Tierärztliche Hochschule Hannover
Interaktion zwischen verschiedenen Vitamin-D-Metaboliten und Mechanismen zur Metabolisierung und Elimination von
Xenobiotika bei der Ratte
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Karoline Klumpp
Steinfurt
Hannover 2018
Wissenschaftliche Betreuung: PD Dr. med. vet. Mirja Rosmarie Wilkens Physiologisches Institut
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: PD Dr. med. vet. Mirja Rosmarie Wilkens Physiologisches Institut
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover 2. Gutachter: Prof. Dr. Manfred Kietzmann
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Tag der mündlichen Prüfung: 02.11.2018
Mit freundlicher Unterstützung der H. Wilhelm Schaumann Stiftung
Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits auf Tagungen vorgestellt:
K. Klumpp, N. Schnepel, M. R. Wilkens (2017)
Influence of vitamin D3 and 25-hydroxycholecalciferol (25-OHD3) on RNA-Expression of P-glycoprotein (P-gp) in the rat
Poster: 71. Tagung der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie 14. – 16.03.2017, Göttingen
K. Klumpp, M. Burmester, K. Hansen, N. Schnepel, M. R. Wilkens (2017)
Influence of vitamin D3 and 25-hydroxycholecalciferol (25-OHD3) on metabolism and elimination of xenobiotics in the small intestine of rats
Poster: 6. Symposium der Jungen Physiologen 28. – 29.09.2017, Jena
K. Klumpp, F. Lange, N. Schnepel, K. Hansen, A. L. Lifschitz, L. M. Mate, M. R. Wilkens (2018)
The effect of 1,25-dihydroxyvitamin D (1,25-(OH)2D), 25-hydroxyvitamin D (25-OHD) and vitamin D (vit-D) on mechanisms of metabolism and elimination of xenobiotics in rats
Poster: 21. Vitamin D Workshop 16. – 19.05.2018, Barcelona
Abkürzungsverzeichnis ... VI Abbildungsverzeichnis ... X Tabellenverzeichnis ... XII
1 Einleitung ... 1
2 Literaturübersicht ... 3
2.1 Vitamin D ... 3
2.1.1 Aufnahme, Synthese und Metabolismus ... 3
2.1.2 Einsatz von Vitamin D ... 10
2.1.2.1Empfehlung für den Menschen ... 10
2.1.2.2Vitamin D als Futtermittelzusatzstoff ... 10
2.1.2.3Vitamin D in der Tiermedizin ... 11
2.2 Metabolisierung und Elimination von Xenobiotika ... 12
2.2.1 Cytochrom P450 3A ... 13
2.2.2 Permeabilitäts-Glykoprotein ... 15
2.2.2.1Experimentelle Beeinflussung von P-gp... 17
2.2.3 Organic-Anion-Transporter 3 ... 17
2.2.4 Pregnan-X-Rezeptor ... 18
2.3 Einfluss von Vitamin D auf die Metabolisierung und Elimination von Xenobiotika ... 19
2.3.1 Untersuchungen an Menschen ... 19
2.3.2 Tierexperimentelle Studien ... 20
2.3.3 Untersuchungen an Zellkultur-Systemen ... 23
2.4 Zielsetzung ... 23
3 Material und Methoden ... 25
3.1 Behandlung der Tiere und Probengewinnung ... 25
3.2 Untersuchungen im Serum ... 26
3.2.1 25-OHD3-, 1,25-(OH)2D2/3 und 24,25-OHD3-Konzentration im Serum .. 27
3.2.2 Gesamtcalcium-Konzentration im Serum ... 27
3.3 RNA-Expression ... 28
3.3.1 RNA-Isolation und cDNA-Synthese ... 28
3.3.2 Qualitative RT-PCR ... 29
3.3.2.1Primer-Design ... 29
3.3.2.2Durchführung der qualitativen RT-PCR ... 31
3.3.2.3Aufreinigung der Amplifikate ... 32
3.3.2.42 % DNA-Kontroll-Gel ... 33
3.3.2.5Sequenzierung ... 33
3.3.3 Quantitative RT-PCR ... 34
3.3.3.1Klonierung der Amplifikate ... 34
3.3.3.2Erstellen von Standardreihen ... 37
3.3.3.3Quantifizierung der RNA-Expression in den verschiedenen Geweben - SYBR®-Green ... 37
3.3.3.4Quantifizierung der RNA-Expression in den verschiedenen Geweben - TaqMan® ... 38
3.3.3.5Auswertung der quantitativen RT-PCR ... 39
3.4 Protein-Expression ... 40
3.4.1 Präparative Methoden ... 40
3.4.1.1Vollhomogenatpräparation mit FastPrep® ... 40
3.4.1.2Gesamtmembranpräparation mit FastPrep® ... 41
3.4.1.3Proteinbestimmung nach Bradford ... 41
3.4.2 Western-Blot-Verfahren ... 42
3.4.2.1Diskontinuierliche SDS-PAGE ... 43
3.4.2.2Trans-Blot® TurboTM Transfer System ... 44
3.4.2.3Indirekte Immundetektion ... 45
3.4.3 Normalisierung ... 47
3.4.4 Auswertung der Western-Blot-Daten ... 50
3.5 Funktionelle Untersuchungen in der Ussing-Kammer ... 50
3.5.1 Inkubation der Gewebe ... 51
3.5.2 Bestimmung des Transportes von Rhodamin 123 ... 51
3.5.3 Auswertung ... 52
3.6 Statistische Auswertung ... 52
4 Ergebnisse ... 54
4.1 Konzentration von 25-OHD3, 1,25-(OH)2D2/3 und Gesamtcalcium im Serum ... 54
4.2 RNA-Expression ... 56
4.2.1 Referenzgene β-aktin und gapdh ... 56
4.2.2 Vitamin-D-Metabolismus und transzellulärer Calcium-Transport ... 59
4.2.2.1Renale Expression von cyp24a1 und cyp27b1 ... 59
4.2.3 Intestinale Expression von trpv6, calbindin-D9k und pmca1b ... 60
4.2.4 Expression von vdr ... 61
4.2.4.1Expression in den verschiedenen Organen ... 61
4.2.4.2Einfluss der Behandlung ... 61
4.2.5 Expression von pxr ... 62
4.2.5.1Expression in den verschiedenen Organen ... 62
4.2.5.2Einfluss der Behandlung ... 63
4.2.6 Expression von cyp3a9, cyp3a18 und cyp3a62 ... 64
4.2.6.1Expression in den verschiedenen Organen ... 64
4.2.6.2Einfluss der Behandlung ... 67
4.2.7 Expression von mdr1a und mdr1b ... 69
4.2.7.1Expression in den verschiedenen Organen ... 69
4.2.7.2Einfluss der Behandlung ... 70
4.2.8 Expression von oat3 ... 71
4.2.9 Korrelationen zwischen pxr und cyp3a ... 72
4.2.10 Korrelation zwischen pxr und mdr1a bzw. mdr1b ... 73
4.3 Protein-Expression ... 74
4.3.1 Expression von CYP3A ... 75
4.3.2 Expression von P-gp ... 75
4.4 Transport von Rhodamin 123 über das Ileum ... 79
5 Diskussion ... 82
5.1 Beurteilung der angewandten Methoden ... 82
5.1.1 Tiere und Applikationsrouten ... 82
5.1.2 Analytik im Serum ... 84
5.1.3 Quantitative RT-PCR ... 85
5.1.4 Auswahl der Referenzgene ... 85
5.1.5 Western Blot ... 87
5.1.6 Ussing-Kammer-Technik ... 90
5.2 Einfluss der Behandlungen auf den Vitamin-D-Metabolismus und klassische, Vitamin D-regulierte Gene... 91
5.2.1 1,25-(OH)2D3 i. p. ... 91
5.2.2 25-OHD3 oral ... 94
5.2.3 Vitamin D3 i. m. ... 95
5.3 Einfluss der Behandlung auf CYP3A Isoenzyme ... 96
5.3.1 1,25-(OH)2D3 i. p. ... 96
5.3.1.1Leber ... 96
5.3.1.2Niere ... 98
5.3.1.3Proximales und distales Jejunum ... 99
5.3.2 25-OHD3 oral und Vitamin D3 i. m. ... 101
5.4 Einfluss der Behandlung auf Eliminationsmechanismen ... 103
5.4.1 1,25-(OH)2D3 i. p. ... 103
5.4.1.1Leber ... 103
5.4.1.2Niere ... 104
5.4.1.3Proximales und distales Jejunum ... 106
5.4.2 25-OHD3 oral und Vitamin D3 i. m. ... 107
5.4.2.1Leber und Niere ... 107
5.4.2.2Proximales und distales Jejunum ... 109
5.5 Abschließende Bewertung und Ausblick ... 111
6 Zusammenfassung ... 113
7 Summary ... 116
8 Literaturverzeichnis ... 118
9 Anhang ... 150
A. Alleinfuttermittel für Ratten (ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Deutschland) ... 150
B. Rezepte für die Klonierung ... 151
C. Rezepte für Gelelektrophorese und Western-Blot ... 152
D. Krebs-Henseleit-Lösung mit Glukose für die Ussing-Kammer... 154
E. Firmenverzeichnis ... 155
F. RNA-Expression von der Leber, der Niere, dem proximalen und distalen Jejunum ... 159
10 Danksagung ... 163
Abkürzungsverzeichnis
ABC-Transporter Adenosintriphosphat-Binding-Cassette-Transporter ANOVA analysis of variance (Varianzanalyse)
ATP Adenosintriphosphat
bp Basenpaare
ca. circa
CaCo-2 humane Coloncarcinoma-Zelllinie 2 CAR Constitutive Androstane Receptor
cDNA complementary Desoxyribonucleic Acid (komplentäre Desoxyribonukleinsäure)
cm Zentimeter
CYP24A1 Cytochrom P450 24A1
CYP27B1 Cytochrom P450 27B1
CYP3A Cytochrom P450 Familie 3 Subfamilie A DCAD negative Dietary Cation-Anion Difference
dist. distal
dist. Jej. distales Jejunum
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP 2‘-Desoxyribonukleosid-5‘-triphosphat
E. coli Escherichia coli
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EGTA Ethylenglycol-bis(β-aminoethylether)-N,N,N‘,N‘-tetraacetat FGF-23 Fibroblast-Growth-Factor 23
GAPDH Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
g Gramm
g vielfaches der Erd- oder Normalbeschleunigung
griech. griechisch
h hour (Stunde)
HRP Horseradish-Peroxidase
IE Internationale Einheit
IGF-1 Insulin-like Growth Factor
IPTG Isopropyl-β-D-Galaktopyranosid
i. m. intramusklär
i. v. intravenös
kDa kilo-Dalton
kg Kilogramm
KG Körpergewicht
LBD Liganden-Bindungs-Domäne
LC-MS/MS liquid chromatography/tandem mass spectrometry (Flüssigkeitschromatographie/Tandem-
Massenspektrometrie
LS180 humane Colon-Adenocarcinoma-Zelllinie
MDR multidrug resistant
min Minute
ml Milliliter
mm Millimeter
mM Millimolar
n. d. not detectable (nicht nachweisbar)
ng Nanogramm
n. s. nicht signifikant
nM Nanomolar
OAT Organic-Anion-Transporter
p probability value (Irrtumswahrscheinlichkeit)
PBS Phosphate Buffered Saline
PBST Phosphate Buffered Saline with Tween 20
PCR polymerase chain Reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
pg Picogramm
P-gp Permeabilitäts-Glykoprotein
PMCA1b Plasma-Membran-Calcium-ATPase 1b
PRE Pregnan-X-Rezeptor-Response-Elements
prox. proximal
prox. Jej. proximales Jejunum
PTH Parathormon
PXR Pregnan-X-Rezeptor
quantitative RT-PCR quantitativen Reverse-Transkriptase-Polymerase-Ketten- Reaktion
RANKL Receptor-Activator-of-NF-KB Ligand RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
RT Raumtemperatur
RXR Retinoid-X-Rezeptor
rpm revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute)
s second (Minute)
sCa2+ ionisiertes Calcium im Serum
SDS Sodium Dodecyl Sulfate (Natriumdodecylsulfat)
SDS-Page diskontinuierliche Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid- Gelelektrophorese
SEM Standard Error of the Mean (Standardfehler)
SLC Solute-Carrier-Familie
sPO4 Phosphat im Serum
tgl. täglich
u. a. unter anderem
ü. N. über Nacht
TRPV6 Transient-Rezeptor-Potential-Cation-Vanilloid 6
TS Trockenmasse
VDBP Vitamin-D-bindendes Protein
VDR Vitamin-D-Rezeptor
V Volt
x̅ arithmetischer Mittelwert
X-Gal 5-Brom-4-Chlor-3-Indoxyl-β-D-Galactopyranosid
z. B. zum Beispiel
1,25-(OH)2D3 1,25-Dihydroxycholecalciferol 25-OHD3 25-Hydroxycholecalciferol
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Strukturformel von Vitamin D3 und Vitamin D2 ... 3
Abbildung 2: Der Stoffwechselweg von Vitamin D (SCHLINGMANN et al. 2011) ... 6
Abbildung 3: Der Signalweg von 1,25-(OH)2D3 mit VDR (DIMEGLIO u. IMEL 2014) ... 8
Abbildung 4: Calcium-Absorption im Darm (CHRISTAKOS et al. 2016) ... 9
Abbildung 5: Serumkonzentration von 25-OHD3 (mit 24,25-OHD3) in ng/ml ... 54
Abbildung 6: Serumkonzentration von 1,25-(OH)2D3 in pg/ml ... 55
Abbildung 7: Serumkonzentration von Gesamtcalcium in mmol/l ... 56
Abbildung 8: RNA-Expression von β-aktin in der Leber, der Niere, im proximalen und distalen Jejunum ... 58
Abbildung 9: RNA-Expression von gapdh in der Leber, der Niere, im proximalen und distalen Jejunum ... 58
Abbildung 10: RNA-Expression von vdr/gapdh in der Leber, der Niere, im proximalen und distalen Jejunum ... 61
Abbildung 11: RNA-Expression von pxr/gapdh in der Leber, der Niere, im proximalen und distalen Jejunum ... 63
Abbildung 12: Verteilung von cyp3a9 und cyp3a62 in einzelnen Organen ... 65
Abbildung 13: RNA-Expression von cyp3a9/gapdh und cyp3a18/gapdh in der Leber, der Niere, im proximalen und distalen Jejunum ... 66
Abbildung 14: RNA-Expression von cyp3a62/gapdh in der Leber, der Niere, im proximalen und distalen Jejunum ... 67
Abbildung 15: Korrelation zwischen 25-OHD3 (24,25(OH)2D3) im Serum und cyp3a9/β-aktin-RNA-Expression in der Leber ... 69
Abbildung 16: RNA-Expression von mdr1a/gapdh und mdr1b/gapdh in Summe in der Leber, der Niere, im proximalen und distalen Jejunum ... 70
Abbildung 17: Korrelation zwischen der RNA-Expression von pxr/gapdh und cyp3a18/gapdh im proximalen Jejunum ... 73
Abbildung 18: Korrelation zwischen der RNA-Expression von pxr/gapdh und
mdr1a/gapdh im proximalen Jejunum ... 74 Abbildung 19: Korrelation zwischen der 25-OHD3 im Serum und der Protein-
Expression von P-gp/Villin in der Niere bei Ratten ... 77 Abbildung 20: Korrelation zwischen 25-OHD3 im Serum und Protein-Expression
von P-gp/Villin in der Niere bei Ratten ... 78 Abbildung 21: Rhodamin-Konzentration über die Zeit bei der 1,25-(OH)2D3
behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe ... 79 Abbildung 22: Rhodamin-Konzentration über die Zeit bei der 25-OHD3, der
Vitamin D3 und den dazugehörigen Kontrollgruppen ... 80 Abbildung 23: Korrelation zwischen 25-OHD3 (24,25(OH)2D3) im Serum und der
Endkonzentration des Verapamil-sensitiven Anteils von
Rhodamin 123 ... 81 Abbildung 24: Verhältnis der RNA-Expression der absoluten Kopien in der
Leber ... 86 Abbildung 25: RNA-Expression von mdr1a, mdr1b und mdr3 in verschiedenen
Organen ... 88 Abbildung 26: Exemplarisches Bild eines Western Blots beim Nachweis von
P-gp in der Leber, der Niere und im Jejunum mit
unterschiedlichen Proteinkonzentrationen ... 89 Abbildung 27: RNA-Expression CYP3A1/23 in verschiedenen Organen ... 102 Abbildung 28: P-gp-Protein-Expression nach der Behandlung mit 25-OHD3 (und
1,25-(OH)2D3) bei Schafen (WILKENS et al. 2016) ... 108
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Gehalt an Vitamin D in ausgewählten Nahrungs- und Futtermitteln... 4
Tabelle 2: Ausschnitt aus der Liste der Zulassung von Vitamin D3 (Durchführungsverordnung (EU) 2017/1492) ... 11
Tabelle 3: Übersicht über die RNA-Expression von Schaf und Ratte ... 22
Tabelle 4: Behandlungsprotokoll ... 25
Tabelle 5: Mastermix für cDNA-Synthese ... 28
Tabelle 6: Primersequenzen ... 30
Tabelle 7: Pipettierschema der qualitativen RT-PCR ... 32
Tabelle 8: Pipettierschema für die Ligation ... 35
Tabelle 9: Pipettierschema - SYBR® Green ... 38
Tabelle 10: Mastermix TaqMan® ... 39
Tabelle 11: Proteinkonzentrationen ... 44
Tabelle 12: Inkubationsbedingungen für den Nachweis von CYP3A und P-gp ... 46
Tabelle 13: Inkubationsbedingungen für den Nachweis von Cytochrom C, β- Aktin und Villin ... 49
Tabelle 14: Übersicht über die RNA-Expression von cyp27b1 in der Niere ... 59
Tabelle 15: Übersicht über die RNA-Expression von cyp24a1 in der Niere ... 59
Tabelle 16: Übersicht über die RNA-Expression von trpv6, calbindin-D9k und pmca1b im proximalen Jejunum ... 60
Tabelle 17: Übersicht über die RNA-Expression von vdr in der Leber, der Niere, im proximalen und distalen Jejunum ... 62
Tabelle 18: Übersicht über die RNA-Expression von pxr in der Leber, der Niere, im proximalen und distalen Jejunum ... 64
Tabelle 19: Übersicht über die RNA-Expression von cyp3a9, cyp3a18 und cyp3a62 in der Leber, im proximalen und distalen Jejunum ... 68
Tabelle 20: Übersicht über die RNA-Expression von mdr1a und mdr1b in der Leber, der Niere, im proximalen und distalen Jejunum ... 71
Tabelle 21: Übersicht über die RNA-Expression von oat3 in der Niere ... 72
Tabelle 22: Dosierung der Vitamin-D-Metaboliten anhand des metabolischen
Körpergewichtes ... 83
1 Einleitung
Anfang des 19. Jahrhunderts wurde erstmals der positive Effekt der Sonnenstrahlung auf die Knochengesundheit entdeckt. Heutzutage ist bekannt, dass die UV-B- Strahlung für die Synthese von Vitamin D in der Haut verantwortlich ist und dessen Beteiligung an der Regulation des Calcium-Haushaltes ist unumstritten. Da der Bedarf an Calcium durch Trächtigkeit, Laktation, Legetätigkeit und Wachstum erhöht wird, ist das Interesse an Vitamin D und seinen Metaboliten auch in Zusammenhang mit der Haltung landwirtschaftlich genutzter Haustiere hoch.
Mittlerweile werden Vitamin D weitere Funktionen, beispielsweise bei der Modulierung der Immunantwort und der Ätiologie kardiovaskulärer Erkrankungen, zugesprochen, was zu einem erheblichen Interesse der Öffentlichkeit beiträgt. Die optimale Versorgung mit Vitamin D wird allerdings sowohl in der Tier- als auch in der Humanmedizin kontrovers diskutiert. In den USA erhöhte sich die Anzahl der Personen, die Vitamin-D-Produkte einnahmen, von 27,2 % zwischen 1988-1994 auf 40,6 % zwischen 2003-2006 (GAHCHE et al. 2011). In Australien hat sich der Umsatz von den verkauften Vitamin-D-Produkten innerhalb von 10 Jahren (2000-2010) mehr als verdoppelt (BILINSKI u. TALBOT 2014).
Aus klinischen Studien am Menschen wurde inzwischen abgeleitet, dass eine erhöhte Konzentration an Vitamin-D-Metaboliten im Serum zu einer verminderten Bioverfügbarkeit bestimmter Medikamente führen kann (SCHWARTZ 2009; LINDH et al. 2011). In Arbeiten an Zellkulturen und tierexperimentellen Studien konnten diese Hinweise nur zum Teil bekräftigt werden, zudem lagen in Bezug auf die RNA- und Protein-Expression diesbezüglich relevanter Enzyme und Transportmechanismen interessanterweise Unterschiede zwischen Ratten und Schafen vor (CHOW et al.
2011; WILKENS et al. 2016).
In den zuvor erwähnten Untersuchungen an Labornagern wurden allerdings in der Regel extrem hohe, weit über die auch experimentell in Human- und Tiermedizin üblichen Dosierungen hinausgehende Mengen von Vitamin-D-Metaboliten eingesetzt.
In der vorliegenden Arbeit soll daher der Frage nachgegangen werden, inwieweit die
beobachteten Unterschiede zum Einfluss von Vitamin-D-Metaboliten auf die Metabolisierung und Elimination von Xenobiotika auf das Behandlungsprotokoll und/oder die verwendete Tierart zurückzuführen sind. Es wurden daher funktionelle Untersuchungen und Expressionsstudien an Ratten durchgeführt, denen drei verschiedene Dosierungen von Vitamin-D-Metaboliten verabreicht wurden, die bereits an Schafen bzw. Rindern angewendeten worden waren.
2 Literaturübersicht
2.1 Vitamin D
2.1.1 Aufnahme, Synthese und Metabolismus
Vitamin D3 kann in der Haut durch UV-B-Strahlung gebildet oder über die Nahrung (Tabelle 1) in Form von Vitamin D3 oder Vitamin D2 aufgenommen werden. Vitamin D ist somit kein echtes Vitamin, da es vom Körper selbst synthetisiert werden kann.
Vitamin D2 entsteht aus Ergosterol, das als Sterin in der Zellmembran von Pilzen und Pflanzen vorkommt. Im Unterschied zu Vitamin D3 weist es eine zusätzliche Methylgruppe an C24 und eine Doppelbindung zwischen C22 und C23 auf (Abbildung 1).
Abbildung 1: Strukturformel von Vitamin D3 und Vitamin D2
Vitamin D3 Vitamin D2
Tabelle 1: Gehalt an Vitamin D in ausgewählten Nahrungs- und Futtermitteln Nahrungsmittel Vitamin D Gehalt in µg
oder ng/100 g (SOUCI et al. 2016)
Menge, die den tgl. Bedarf des Menschen (20 µg) decken würde (GERMAN- NUTRITION-SOCIETY 2012)
Hering (Atlantik) 25 µg ca. 80 g/Tag
Hühnerei 2,9 µg ca. 11 Eier/Tag
Zuchtchampignon 1,9µg ca. 1 kg/Tag
Kuhmilch fettarm 28 ng ca. 71 l/Tag
Schweinehackfleisch - -
Tomate, Paprika, Möhre
- -
Reis, Kartoffeln, Nudeln - -
Vitamin D Gehalt in µg/kg Frischfutter
Menge, die den tgl. Bedarf eines Schafes (10 µg/80 kg KM) decken würde
(KAMPHUES et al. 2014) Deutsches Weidelgras
(Foxtrot), Ernte im Juni
0,07 µg/kg Frischgras (JAPELT et al. 2011)
143 kg Frischgras/Tag
Deutsches Weidelgras (Foxtrot), Ernte im September
5,69 µg/kg Frischgras (JAPELT et al. 2011)
1,8 kg Frischgras/Tag
Weizenstroh -
(ELFERS et al. 2015)
-
1 µg Vitamin D = 40 Internationale Einheiten (IE)
Vitamin D3 hat seinen Ursprung im 7-Dehydrocholesterol, das in der Leber synthetisiert wird. In der Epidermis wird durch die UV-B-Strahlung (Wellenlänge 315-280 nm) der
das Prävitamin D3. Das Prävitamin D3 ist wärmeinstabil, sodass es bei Körpertemperatur zu Vitamin D3 isomerisiert. Überschüssiges Prävitamin D3 wird reversibel in die inaktiven Substanzen Lumisterol und Tachysterol umgewandelt.
Es ist abhängig von der Spezies, ob die Aufnahme von Vitamin D über die Nahrung oder die Synthese in der Haut überwiegt. Die Nahrung des Menschen enthält zur Deckung des täglichen Bedarfs nicht ausreichend Vitamin D (Tabelle 1), sodass Menschen auf die Vitamin-D-Synthese in der Haut angewiesen sind. Über die Verhältnisse bei Haustieren bestehen diesbezüglich teilweise noch große Unklarheiten. Bei Schafen konnte eine deutlich geringere Konzentration an 7- Dehydrocholesterol in der Haut nachgewiesen werden als bei Ziegen (KOHLER et al.
2013). Zudem haben Schafe Wolle, die kaum UV-B-Strahlung durchlässt, sodass die orale Aufnahme von Vitamin D bei Schafen einen höheren Stellenwert einnimmt (HORST u. LITTLEDIKE 1982; KOHLER et al. 2013). Dahingegen ist bei Rind und Ziege die Vitamin-D-Synthese in der Haut wichtiger (HORST u. LITTLEDIKE 1982;
KOHLER et al. 2013).
Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wird der Fokus auf Vitamin D3 gelegt. Vitamin D3, ob in der Haut synthetisiert oder über die Nahrung aufgenommen, ist inert. Es wird, wie seine Metaboliten, zu 99 % an Vitamin-D-bindende Proteine (VDBP) oder anderen Serumproteinen gebunden über das Blut transportiert.
Abbildung 2: Der Stoffwechselweg von Vitamin D (SCHLINGMANN et al. 2011) sCa2+ = ionisiertes Calcium im Serum; sPO4 = Phosphat im Serum
Nach Aufnahme oder Synthese wird Vitamin D3 hauptsächlich in der Leber an Position 25 hydroxyliert, sodass 25-Hydroxycholecalciferol (25-OHD3) entsteht. Die Fähigkeit zur 25-Hydroxylase haben verschiedene Enzyme, wobei beim Menschen das microsomale Cytochrom P450 2R1 (CHENG et al. 2003) und bei der Ratte das microsomale Cytochrom P450 2J3 (YAMASAKI et al. 2004) eine wichtige Rolle spielen.
Die Konzentration von 25-OHD im Blut zu messen eignet sich am besten um den Vitamin-D-Status zu überprüfen, da die Halbwertszeit relativ lang ist (15 Tage (K. S.
JONES et al. 2014)) und die Synthese in der Leber kaum reguliert und damit nur abhängig vom verfügbaren Vitamin D ist. Zudem spiegelt die 25-OHD-Konzentration im Serum sowohl das synthetisierte als auch das über die Nahrung aufgenommene Vitamin D wider (ZERWEKH 2008).
In der Niere unterläuft 25-OHD3 den letzten Hydroxylierungsschritt zum Steroidhormon 1,25-Dihydroxycholecalciferol (1,25-(OH)2D3) (FRASER u. KODICEK 1970), welches der metabolisch aktivste Metabolit von Vitamin D ist. Dieser Schritt wird durch das
1α-Hydroxylase Aktivität besitzt, katalysiert. CYP27B1 ist streng reguliert. Die Synthese von CYP27B1 wird durch sinkende Calcium- und Phosphatserumkonzentrationen, steigender Sekretion von Parathormon (PTH) (FRASER u. KODICEK 1973; MURAYAMA et al. 1999) und durch Insulin-like Growth Factor 1 (IGF-1) (NESBITT u. DREZNER 1993) aktiviert. Fibroblast-Growth-Factor 23 (FGF-23) (SHIMADA et al. 2004) und 1,25-(OH)2D3 (BRENZA u. DELUCA 2000) hemmen die Synthese von CYP27B1. Auch andere Organe bzw. Zellen wie z. B.
Keratinozyten, Lymphknoten, Nebennierenmark und Haarfollikel enthalten CYP27B1 (ZEHNDER et al. 2001).
25-OHD3 und 1,25-(OH)2D3 werden in vier bzw. sechs Schritten durch das Isoenzym Cytochrom P450 24A1 (CYP24A1) mit 24-Hydroxylase-Aktivität abgebaut, sodass 24,25,26,27-tetranor-23(OH)D3 bzw. Calcitroinsäure entstehen (SAKAKI et al. 1999).
Beide Metaboliten werden über die Galle ausgeschieden. Die Expression von CYP24A1 wird durch 1,25-(OH)2D3 (OHYAMA et al. 1994; ZIEROLD et al. 1994) und FGF-23 (INOUE et al. 2005) induziert und durch PTH gehemmt (ZIEROLD et al. 2001).
1,25-(OH)2D3 vermittelt seine hormonelle Wirkung über den genomischen Weg, indem 1,25-(OH)2D3 an den Kernrezeptor Vitamin-D-Rezeptor (VDR, NR1I1) bindet und darüber Einfluss auf die Expression bestimmter Gene nimmt. CHOW et al. (2009) wiesen im Darm bei Ratten die höchste RNA-Expression von vdr im Colon nach, gefolgt von einer leicht absteigenden Tendenz entlang der Dünndarm-Achse. Auf Proteinebene lag bei Ratten die höchste Expressionsrate im Duodenum und Jejunum vor, gefolgt vom Colon, Ileum und der Niere (SANDGREN et al. 1991). In der Leber ist der VDR, sowohl auf RNA- als auch auf Protein-Ebene, nur sehr gering exprimiert (SANDGREN et al. 1991; CHOW et al. 2009). Der Rezeptor besteht aus der COOH- terminalen Liganden-Bindungsdomäne, dem Verbindungsstück (hinge region) und der NH2-terminalen DNA-Bindungsdomäne. 1,25-(OH)2D3 bindet über die 1α-Hydroxylgruppe an das COOH-terminale Ende des VDRs. Die Bindung führt zu einer Konformationsänderung, woraufhin eine Heterodimerisation mit dem Retinoid-X-Rezeptor (RXR, NR2B1) folgt (KLIEWER et al. 1992). Dieser heterodimere Komplex wandert vom Cytosol über Mikrotubuli zum Zellkern (BARSONY u. MCKOY
1992). Das NH2-terminale Ende des VDR-RXR-Komplexes bindet mit anderen co- regulierenden Proteinen über seine zwei Zinkfinger an bestimmte DNA-Sequenzen, auch Vitamin D Response Elements genannt (VDRE), und hemmt oder aktiviert so die Transkription eines Gens (Abbildung 3). Es wurden unter anderem VDREs in den Genen von PTH (DEMAY et al. 1992), VDR selbst (ZELLA et al. 2006) und CYP24A1 (OHYAMA et al. 1994) gefunden.
Abbildung 3: Der Signalweg von 1,25-(OH)2D3 mit VDR (DIMEGLIO u. IMEL 2014)
Über diesen genomischen Weg reguliert 1,25-(OH)2D3 vor allem den Calciumhaushalt.
Sinkt die Calcium-Konzentration im Blut, wird vermehrt Parathormon aus der Nebenschilddrüse ausgeschüttet. Parathormon induziert die Transkription von CYP27B1 und damit einen Anstieg der 1,25-(OH)2D3 Synthese. Der biologisch aktivste
Vitamin-D-Metabolit bindet an den VDR im Enterozyten, sodass die Calcium- Absorption im Darm über eine vermehrte Expression des Calcium-Kanals Transient- Rezeptor-Potential-Cation-Vanilloid 6 (TRPV6), des Calcium-Bindungsproteins Calbindin-D9k und der basolateralen Plasma-Membran-Calcium-ATPase (PMCA) gesteigert wird (ZELINSKI et al. 1991; CAI et al. 1993; SONG et al. 2003) (Abbildung 4). Im distalen Tubulus der Niere induziert 1,25-(OH)2D3 eine vermehrte Expression von Calbindin-D9k und Calbindin-D28k und zu einem geringeren Ausmaß TRPV5 und TRPV6, was zu einer vermehrten Reabsorption von Calcium führt (SONG et al. 2003).
Zudem wird über die Bindung von 1,25-(OH)2D3 an den VDR in Osteoblasten die Expression von Receptor-Activator-of-NF-KB-Ligand (RANKL) gesteigert und durch dessen Bindung an RANK die Aktivität von Osteoklasten erhöht (S. KIM et al. 2006).
Außerdem wird im Knochen bei erhöhten 1,25-(OH)2D3-Konzentrationen vermehrt Pyrophosphat ausgeschüttet, welches ein starker Mineralisationsinhibitor ist (LIEBEN et al. 2012). Beide Regulationsmechanismen im Knochen führen zu einer Erhöhung des freien Calciums und Phosphats.
Abbildung 4: Calcium-Absorption im Darm (CHRISTAKOS et al. 2016)
Der VDR wurde auch in anderen Zellen wie Immunzellen (VELDMAN et al. 2000) und in bestimmten Tumorgeweben (BURAS et al. 1994) nachgewiesen. Auf Basis dieser Erkenntnis folgten weitere Untersuchungen, die zeigten, dass 1,25-(OH)2D3 z. B. einen Effekt auf die Proliferation und die Reaktion von B-Zellen hat (S. CHEN et al. 2007), sich positiv auf die Insulinresistenz auswirkt (SUN et al. 2016) und die Proliferation von Brustkrebszelllinien reduziert (BURAS et al. 1994).
2.1.2 Einsatz von Vitamin D
2.1.2.1 Empfehlung für den Menschen
Nicht zuletzt hat auch das öffentliche Interesse an den Diskussionen über den Bedarf an Vitamin D in den letzten Jahren zu einem deutlichen Anstieg des Verkaufs und der Einnahme von Vitamin-D-Produkten geführt (GAHCHE et al. 2011; BILINSKI u.
TALBOT 2014). Die Deutsche Gesellschaft für Ernährung e.V. (DGE) empfiehlt eine 25-OHD-Serumkonzentration von > 20 ng/ml und damit eine tägliche Aufnahme von 20 µg bzw. 800 Internationale Einheiten (IE) Vitamin D bei fehlender endogener Synthese (https://www.dge.de/wissenschaft/referenzwerte/vitamin-d/, abgerufen am 12.09.2018). Es sind aber auch Empfehlungen aufgrund von Studien vorhanden, die eine deutlich höhere 25-OHD-Konzentration von > 30 ng/ml befürworten, die bei geringer UV-Exposition eine tägliche orale Aufnahme von ≥ 25 µg bzw. 1.000 IE Vitamin D notwendig machen (BISCHOFF-FERRARI et al. 2006; HOLICK 2006). Die unterschiedlich hohen Empfehlungen und die zum großen Teil frei verkäuflichen Vitamin-D-Produkte können zu unkontrolliert hohen Dosierungen von Vitamin D führen.
2.1.2.2 Vitamin D als Futtermittelzusatzstoff
Seit 2003 ist die Verwendung von Futtermittelzusatzstoffen in der Verordnung (EG) Nr.
1831/2003 des Europäischen Parlaments und des Rates vom 22.09.2003 geregelt.
Laut Begriffsbestimmung in ebendieser Verordnung haben Futtermittelzusatzstoffe einen positiven Einfluss auf das Tier, das Futter und/oder die Umwelt. Sowohl Vitamin D3 als auch 25-OHD3 gehören zu den ernährungsphysiologischen Zusatzstoffen (Verordnung (EG) Nr. 1831/2003).
Eine Zulassung für Vitamin D3 liegt u. a. für Rinder und Schafe vor (Tabelle 2).
25-OHD3 ist bei den Tierarten Geflügel und Schwein ebenfalls als Futtermittelzusatzstoff zugelassen (Verordnung (EG) Nr. 887/2009).
Tabelle 2: Ausschnitt aus der Liste der Zulassung von Vitamin D3
(Durchführungsverordnung (EU) 2017/1492)
Tierart Höchstgehalt an Vitamin D pro kg Alleinfuttermittel
25-Hydroxy- cholecalciferol*
in IE in µg in µg
Kälber, Ferkel 10.000 250 -
Rinder, Schafe, Einhufer
4.000 100 -
Schweine 2.000 50 50
Masthühner, Truthühner
5.000 125 125
sonstiges Geflügel 3.200 80 80
Fische 3.000 75 -
andere Tierarten 2.000 50 -
*Höchstmenge gilt für die Kombination aus Vitamin D3 und 25-Hydroxycholecalciferol
2.1.2.3 Vitamin D in der Tiermedizin
Zurzeit ist in Deutschland Vitamin D3 1.000.000 IE ad us. vet. als Injektionslösung für Rinder von der Firma bela-pharm zur Prophylaxe der Gebärparese und zur Therapie
und Prophylaxe von Vitamin-D-Mangelerkrankungen (Osteomalazie oder Rachitis) zugelassen. Dosierungen laut Packungsbeilage:
Prophylaxe der Gebärparese: einmalig 250-500 µg bzw. 10.000-20.000 IE Cholecalciferol/kg KG intramuskulär oder subcutan sieben Tage vor dem voraussichtlichen Abkalbetermin
Therapie oder Prophylaxe von Osteomalazie oder Rachitis: einmalig 25-50 µg bzw.
1.000-2.000 IE Cholecalciferol/kg KG intramuskulär oder subcutan
2.2 Metabolisierung und Elimination von Xenobiotika
Xenobiotika (griechisch: dem Leben fremde Stoffe) sind Substanzen, die dem biologischen System von exogen zugeführt werden. Hierzu zählen z. B. Medikamente und Pestizide. Gelangen Xenobiotika in den Organismus, werden diese in der Regel metabolisiert und über verschiedene Transportwege eliminiert.
Die Metabolisierung, auch Biotransformation genannt, von endogenen oder xenobiotischen Substraten ist die chemische Umwandlung, um einen ausscheidungsfähigen Metaboliten zu erhalten. Die Biotransformation findet in zwei Teilschritten statt: in der Phase-I-Reaktion wird das Substrat strukturell durch Oxidation, Reduktion, Hydrolyse von Estern und Säureamiden oder durch Austauschreaktionen verändert. So entstehen Metaboliten, die unwirksam, schwächer (z. B. Barbiturate) oder stärker (z. B. Parathion zu Paraoxon) wirksam sind als die Ausgangssubstanz. In der Phase-II-Reaktion wird ein endogener Stoff gebunden (Konjugationsreaktion). Es sind die Enzyme der Cytochrom P450 Familie 3 Subfamilie A (CYP3A), die in der Phase-I-Reaktion eine entscheidende Rolle spielen.
Ca. 50 % der eingesetzten Medikamente beim Menschen werden durch diese Enzyme metabolisiert (WRIGHTON u. RING 1999). Daher wird in dieser Arbeit der Schwerpunkt bei der Metabolisierung von Xenobiotika auf diese Subfamilie gelegt.
Die Konzentration von endogenen und xenobiotischen Substraten im Gewebe wird
Superfamilie der ATP-Binding-Cassette-Transporter (ABC-Transporter), die Uptake- Transporter sind Mitglieder der Solute-Carrier-Superfamilie (SLC). Hier soll jeweils ein für die Elimination von Xenobiotika wichtiger Transporter aus jeder Superfamilie vorgestellt werden: das Permeabilitäts-Glykoprotein (P-gp) und der Organic- Anion-Transporter 3 (OAT3).
Der Kernrezeptor Pregnan-X-Rezeptor (PXR) ist als Transkriptionsfaktor über die Regulation der Genexpression von z. B. CYP3A und P-gp an der Metabolisierung und Elimination von Xenobiotika beteiligt (SYNOLD et al. 2001).
2.2.1 Cytochrom P450 3A
Der Name Cytochrom P450 setzt sich aus folgenden Bestandteilen zusammen: cyto (griech.) = Zelle, chroma (griech.) = Farbe, P = Pigment, 450 = Wellenlänge des absorbierten Lichtes.
CYP3A-Isoenzyme haben als prosthetische Gruppe einen an Eisen gebundenen Protoporphyrin IX Ring (Häm b) und zählen damit zu den Hämproteinen. Im Ruhezustand liegt das Eisen in oxidierter Form als Fe3+ vor. Bindet ein Substrat an das aktive Zentrum, wird das Eisen durch einen Elektronen-Transfer durch die NADP- abhängige Cytochrom-P450-Reduktase zu Fe2+ reduziert. Sauerstoff (O2) lagert sich an das Isoenzym an und es erfolgt ein weiterer Elektronentransfer durch die NADP- abhängige Cytochrom-P450-Reduktase. Dies führt zu einer Umlagerung, sodass O2
gespalten wird. Ein Sauerstoffatom wird als Wassermolekül (H2O) freigesetzt, während das andere in eine R-H-Bindung des Substrats inseriert und somit eine Hydroxylgruppe (R-O-H) bildet. Das hydroxylierte Substrat wird abgespalten und an die Bindungsstelle des Enzyms setzt sich ein Wasserstoffatom.
Auch bei der Ratte spielen die Isoenzyme von CYP3A eine entscheidende Rolle bei der Phase-I-Reaktion. Die CYP3As sind in der Membran des endoplasmatischen Retikulums lokalisiert. Bei Ratten sind folgende Isoenzyme von CYP3A nachgewiesen worden: CYP3A1/23 (NAGATA et al. 1999), CYP3A2 (GONZALEZ et al. 1986),
CYP3A9 (WANG et al. 1996), CYP3A18 (STROTKAMP et al. 1995) und CYP3A62 (MATSUBARA et al. 2004). Die Verteilung der Isoenzyme ist organ- und geschlechtsabhängig. In der Leber liegt im Vergleich zum Darm und den Nieren die höchste Konzentration an CYP3As vor (WARRINGTON et al. 2004). Vom Duodenum bis zum Ileum ist die Konzentration von CYP3A absteigend (MUREITHI et al. 2012) und in den Villi intestinales zehnmal höher als im Bereich der Glandulae intestinales (Lieberkühn-Krypten) (HOENSCH et al. 1976).
An der Metabolisierung von Xenobiotika sind vor allem CYP3A9, CYP3A18 und CYP3A62 beteiligt (TAKARA et al. 2003; MATSUBARA et al. 2004). Die höchste Expression von CYP3A9 zeigte sich bei weiblichen Ratten in der Leber und bei männlichen Ratten im Duodenum (MATSUBARA et al. 2004). Mit geringeren Protein- Expressionsraten konnte die Isoform auch in der Lunge, der Niere (Cortex > Medulla) und dem Gehirn nachgewiesen werden (ANAKK et al. 2003).
CYP3A18 wird sowohl auf RNA-Ebene als auch auf Proteinebene überwiegend bei männlichen Tieren in der Leber exprimiert (ROBERTSON et al. 1998; MATSUBARA et al. 2004) und nur in einem geringen Ausmaß im Darm (MATSUBARA et al. 2004).
Die RNA-Expression von CYP3A18 sinkt bei kastrierten, männlichen Ratten in der Leber auf die Höhe von weiblichen Ratten, sodass davon ausgegangen werden kann, dass die Expression von Testosteron abhängig ist (ROBERTSON et al. 1998).
Die RNA- und Protein-Expression von CYP3A62 ist in der Leber bei weiblichen Ratten deutlich höher als bei männlichen Tieren, zudem gibt es bei Weibchen keinen Unterschied in der RNA-Expression zwischen Leber und Darm (MATSUBARA et al.
2004). Bei männlichen Ratten hingegen ist die RNA-Expression im Darm höher als in der Leber (MATSUBARA et al. 2004; TAKARA et al. 2007). MATSUBARA et al. (2004) konnten eine abnehmende Expression vom Duodenum zum Ileum nachweisen, wohingegen TAKARA et al. (2007) einen Anstieg verzeichneten.
2.2.2 Permeabilitäts-Glykoprotein
Im Folgenden ist mit P-gp das Protein gemeint, welches durch das humane MDR1 bzw. durch die murinen mdr1a und mdr1b Gene exprimiert wird.
P-gp steht für Permeabilitäts-Glykoprotein, da die Efflux-Pumpe als Glykoprotein die Zellmembran für seine Liganden permeabel macht. P-gp, auch ABCB1 genannt, gewinnt die Energie zum primär aktiven Transport durch die Hydrolyse von Adenosintriphosphat (ATP) und gehört damit zu der ATP-Binding Cassette Transporter Superfamilie. 1976 wurde P-gp das erste Mal in einer Chinese Hamster Ovary Zelllinie (CHO) von Juliano und Ling charakterisiert (JULIANO u. LING 1976).
P-gp besteht aus zwei Hälften, die jeweils eine Sequenzhomologie von 43 % aufweisen und durch eine intrazelluläre Linker-Region miteinander verbunden sind.
Jede Hälfte besteht aus einer Transmembranären Domäne mit sechs α-Helices und einer intrazellulären ATP-Bindungsstelle, auch Nukleotid-Bindungsstelle genannt. Die Linker-Region, die die zwei transmembranären Domänen verbindet, weist durch Proteinkinase C phosphorylierte Bereiche auf (CHAMBERS et al. 1993). An der ersten extrazellulären Schleife vom N-Terminus befinden sich drei Glykosylierungen (C. J.
CHEN et al. 1986), die als posttranslationale Modifikation hinzugefügt werden, sodass sich die Größe von P-gp von 140 kDa auf 170 kDa erhöht (RICHERT et al. 1988).
P-gp wird vor allem in den Organen exprimiert, die eine Barriere zwischen „innen“ und
„außen“ darstellen. In den Villi der Enterozyten stellt P-gp eine Absorptionsbarriere gegenüber oral aufgenommenen Substanzen dar, indem es die resorbierten Substanzen direkt wieder in das Darmlumen transportiert (WESTERLUND et al. 2008).
In den Hepatozyten, die an die Gallenkapillaren angrenzen, und in proximalen Tubuluszellen der Niere hat P-gp eine Ausscheidungsfunktion, da es sowohl endogene Substanzen als auch Xenobiotika oder deren Metaboliten in die Galle bzw. in den Harn sezerniert (THIEBAUT et al. 1987). In der Blut-Hirn/Plazenta/Hoden-Schranke bildet P-gp einen Schutz gegenüber toxischen Substanzen (CORDON-CARDO et al. 1989) und in der Nebenniere schützt es das Gewebe vor einer lokalen, hohen Konzentration an hier synthetisierten Corticosteroiden (THIEBAUT et al. 1987; UEDA et al. 1992).
Der genaue Transportmechanismus ist bis heute nicht eindeutig geklärt. Für einen Transporter ungewöhnlich ist, dass P-gp ein sehr breites Substratspektrum hat und die Substrate dabei strukturell sehr unterschiedlich sind. Das Molekulargewicht der Substrate reicht von 252 Da (Phenytoin) bis 1203 Da (Cyclosporin A) (SCHINKEL et al. 1996). Sie besitzen zudem häufig eine aromatische Gruppe und sind basisch, aber auch nicht-aromatische und saure Substrate werden transportiert (SCHINKEL 1997).
Den meisten Substraten gemeinsam ist, dass sie natürlich und amphiphil sind (SCHINKEL 1997).
Beim Menschen codiert das MDR1-Gen (Multidrug-Resistance 1) für das Protein P- gp. Bei der Ratte gibt es die zwei Gene mdr1a und mdr1b, die dem MDR1 des Menschen entsprechen (HSU et al. 1989). Das Gen erhielt seinen Namen Multidrug- Resistance, da es erstmals in Krebszellen nachgewiesen wurde, die dieses Gen überexprimierten und damit vielfach resistent gegenüber Zytostatika waren. Aber auch eine verminderte Expression von P-gp führt zu schwerwiegenden, pharmakologischen Zwischenfällen. Bei einigen Hunderassen, wie zum Beispiel dem Collie, wird durch eine Mutation im MDR1-Gen mit autosomal-rezessivem Erbgang in der Blut-Hirn- Schranke nur wenig oder gar kein P-gp exprimiert. Das führt dazu, dass die betroffenen Tiere z. B. nach einer Behandlung mit dem makrozyklischen Lakton Ivermectin, einem P-gp Substrat, tödliche neurotoxische Symptome zeigen (PAUL et al. 1987).
Bei der Ratte wurde die höchste Expression von mdr1a im Dünndarm und Dickdarm nachgewiesen, zudem konnte es noch im Gehirn, der Lunge, der Niere und der Leber gezeigt werden (BRADY et al. 2002). TAKARA et al. (2003) wiesen sowohl von P-gp als auch von mdr1a einen Anstieg entlang der Dünndarmachse nach. BRADY et al.
(2002) konnten ebenfalls die höchste Expression im Ileum mit einer sinkenden Expressionsrate nach proximal und distal darstellen. Es lag bei mdr1a und mdr1b kein Geschlechtsunterschied vor (BRADY et al. 2002). Mdr1b ist im Vergleich zu mdr1a deutlich geringer im Darm exprimiert (BRADY et al. 2002) und zeigt auch keine Veränderung der Expressionsrate entlang der Achse (MACLEAN et al. 2008). Mdr1b wird vor allem in der Nebenniere, trächtigen Uteri und Ovarien exprimiert (SCHINKEL et al. 1997).
2.2.2.1 Experimentelle Beeinflussung von P-gp
Laut Biopharmazeutischem Klassifizierungssystem von Arzneistoffen gehört der Calcium-Kanalblocker Verapamil mit einem hohen gastrointestinalen Permeationsvermögen und einer hohen Wasserlöslichkeit zu der Klasse I (ESTUDANTE et al. 2013). Verapamil wird experimentell z. B. in Ussing-Kammer- Versuchen als P-gp-Inhibitor zusammen mit Rhodamin 123 als Substrat eingesetzt (FORTUNA et al. 2012; BALLENT et al. 2013). Rhodamin 123 ist ein synthetischer Farbstoff, der über P-gp transportiert wird (SCHINKEL et al. 1997; WADA et al. 2013), aber kein Substrat von CYP3A ist (YUMOTO et al. 2001).
2.2.3 Organic-Anion-Transporter 3
Die Familie der Organic-Anion-Transporter (OAT) gehören zu der Solute-Carrier- Superfamilie 22 (SLC22). OATs, basolateral oder apical liegend, transportieren wasserlösliche organische Anionen mit einem geringen molekularen Gewicht. Dazu gehören sowohl endogene als auch exogene Substanzen sowie deren Metaboliten.
Der Organic-Anion-Transporter verfügt über 12 transmembranäre Domänen, die N- und C-terminalen Ende liegen intrazellulär. Zwischen der 6. und 7. transmembranären Domäne befindet sich eine große intrazelluläre Schleife mit Phosphorylierungsstellen, wohingegen die zwischen der 1. und 2. transmembranären Domäne lokalisierte große extrazelluläre Schleife Glycosylierungsstellen aufweist (CIHLAR et al. 1999;
KUSUHARA et al. 1999). Durch den Na+-Dicarboxylat-Cotransporter wird ein α- Ketoglutarat-Gradient (intrazellulär > extrazellulär) aufgebaut, den OAT3 nutzt, um Anionen gegen α-Ketoglutarat nach intrazellulär zu transportieren (SWEET et al.
2003).
OAT3 (Ratte Slc22a8) wurde bei Ratten das erste Mal aus dem Plexus Choroideus isoliert (KUSUHARA et al. 1999). Die höchste RNA-Expression von OAT3 wurde in der Niere nachgewiesen, wobei OAT3 auch mit deutlich geringeren Konzentrationen in der Leber, der Lunge und in verschiedenen Gehirnbereichen vorkommt (BUIST et
al. 2002; BLEASBY et al. 2006). Als Uptake-Transporter liegt OAT3 in der basolateralen Membran und konnte in allen Segmenten des Nephrons nachgewiesen werden (KOJIMA et al. 2002). In der Niere konnte kein geschlechtsspezifischer Unterschied gezeigt werden, wohingegen männliche Ratten in der Leber eine deutlich höhere RNA-Expression als weibliche Ratten zeigten (BUIST et al. 2002).
2.2.4 Pregnan-X-Rezeptor
Der Pregnan-X-Rezeptor (PXR) erhielt seinen Namen, da er sowohl von endogenen als auch von exogenen C-21-Steroiden (z. B. Progesteron) aktiviert wird (KLIEWER et al. 1998). In der einheitlichen Nomenklatur, die auf dem phylogenetischen Stammbaum basiert, wird das Gen von PXR als NR1I2 bezeichnet (NUCLEAR RECEPTORS NOMENCLATURE COMMITEE 1999). NR1I2 steht für nuclear receptor (Kernrezeptor), Subfamilie 1, Gruppe I, Mitglied 2.
Die Liganden-Bindungs-Domäne (LBD) vom PXR liegt am C-terminalen Ende und ist durch die flexible Hinge-Region mit der DNA-Bindungs-Domäne verbunden. Der Rezeptor weist aber im Vergleich zu anderen Kernrezeptoren deutliche Unterschiede in der Struktur der LBD auf. Zum Beispiel ist in der Sekundärstruktur an Stelle der Helix 6 eine flexible Schlaufe, die je nach Größe des Liganden expandiert oder kontrahiert (WATKINS et al. 2001). Dieser Befund dient als mögliche Erklärung für das breite Spektrum der Liganden von Glukokortikoiden, Antimykotika, Steroidhormonen und fettlöslichen Vitaminen (S. A. JONES et al. 2000; MOORE et al. 2000; JACOBS et al. 2005). Wie die anderen Kernrezeptoren der Subfamilie 1 (z. B. VDR), bindet der ligandengebundene PXR mit Co-Aktivatoren an den RXR und bildet damit einen heterodimeren Komplex. Der Komplex bindet an PXR-Response-Elements (PREs) der Zielgene, um deren Expression zu induzieren oder zu inhibieren. Induzierende PREs wurden in den DNA-Sequenzen u. a. von CYP3A4 (LEHMANN et al. 1998) und MDR1 des Menschen gefunden (GEICK et al. 2001).
Zudem unterscheidet sich anders als bei den anderen Kernrezeptoren, die
mehr als 20 % (S. A. JONES et al. 2000). Die Aminosäuresequenz vom PXR zeigt bei der Ratte und beim Menschen eine Homologie von 76 % (S. A. JONES et al. 2000;
KLIEWER et al. 2002). Bei der DNA-Bindungsdomäne haben die unterschiedlichen Spezies eine Übereinstimmung von über 90 % (S. A. JONES et al. 2000). Daraus resultiert möglicherweise die unterschiedliche Ansprechbarkeit von PXR auf Substanzen zwischen den Spezies (S. A. JONES et al. 2000). Rifampicin z. B. aktiviert stark den humanen PXR, aber nur schwach den Maus-PXR (LEHMANN et al. 1998).
PXR wird bei der Ratte am stärksten in der Leber exprimiert, gefolgt vom Darm mit der höchsten Expression im Colon (ZHANG et al. 1999; KHAN et al. 2009). In geringem Maße konnte mittels Nothern Blot PXR in der Niere nachgewiesen werden (ZHANG et al. 1999), wobei die Arbeitsgruppe S. A. JONES et al. (2000) in der Niere keinen PXR bei der Ratte detektieren konnten.
2.3 Einfluss von Vitamin D auf die Metabolisierung und Elimination von Xenobiotika
2.3.1 Untersuchungen an Menschen
Die makrozyklischen Lactone Tacrolimus und Sirolimus sind immunsupprimierende Medikamente, die nach Organtransplantationen dauerhaft eingenommen werden müssen, um immunbedingte Abstoßungsreaktionen zu verhindern. Beide Wirkstoffe werden sowohl von CYP3A metabolisiert, als auch durch P-gp sezerniert (T. SAEKI et al. 1993; MILLER et al. 1997; SHIRAGA et al. 1999; JACOBSEN et al. 2001). Die Arbeitsgruppe LINDH et al. (2011) konnte bei Patienten, die entweder Tacrolimus oder Sirolimus dauerhaft einnahmen, in Monaten hoher Sonnenexposition geringere dosis- abhängige Konzentrationen des Medikaments im Serum nachweisen, als in Monaten mit niedriger Sonnenexposition. Der Einfluss von Vitamin D3 und seinen Metaboliten vor allem auf CYP3A, aber auch auf P-gp, mit einer resultierenden erhöhten Expression, könnte die geringere Bioverfügbarkeit von Tacrolimus bzw. Sirolimus erklären. Ein VDRE konnte bereits im humanen MDR1- und CYP3A4-Gen
nachgewiesen werden (THOMPSON et al. 2002; M. SAEKI et al. 2008). SCHWARTZ (2009) konnte zudem bei Patienten, die Atorvastatin, einen 3-Hydroxy-3- Methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase-Hemmer, parallel mit Vitamin D einnahmen, eine geringere Konzentration von Atorvastatin und seinen Metaboliten feststellen als bei Patienten, die nur Atorvastatin einnahmen. Als CYP3A4-Substrat könnte Atorvastatin (KANTOLA et al. 1998) durch eine erhöhte Expression von CYP3A4 durch die parallele Einnahme von Vitamin D schneller metabolisiert worden sein.
2.3.2 Tierexperimentelle Studien
WILKENS et al. (2016) konnten bei weiblichen Schafen nach einer Behandlung mit 1,25-(OH)2D3 (0,5 µg/kg KG intravenös 12 h vor dem Töten) eine Steigerung der RNA- Expression von Cyp3a24, dem ovinen Isoenzym, das dem CYP3A4 des Menschen entspricht (STUCHLIKOVA et al. 2015), in der Niere und dem Jejunum nachweisen.
Nach der Behandlung mit 25-OHD3 (6 µg/kg KG oral tgl. für 10 Tage) konnte das weder in der Leber, noch in der Niere und dem Jejunum gezeigt werden. Die Arbeitsgruppe ZIEROLD et al. (2006) identifizierte VDREs in der Promotersequenz von cyp3a9 und untersuchte bei Ratten den zeitlichen Verlauf der RNA-Expression von cyp3a9 im Darm nach der einmaligen intravenösen Applikation von 0,27 µg 1,25-(OH)2D3. Nach fünf Stunden war die höchste RNA-Expression von cyp3a9 für ca. zwei Stunden zu verzeichnen. Anschließend sank die Expression langsam wieder ab und erreichte nach ca. 36 Stunden den Wert der Kontrolltiere. CHOW et al. (2009) konnten bei dieser und höheren Dosierungen (0,27, 0,53, 1,07 µg/kg KG für insgesamt vier Tage) keinen Anstieg in der cyp3a9 RNA-Expression im Darm darstellen, aber die Proteinkonzentration von CYP3A war im Duodenum unter allen drei Versuchsgruppen signifikant erhöht. XU et al. (2006) konnten bei einer intraperitonealen Applikation von 1,25-(OH)2D3 in einer Konzentration von 0,01 µg und 0,1 µg/kg KG mit ein bis zwei Wiederholungen alle zwei Tage keinen signifikanten Unterschied zu der Kontrollgruppe in der intestinalen cyp3a9-RNA-Expression von Ratten nachweisen.
Dahingegen war im Darm bei der 0,1 µg/kg KG 1,25-(OH)2D3-Dosierung die cyp3a23-
RNA-Expression nach der dritten Behandlung und die Protein-Expression zu allen drei Zeitpunkten signifikant höher als bei der Kontrollgruppe (XU et al. 2006).
Beim Schaf war die RNA-Expression von Mdr1 im Jejunum und die Protein-Expression von P-gp in der Leber nach der Behandlung mit 25-OHD3 geringer als bei den Kontrollgruppen (WILKENS et al. 2016). Die Behandlung mit 1,25-(OH)2D3 zeigte hingegen keinen Effekt auf die RNA- oder Protein-Expression von Mdr1 bzw. P-gp in der Niere und dem Jejunum (WILKENS et al. 2016). Bei der Ratte konnte dagegen ein signifikanter Anstieg in der RNA-Expression von mdr1a in der Niere nach einer viertägigen Behandlung mit 0,27 und 0,53 µg/kg KG 1,25-(OH)2D3 (CHOW et al. 2010) nachgewiesen werden. Zudem konnte ein Anstieg auf RNA- und Protein-Ebene nach einer Behandlung mit 2,67 µg/kg KG 1,25-(OH)2D3 alle zwei Tage für insgesamt acht Tage dargestellt werden (CHOW et al. 2011). Der renale Uptake-Transporter OAT3 zeigte bei der Behandlung mit 1,07 µg/kg KG 1,25-(OH)2D3 für vier Tage, aber nicht bei 0,53 µg/kg KG, einen signifikanten Abfall in der RNA-Expression (CHOW et al.
2010).
Beim Schaf war die Vdr-RNA-Expression in der Leber, Niere, Pansen und Jejunum nach der 25-OHD3-Gabe unverändert, während nach der 1,25-(OH)2D3-Behandlung in der Niere eine tendenzielle Induktion zu beobachten war (WILKENS et al. 2016). Bei der Ratte konnte nach einer Behandlung mit 1,25-(OH)2D3 (2,0 und 2,67 µg/kg KG jeden zweiten Tag für acht Tage) in der Leber keine Veränderung, in der Niere ein Anstieg und im Ileum eine Reduktion der RNA-Expression von vdr dargestellt werden (CHOW et al. 2011).
Die RNA-Expression vom Kernrezeptor Pxr zeigte sich durch die Applikation von 1,25- (OH)2D3 in der Niere und durch die Supplementierung mit 25-OHD3 im Jejunum signifikant erhöht (WILKENS et al. 2016). Zu Ratten ist in der Literatur bisher nichts bekannt.
Tabelle 3: Übersicht über die RNA-Expression von Schaf und Ratte
-: RNA-Expression hat sich durch die Behandlung nicht verändert; ↑ bzw. ↓: RNA-Expression ist durch die Behandlung gestiegen bzw. gesunken; /: RNA-Expression wurde nicht untersucht Schaf: Behandlung mit 0,5 µg/kg KG 1,25-(OH)2D3 einmalig intraperitoneal (WILKENS et al. 2016)
cyp3a24 mdr1 vdr pxr
Niere ↑ - - ↑
Jejunum ↑ - - -
Ratte: Behandlung mit 0,27, 0,53 und 1,07 µg/kg KG 1,25-(OH)2D3 für vier Tage intraperitoneal (CHOW et al. 2009; CHOW et al. 2010)
Ratte: Behandlung mit 2,0
und
2,67 µg/kg KG 1,25-(OH)2D3 für acht Tage jeden zweiten Tag intraperitoneal (CHOW et al. 2011)cyp3a9 mdr1a vdr oat3
2,0 2,67 2,0 2,67 2,0 2,67 2,0 2,67
Leber - ↑ - - - - / /
Niere ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ - -
Ileum - ↑ - - ↓ ↓ / /
Schaf: Behandlung mit 6 µg/kg KG 25-OHD3 tgl. für zehn Tage oral (WILKENS et al.
2016)
cyp3a24 mdr1 vdr pxr
Leber - - - -
Niere - - - -
Jejunum - ↓ - ↑
cyp3a9 mdr1a vdr oat3
0,27 0,53 1,07 0,27 0,53 1,07 0,27 0,53 1,07 0,27 0,53 1,07
Leber - - - ↑ - ↑ - - ↑ / / /
Niere - ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ - - ↓
Ileum - - - ↓ ↓ ↓
2.3.3 Untersuchungen an Zellkultur-Systemen
Um den intestinalen Transport sowohl von endogenen als auch exogenen Stoffen zu untersuchen, werden Zelllinien aus dem Verdauungstrakt eingesetzt, da diese verschiedene Transporter z. B. P-gp exprimieren (GOTO et al. 2003). Die Zelllinien eignen sich aber nicht für Untersuchungen zur Bioverfügbarkeit oder der Interaktionen zwischen Medikamenten, da CYP3A4, welches ca. 50 % aller in der Humanmedizin eingesetzten Medikamente metabolisiert, nicht exprimiert wird (AIBA et al. 2005a).
Werden die humane Coloncarcinoma-Zelllinie 2 (Caco-2) und die humane Colon- Adenocarcinoma-Zelllinie (LS180) jedoch mit 1,25-(OH)2D3 behandelt, kann eine Expression von CYP3A auf RNA- und Protein-Ebene gezeigt werden (SCHMIEDLIN- REN et al. 1997; SCHMIEDLIN-REN et al. 2001; FAN et al. 2009). Zudem wurde eine Steigerung der MDR1-RNA-Expression und der P-gp-Protein-Expression in der Caco- 2-Zelllinie nachgewiesen (FAN et al. 2009). In der HepG2-Zelllinie (Ursprung Leber) konnten SCHMIEDLIN-REN et al. (2001) und DROCOURT et al. (2002) keinen bzw.
nur einen schwachen Anstieg der CYP3A4-RNA-Expression darstellen.
THUMMEL et al. (2001) konnten zeigen, dass in Caco-2-Zellen, die kein PXR exprimieren, die Induktion der CYP3A-Expression durch 1,25-(OH)2D3 über den VDR erfolgte. Mittlerweile sind VDREs in den Genen von cyp3a9 und vom humanen Mdr1 nachgewiesen (ZIEROLD et al. 2006; M. SAEKI et al. 2008). In der humanen Hepatoma Zelllinie (HuH7) konnte zudem dargestellt werden, dass hydroxyliertes Vitamin D, nicht aber Vitamin D selbst den PXR aktivieren kann (JACOBS et al. 2005).
2.4 Zielsetzung
Ziel der Arbeit war es, folgende Hypothesen zu bestätigen oder zu widerlegen:
o Ratten reagieren auf Vitamin-D-Metaboliten anders als Schafe: Die an männlichen Sprague Dawley® Ratten erzielten Ergebnisse (CHOW et al. 2010;
CHOW et al. 2011) können auch mit der geringeren Dosierung von 0,5 µg
kg/KG 1,25-(OH)2D3 bei weiblichen Sprague Dawley® Ratten reproduziert werden.
o Die Unterschiede zwischen den bisher vorliegenden Arbeiten an Schafen und Ratten sind auf die genaue Dosierung und Applikationsroute zurückzuführen:
Die an weiblichen Schafen erzielten Ergebnisse von WILKENS et al. (2016) können mit der gleichen Dosierung von 0,5 µg/kg KG 1,25-(OH)2D3 und 6 µg/kg KG 25-OHD3 auch bei weiblichen Ratten gezeigt werden.
o Die einmalige, intramuskuläre Applikation von Vitamin D3 in einer Dosierung von 300 µg/kg KG führt zu ähnlich hohen Plasmakonzentrationen von 25-OHD3
wie die orale Behandlung mit 6 µg/kg KG 25-OHD3 und wirkt sich gleichsinnig auf die Genexpression der Tiere aus.
Der Vitamin-D-Stoffwechsel, die beteiligten Enzyme und Calcium-Transportproteine wurden anhand analytischer Methoden (25-OHD3, 1,25-(OH)2D2/3, 24,25-OHD3, Calcium im Serum) und auf Transkriptionsebene durch quantitative RT-PCR untersucht (cyp24a1, cyp27b1, vdr, trpv6, calbindin-D9K, pmca1b). Dadurch sollte auch der Erfolg der Behandlung deutlich dargestellt werden. Ausgewählte Enzyme (cyp3a9, cyp3a18, cyp3a62), Transporter (mdr1a, mdr1b, oat3) und ein Kernrezeptor (pxr), die bei der Metabolisierung und Elimination von Xenobiotika eine wichtige Rolle spielen, wurden auf Transkriptionsebene durch quantitative RT-PCR und zum Teil auf Translationsebene durch das Western-Blot-Verfahren und funktionell durch Ussing- Kammer-Versuche untersucht.
3 Material und Methoden
3.1 Behandlung der Tiere und Probengewinnung
Es wurden 48 weibliche Sprague Dawley® Ratten (Janvier Labs) im Alter von 21 Tagen randomisiert paarweise nach den Vorgaben der Tierschutz-Versuchstierverordnung gehalten. Die analytischen Bestandteile und Zusatzstoffe des Alleinfuttermittels (ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Deutschland) sind in Anhang A gelistet.
Nach einer Eingewöhnungsphase sah das Behandlungsprotokoll wie folgt aus:
Tabelle 4: Behandlungsprotokoll
Versuchsgruppe Placebogruppe
1,25-(OH)2D3 (n = 9)
(Decostriol® 1 µg/ml, mibe GmbH Arzneimittel), 0,5 µg/kg KG
intraperitoneal 12 h vor dem Töten verdünnt mit Natriumchlorid-Lösung
isotonische Natriumchlorid-Lösung (n = 7)
(B. Braun Melsungen AG),
intraperitoneal 12 h vor dem Töten
25-OHD3 (n = 8)
(Dedrogyl® 0,15 mg/ml, Desma GmbH), 6 µg/kg KG oral tgl. zehn Tage vor dem Töten verdünnt mit Leitungswasser
Propylenglykol (n = 8)
(Wirtschaftsgenossenschaft deutscher Tierärzte eG) oral tgl. zehn Tage vor dem Töten verdünnt mit Leitungswasser Vitamin D3 (n = 8)
(D3-Vicotrat® 2,5 mg/ml, Heyl Chemisch- pharmazeutische Fabrik GmbH & Co.
KG), 300 µg/kg KG intramuskulär einmalig zehn Tage vor dem Töten verdünnt mit Natriumchlorid-Lösung
isotonische Natriumchlorid-Lösung (n = 8)
(B. Braun Melsungen AG),
intramuskulär einmalig zehn Tage vor dem Töten
Das Behandlungsprotokoll für 1,25-(OH)2D3 und 25-OHD3 wurde aus einer Studie an Schafen entnommen (WILKENS et al. 2016). Die Dosierung für Vitamin D3 entspricht dem Protokoll der Prävention der Hypocalcämie beim Rind.
Fehlinjektionen in z. B. Leber oder Caecum sind bei der intraperitonealen Injektion möglich (CORIA-AVILA et al. 2007), sodass die intraperitoneal mit 1,25-(OH)2D3
behandelte Gruppe aus neun Tieren und die dazugehörige Placebogruppe aus sieben Tieren bestand.
Die Tötung der Ratten erfolgte durch eine Kohlenstoffdioxid-Inhalation (6 l/min und 50 bar in einem Makrolonkäfig Typ III) mit anschließendem Blutentzug durch Herzpunktion. Die Herzpunktion erfolgte bei überstreckter Rückenlage von caudal nach cranial am Processus xiphoideus mit einer Sterican® Einmalkanüle (1,2 x 50 mm) (B. Braun Melsungen AG) und einer Serum-Monovette (Sarstedt AG und Co).
Nach dem Töten des Tieres wurden ein Bauchschnitt in der Linea alba und Entlastungschnitte entlang des Rippenbogens durchgeführt. Zuerst erfolgte die Entnahme des Magen-Darm-Traktes. Das Ileum wurde anhand der Plica ileocaecalis lokalisiert, entnommen und im Ussing-Kammer-Versuch weiterverwendet. Das Jejunum mit der Länge von ca. 90 bis 135 cm beginnt ca. 10 cm nach dem Pylorus (VDOVIAKOVA et al. 2016). Es wurden jeweils 6 cm vom proximalen und distalen Jejunum entnommen und in einer 0,9 %igen Natriumchlorid-Lösung gekühlt. Die Darmanteile wurden an der mesenterialen Seite eröffnet und mit der eisgekühlten Natriumchlorid-Lösung gespült, um anhaftenden Darminhalt zu lösen. Die Tunica serosa und Tunica muscularis wurden mit Hilfe eines Objektträgers entfernt, sodass nur die Tunica mucosa vorlag. Die Nieren wurden entnommen, das Nierenfett und die Nierenkapseln entfernt und wie die Leber in kleine Gewebestücke (ca. 3 x 3 x 3 mm) geteilt und in eisgekühlter Natriumchlorid-Lösung gekühlt. Die Tunica mucosa von den zwei Darmabschnitten, die Leber- und die Nierenstücke wurden durch Flüssigstickstoff schockgefroren und in 2 ml Kryoröhrchen (Omnilab-Laborzentrum GmbH & Co.) bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
3.2 Untersuchungen im Serum
Für die analytischen Methoden wurde das Vollblut nach der Entnahme für 20 min zur
für 15 min zu zentrifugieren (RC 5C Sorvall® Instruments, DuPont). Das Serum wurde aliquotiert und bei -20 °C eingefroren.
3.2.1 25-OHD3-, 1,25-(OH)2D2/3 und 24,25-OHD3-Konzentration im Serum
Die 25-OHD3-Konzentration im Serum (frei und VDBP-gebunden) wurde durch das 25(OH)-Vitamin D direct day ELISA Kit (Immundiagnostik AG) ermittelt. Die Sensitivität des kompetitiven ELISA-Kits liegt sowohl für 25-OHD3, als auch für 24,25-OHD3, bei 100 %. Die Auswertung erfolgte mit der 4-Parameter Funktion nach Marquardt durch die Daten Analyse Software Magellan™ V 7.1 (Tecan Deutschland GmbH).
Die Konzentrationen von 1,25-(OH)2D2, 1,25-(OH)2D3 und 24,25-OHD3 wurde mittels LC-MS/MS (Flüssigkeitschromatographie/Tandem-Massenspektrometrie) durch die Firma Immundiagnostik AG ermittelt.
3.2.2 Gesamtcalcium-Konzentration im Serum
Die Konzentration des Gesamtcalciums im Serum wurde durch die o-Kresolphtalein- Komplexon-Methode bestimmt (RAY SARKAR u. CHAUHAN 1967). Durch die Bindung von Calcium und o-Kresolphtalein-Komplexon im alkalischen Bereich entsteht ein violetter Komplex. Die Farbintensität ist proportional zur Calciumkonzentration.
Zu einer 500 µl Farbstofflösung (0,16 mmol·l-1 o-Kresolphtalein-Komplexon, 6,89 mmol·l-1 8-Hydroxychinolin in 0,06 mmol·l-1 HCl) wurden 500 µl 2-Amino-2- Methylpropanol-Lösung (3,5 mmol·l-1, pH 10,8) und 25 µl Serum bzw. Precinorm (Roche Diagnostics GmbH) als Kontrolle oder 25 µl einer Standardlösung (0,5 mmol/l, 1,5 mmol/l, 2 mmol/l, 3 mmol/l) hinzugegeben. Nach einer 10-minütigen Inkubationszeit wurde die Extinktion im Doppelansatz im DU® 640 Spectrophotometer (Beckman Coulter GmbH) bei einer Wellenlänge von 570 nm gemessen.
Die Berechnung der Gesamtcalcium-Konzentration erfolgte durch die Konzentrationswerte der Standardreihe und den zuvor ermittelten Extinktionsdaten.
3.3 RNA-Expression
3.3.1 RNA-Isolation und cDNA-Synthese
Die RNA-Isolation und die cDNA-Synthese sind die ersten Schritte, um die Expressionsrate eines bestimmten Gens in einem Organ mittels quantitativer Reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion (quantitativer RT-PCR) untersuchen zu können.
Die RNA aus Leber, Niere, proximalem und distalem Jejunum wurde durch das RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN GmbH) nach Herstellerangaben isoliert. Die Konzentration der RNA wurde durch das Bio Photometer 6131 (Bio-Rad Laboratories GmbH) ermittelt. Es wurden 200 ng RNA für die cDNA-Synthese eingesetzt und der restliche Anteil wurde bei -80 °C eingefroren.
Mit dem TaqMan® Reverse Transcription Reagents Kit (Thermo Fisher Scientific, Inc.) wurde ein Mastermix für die Synthese der cDNA hergestellt (Tabelle 5). Zum Mastermix wurden 200 ng RNA mit Wasser für Injektionszwecke (AmpuWa®, Fresenius Kabi Deutschland GmbH) auf ein Volumen von 9,6 µl hinzugefügt.
Tabelle 5: Mastermix für cDNA-Synthese
Gebrauchslösungen Konzentration im
Reaktionsansatz
Volumen im Reaktionsansatz
10 x RT-Puffer 1-fach 2,5 µl
25 mM MgCl2 5,5 mM 5,5 µl
10 mM dNTP Mix 2 mM 5 µl
50 µM Oligo (dT) Primern 1,25 µM 0,625 µl 50 µM Random Hexamer Primern 1,25 µM 0,625 µl 20 U/µl RNase Inhibitor 0,4 U/µl 0,5 µl 50 U/µl MultiScribeTM RT 1,36 U/µl 0,68 µl
