnisse ausgegeben. Es wurden die Anteile an vorwärts-, orts- und unbeweglichen Spermien ermittelt.
3.1.5.2. Morphologische Auswertung
Für die morphologische Auswertung wurde zunächst ein Tropfen Nativsamen auf einen Objektträger gegeben, ausgestrichen und luftgetrocknet. Der Ausstrich wurde anschließend fixiert und es wurde eine nach BOERSMA et al. 1996 modifizierte Farelly-Färbung durchgeführt.
Färbeprotokoll der morphologischen Auswertung
1. luftgetrockneten Ausstrich 10 sec fixieren in Formaldehydlösung (0,9 %iges NaCl u. 37 %iges Formaldehyd im Verhältnis 9:1) 2. 5 min. in 5%iger Anilin- Blau-Lösung färben
3. gründliches Spülen mit Aqua bidest. bis überschüssige Farbe entfernt ist 4. 1 min. in 0,5 %iger Kristall- Violett- Lösung färben
5. gründliches Spülen mit Aqua bidest. bis überschüssige Farbe entfernt ist 6. Lufttrocknen
Die gefärbten Ausstriche wurden mit Hilfe eines Phasenkontrastmikroskops (1000fache Vergrößerung und Ölimmersion, Phase 3) ausgewertet. 200 Zellen wurden jeweils ausgezählt und die morphologischen Veränderungen wurden nach folgendem Schema der Tabelle 2 (WEITZE 2000b, Übersichtsartikel) prozentual ausgewertet:
Tab.2: Auswertungsschema zur Erfassung der morphologischen Veränderungen
Veränderungen genauere Differenzierung
I. Kopfkappenveränderungen abgelöst, in Ablösung, deformiert, schief, zu klein, rauh, persistierendes Akrosom
II. Kopfveränderungen Kolbenform, Lanzenform, Spatenform, rund, verjüngt, schmal, eingeschnürt, Zwergkopf, Riesenkopf, deformiert
III. Halsveränderungen Halsbruch, paraxialer Schwanzansatz, retroaxialer
Schwanzansatz, persistierender Plasmatropfen IV. Verbindungsstückveränderungen gebrochen, doppelt, fibrillär, axial, deformiert,
persistierender Plasmatropfen
V. Haupt- und Endstückveränderungen persistierender Plasmatropfen, Schleifenform, aufgerollt, um den Kopf gerollt, abgeknickt, rudimentär
VI.Doppel-und Mehrfachmissbildungen Mehrfachmissbildungen (Kopf/ Schwanz)
VII. gesamt
