Aus der Klinik für Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie (Prof. Dr. med. Dr. med. dent. H. Schliephake) im Zentrum Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde der Medizinischen Fakultät der Universität Göttingen
Expression von SDF-1/CXCL12 und CXCR4 in der sequenziellen
DMBA-induzierten Karzinogenese des Hamsters
INAUGURAL- DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades
für Zahnheilkunde
der Medizinischen Fakultät der Georg-August-Universität zu Göttingen
vorgelegt von Eva Nadenau
aus Aachen
Göttingen 2014
D e k a n: Prof. Dr. rer. nat. H.K. Kroemer
I. Berichterstatter/-in: Prof. Dr. Dr. Henning Schliephake II. Berichterstatter/-in: Prof. Dr. Nicolai Miosge
III. Berichterstatter/-in: Prof. Dr. Rainer Mausberg
Tag der mündlichen Prüfung: 16.03.2015
1 Einleitung 11 1.1 Das orale Plattenepithelkarzinom 11
1.1.1 Ursachen und Risikofaktoren 11
1.1.2 Präkanzerosen 12
1.1.3 Klinische Tumorklassifikation und Stadieneinteilung 15
1.2 Metastasierung 18
1.2.1 Pathogenese 18
1.3 Chemokine 21
1.3.1 Allgemeines 21
1.3.2 Der Chemokinrezeptor CXCR4 24
1.3.3 Der Chemokinligand CXCL12 26
1.3.4 Organspezifische Metastasierung 29
1.4 Fragestellung 30
2 Material und Methoden 31
2.1 Tierversuchsantrag 31
2.2 Versuchstiere 31
2.3 Tierversuch 31
2.4 Probenentnahme 33
2.4.1 Einbettung des Gewebes 33
2.4.2 Anfertigung der Schnitte 34
2.4.3 Antikörper 35
2.4.4 Entparaffinierung und Rehydrierung der Schnitte 35
2.4.5 Demaskierung der Präparate 35
2.4.6 Protokoll für den immunhistochemischen Nachweis von CXCR4 und
CXCL12 36
2.4.7 Gegenfärbung 37
2.4.8 Dehydrierung und Eindecken der Präparate 38
2.5 Dokumentation der Ergebnisse 38
2.5.1 Semiquantitative Auswertung/ Randomisierung 39
2.5.2 Karzinogenitätsprüfung 39
2.5.3 Auswertung CXCL12 und CXCR4 39
2.5.4 Statistische Auswertung 40
2.6 Verwendete Lösungen, Chemikalien und Geräte 40
2.6.1 Verwendete Lösungen 40
2.6.3 Verwendete Geräte und Materialien 41
3 Ergebnisse 43
3.1 Makroskopische Ergebnisse 43
3.2 Histologische Ergebnisse 44
3.3 Auswertung CXCL12 und CXCR4 46
3.3.1 CXCR4 Zellkern 46
3.3.2 CXCL12 Zellkern 47
3.3.3 CXCR4 Zytoplasma 48
3.3.4 CXCL12 Zytoplasma 49
4 Diskussion 50
4.1 Diskussion der Methode 50
4.1.1 Das Tiermodell 50
4.1.2 Die Immunhistochemie 53
4.2 Diskussion der Ergebnisse 53
4.3 Zusammenfassung 57
5 Literaturverzeichnis 59
°C Grad Celcius
A. Arteria
A. dest. Aqua destillata
Abb. Abbildung
AJCC American Joint Committee of Cancer
CD Unterscheidungsgruppe
(cluster of differentiation)
CO2 Kohlendioxid
CXCL12 chemokine (C-X-C motif)
ligand 12
CXCR4 C-X-C chemokine receptor 4
DAB Diaminobenzidin
DAG Diacylglycerol
DMBA 9,10 Dimethyl-1,2 benzanthracen
DNA Desoxyribonukleinsäure
ECM extracellular matrix
EGFR epidermal growth factor receptor
et al. und andere ( et alii/ aliae)
FAK focal adhesion kinase
HNSCC head and neck squamous cell
HPV humanes Papillomavirus
IL Interleukin
IP3 Inositoltriphosphat
kDa Kilo- Dalton
LESTR Leukocyte-derived seven
M. Musculus
MAPK Mitogen- aktivierte Proteinkinase-
Kaskade
mDC myeloische dendritische Zellen
min Minute/n
MMP Matrixmetalloproteinase
Nm non metastatic
NPY-Rezeptor neuropeptide Y receptor
OLP oraler Lichen ruber Planus
pDC plasmozytäre dendritische Zellen
PI3K Phosphoinosid 3 Kinase
PKC Proteinkinase C
PLC Phospholipase C
SDF stromal cell derived factor
SNP single nucleotide polymorphism
SIL squamous intraepithelial lesion
SIN squamous intraepithelial neoplasia
TNF Tumornekrosefaktor
TTBS Tris- Puffer- Saline mit Tween
UICC Union internationale contre le cancer
VEGF vascular endothelial growth factor
WHO World Health Organisation
Tab. 1:
Histologisches Klassifikationsschema Tab. 2:
T-Klassifikation (Primärtumor) UICC 2010 Tab. 3:
N-Klassifikation (regionale Lymphknoten) UICC 2010 Tab. 4:
M-Klassifikation (Fernmetastasen) UICC 2010 Tab. 5:
Stadieneinteilung (Grundlage UICC 2010) Tab. 6:
Bekannte molekulare Mediatoren der Metastasierung bei HNSCC Tab. 7:
Struktur und Bezeichnung der Chemokine Tab. 8:
Chemokinrezeptoren und ihre Liganden Tab. 9:
Behandlungsplan Tab. 10:
Protokoll für die Einbettung der Gewebeproben Tab. 11:
Entparaffinierung Tab. 12:
Demaskierung Tab. 13:
Protokoll CXCR4 Tab. 14:
Protokoll CXCL12 Tab. 15:
Dehydrierung
Grading Tab. 17:
Grading histologische Auswertung Tab. 18:
Färbegrade Tab. 19:
Vergleich der Eigenschaften zwischen Hamster- und Kaninchenmodell bei induzierter Karzinogenese
Abb. 1:
Metastatische Kaskade Abb. 2:
A schematic of the CXCL12/CXCR4 intracellular signal transduction pathways Abb. 3:
Multiple modes of actions are implicated in CXCL12 mediated tumor biology Abb. 4:
Bepinselung der Wangentasche Abb. 5:
Wangentaschenschleimhaut nach 10- wöchiger DMBA Applikation Abb. 6:
Wangentaschenschleimhaut nach 14- wöchiger DMBA Applikation Bepinselung der rechten Wangentasche mit DMBA-Lösung
Abb. 7:
Wangentaschenschleimhaut nach 14- wöchiger DMBA Applikation und anschließendem 5- wöchigen Tumorwachstum.
Abb. 8:
Expression des Proteins CXCR4 in den verschiedenen Stadien der Tumorentstehung, zelluläre Lokalisation – Kern
Abb. 9:
Expression des Proteins CXCL12 in den verschiedenen Stadien der Tumorentstehung, zelluläre Lokalisation – Kern
Abb. 10:
Expression des Proteins CXCR4 in den verschiedenen Stadien der Tumorentstehung, zelluläre Lokalisation – Plasma
Abb. 11:
Expression des Proteins CXCL12 in den verschiedenen Stadien der Tumorentstehung, zelluläre Lokalisation – Plasma
Abb. 12:
Gesunde Mukosa, Expression CXCR4
Gesunde Mukosa, Expression CXCL12 Abb. 14:
Dysplasie, Expression CXCL12
1 Einleitung
Die Inzidenzrate maligner Tumoren im Bereich der Mund-, Kiefer- und Gesichtsregion zeigt einen deutlichen Anstieg in den letzten Jahren. Das Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle ist dabei mit über 90% die häufigste maligne Neubildung. Die frühzeitige Diagnose und Behandlung ist enorm wichtig, da es zu Beeinträchtigungen physiologischer Funktionen wie Schluckakt und Sprachbildung kommt. Im fortgeschrittenen Tumorstadium ist die Therapie deutlich limitiert und die Prognose verschlechtert sich signifikant (WEIDAUER & MAIER 1992), weshalb nach Parametern gesucht wird, um die Therapie zu verbessern.
1.1 Das orale Plattenepithelkarzinom
1.1.1 Ursachen und Risikofaktoren
Bei malignen Entartungen des oberen Aerodigestivtraktes handelt es sich nach dem gegenwärtigen Stand der Forschung um ein multifaktorielles Geschehen. Es ist seit langem bekannt, dass zwischen dem Genuss von Tabak und Alkohol und dem Auftreten des oralen Plattenepithelkarzinoms ein signifikanter Zusammenhang besteht (MILLER 1974; WYNDER &
STELLMANN 1977). Beim Tabakkonsum spielt die Applikationsart eine entscheidende Rolle. So ist die Wahrscheinlichkeit bei Pfeifen- und Zigarrenrauchern höher, ein orales Plattenepithelkarzinom zu entwickeln, als bei Konsumenten der herkömmlichen Filterzigarette. Hierbei ist nicht nur eine bestimmte Chemikalie des Tabakrauches entscheidend, sondern der Risiko- erhöhende Effekt entsteht erst aus der Zusammensetzung verschiedener Inhaltsstoffe (SHIELDS 2000). Um ihren karzinogenen Effekt zu entfalten, benötigen viele Inhaltsstoffe eine metabolische Aktivität durch bestimmte Enzyme (HECHT 1999).
In den Industrienationen sind Nikotin- und Alkoholabusus anerkannte unabhängige Risikofaktoren (TALAMINI et al. 1990, WYNDER et al. 1957).
Hochprozentiger Alkohol zählt zu den Kofaktoren der malignen Transformation, gehört aber nicht zu den kanzerogenen Substanzen im engeren Sinne, inhibiert jedoch den DNA- Reparaturmechanismus. (HSU und FURLONG1991).
Die häufige simultane Abhängigkeit von beiden Noxen führt jedoch zu einer Potenzierung des jeweiligen Erkrankungsrisikos um das 13-Fache (BLOT et al. 1988; McCOY und WYNDER 1979; CASTELLSAGUÉ et al. 2004).
Damit haben Tabak und Alkohol einen synergistischen Effekt (REICHART 2001). Des Weiteren wird diskutiert, ob die Infektion mit dem Humanen Papilloma-Virus (HPV) zur Entstehung von oralen Präkanzerosen oder Plattenepithelkarzinomen beiträgt. Hier stehen HPV 16 und 18 im wissenschaftlichen Fokus. Auf Grund großer Variabilität derzeitiger Forschungsergebnisse bleibt die Rolle HPV – assoziierter oraler prämaligner Läsionen jedoch umstritten (HA und CALIFANO 2004). In Indien und Südostasien zählt das Kauen von Arekanüssen der Betelnusspalme zu den Hauptursachen für die Entwicklung eines oralen Plattenepithelkarzinoms.
Auch schlechte Mundhygiene stellt ein Risiko für die Entstehung von Mundhöhlentumoren dar. So sind Patienten mit chronischer Parodontitis gegenüber Patienten mit gesundem Parodont öfter von
Plattenepithelkarzinomen betroffen. Zwar ist der Mechanismus, wie bakterielle Infektionen die Tumorentstehung begünstigen, nicht gänzlich geklärt, aber man vermutet, dass die Bakterien eine Zellproliferation induzieren, die die Apoptose inhibieren und als Tumorpromotoren agieren (MEURMAN 2010).
Weiterhin konnte festgestellt werden, dass sich eine gesunde und vitaminreiche Ernährung protektiv auf die Mundschleimhaut auswirkt.
Eine ca. 50%- ige Risikoverminderung kann daher unter den Menschen beobachtet werden, die regelmäßig frisches Obst und Gemüse verzehren (WARNAKULASURIYA 2009).
1.1.2 Präkanzerosen
Plattenepithelkarzinome der Mundschleimhaut können sich direkt auf gesunder Mundhöhlenschleimhaut entwickeln. Es ist jedoch möglich, dass
sich vorher Mundschleimhautveränderungen klinisch diagnostizieren lassen, die das Potential zur malignen Entartung besitzen. Diese lassen sich in obligate und fakultative Präkanzerosen einteilen, je nachdem wie hoch die Wahrscheinlichkeit zur malignen Transformation ist.
Zu den fakultativen Präkanzerosen gehört unter anderem die Leukoplakie.
Die Leukolplakie (Keratinisierungsstörung mit zellulären und epithelialen Atypien) ist laut klinischer Definition der WHO ein weißer, nicht abwischbarer Fleck der Schleimhaut, der keiner anderen Krankheit weder klinisch noch histologisch zugeordnet werden kann(PINDBORG et al. 1997).
Sie entsteht durch eine Verhornungsstörung des Mundschleimhautepithels unter Ausbildung eines Stratum Granulosum und einer kompakten Orthohyperkeratose (ALTMEYER 2007). Orale Leukoplakien können isoliert oder multiple auftreten (REICHART 2007).
Bei der Candida- infizierten oralen Leukoplakie scheint eine höhere Entartungsrate vorzuliegen (REICHART 2007). Es ist jedoch bis heute unklar, ob die Candidainfektion die Ursache der Leukoplakie ist oder ob es sich um eine Superinfektion einer präexistenten Schleimhautveränderung handelt.
Die orale Leukoplakie kann zur Abheilung gebracht werden, indem prä- disponierende Faktoren wie Alkohol und Tabak ausgeschaltet werden.
(NAPIER und SPEIGHT 2008).
Eine weitere fakultative Präkanzerose stellt der orale Lichen ruber planus (OLP) dar. Er ist gekennzeichnet durch weißliche, feine linien- bzw.
netzförmige oder farnartige Veränderungen des Epithels. Diese Verän- derungen werden auch als „Wickhamstreifen“ bezeichnet und können von einem erythematösen Randsaum umgeben sein. Charakteristisch für den OLP sind Hyperkeratosen und Hohlraumbildungen mit apoptotischen Keratinozyten (MATILLA und SYRJÄNEN 2010).
Die maligne Entartung des OLP wird in der Literatur kontrovers diskutiert.
Mattsson und Larsson beschrieben eine positive Korrelation zwischen dem Vorhandensein eines OLP und der Entwicklung oraler Tumoren (MATTSSON et al. 2002; LARSSON und WARFVINGE 2003). Ramos-e-Silva et al.
publizierten 2010, dass das Risiko der malignen Entartung auf dem Boden eines OLP um 0,5%-8% erhöht ist. Im Gegensatz zu den fakultativen
Präkanzerosen ist die Wahrscheinlichkeit der malignen Entartung der obligaten Präkanzerosen um ein Vielfaches erhöht. Als obligate Präkanzerose entwickelt sich die orale Lentigo maligna nach 5-15 Jahren zu einem oralen malignen Melanom (SEBASTIAN und STEIN 2000). Als zweite obligate Präkanzerose wird die Erythroplakie oder Erythroplasie Queyrat beschrieben, eine Standortvariante des Morbus Bowen bzw. Sonderform des oralen Plattenepithelkarzinoms in situ (RIEDE UND SCHÄFER 2004).
Die Erythroplakie stellt sich makroskopisch durch einen dunkelroten, scharf begrenzten Schleimhautfleck dar, der nicht abwischbar ist und klinisch keiner anderen Krankheit zugeordnet werden kann (BURKHARDT und MAERKER 1981). Erythroplakien sind wesentlich seltener als Leukoplakien. Die Entartungsrate liegt 50% höher (HORCH 2007; BURKHARDT und MAERKER 1981).
Die WHO- Klassifikation von 2005 unterscheidet die oralen Präkanzerosen rein histologisch in unterschiedliche Dysplasiegrade:
2005 WHO- Classification
Squamous intraepithelial Neoplasia (SIN)
Ljubljana Classification Squamous Intraepithelial Lesions (SIL)
squamous cell hyperplasia
/ squamous cell (simple)
hyperplasia
mild dysplasia SIN 1 basal/ parabasal cell
hyperplasia
moderate dysplasia SIN 2 atypical hyperplasia
severe dysplasia SIN3 atypical hyperplasia
carcinoma in situ SIN3 carcinoma in situ
Tabelle 1: Histologisches Klassifikationsschema, modifiziert nach GALE et al. 2005
Zu einem Karzinom führt nur ein geringer Teil der epithelialen Dysplasien.
Nach neuestem Stand der Forschung entwickelt sich aus 8% der Läsionen, die als dysplastisch diagnostiziert waren, innerhalb von 6-131 Monaten ein
Karzinom (BRADLEY et al. 2010).
Bradley konnte feststellen, dass 45% dieser Dysplasien durch eine abnorme DNA gekennzeichnet waren. Es scheint also einen Zusammenhang zwischen der veränderten DNA im dysplastischen Gewebe und der Entartung zum Karzinom zu geben.
1.1.3 Klinische Tumorklassifikation und Stadieneinteilung
TNM- Klassifikation für das Mundhöhlen- und Lippenkarzinom
Das TNM- System dient der genauen Stadieneinteilung maligner Tumoren. Es wurde von dem Franzosen Pierre Denoix in den Jahren 1943–1952 entwickelt und wird seit 1950 in mehrfach aktualisierten Fassungen von der Union International Contré le Cancer (UICC) weitergeführt.
In diesem System, wird das Stadium einer Tumorerkrankung durch drei Hauptdeterminanten beschrieben:
T: Größe des Primärtumors
N: Befund der regionären Lymphknoten M: Befund von Fernmetastasen
Weiter untergliedert wird die TNM-Klassifikation noch in
cTNM, wobei das “c” für den englischen Begriff clinical steht und den klinischen Untersuchungsbefund beschreibt und der Wahl und Beurteilung der Therapieverfahren dient
sowie
pTNM, wobei das “p” für pathological steht.
Enthalten sind Ergebnisse der histopathologischen Untersuchung des Tumorgewebes (DEUTSCHES KREBSFORSCHUNGSZENTRUM 2010; GOSPODAROWICZ et al. 2004), welche zur Abschätzung der
Prognose und der Beurteilung, ob eine adjuvante Radio- und/oder Chemotherapie nach definitiver Chirurgie genutzt werden.
T-Klassifikation
Tx Voraussetzung zur Beurteilung des Primärtumors liegt nicht vor T0 kein Primärtumor nachweisbar
Tis Carcinoma in situ
T1 Tumordurchmesser maximal 2 cm
T2 Tumordurchmesser maximal größer 2cm und kleiner/ gleich 4 cm T3 Tumordurchmesser größer 4 cm
T4a (Lippenkarzinom) Tumor infiltriert kortikalen Knochen, den N.
alveolares inferior, den Mundboden oder die Haut (Kinn oder Nase) (Mundhöhlenkarzinom) Tumor infiltriert kortikalen Knochen, tiefe/
extrinsische Muskulatur der Zunge (M. genioglossus, M. hyoglossus, M. palatoglossus und M. styloglossus), Kieferhöhle oder Gesichtshaut T4b (Lippen- und Mundhöhlenkarzinom) Tumor infiltriert Spatium
masticatorium, Processus pterygoideus oder Schädelbasis oder umschließt die A. carotis interna
Tabelle 2: T-Klassifikation (Primärtumor) UICC 2010
N-Klassifikation
NX regionäre Lymphknoten sind nicht beurteilbar N0 keine regionalen Lymphknotenmetastasen
N1 solitäre Metastase in einem ipsilateralen Lymphknoten, größer 3cm aber kleiner 6cm Durchmesser
N2a solitäre Metastase in einem ipsilateralen Lymphknoten, 3-6 cm Durchmesser
N2b multiple Metastasen in ipsilateralem Lymphknoten, wobei keine größer ist als maximal 6 cm im Durchmesser
N2c Metastasen bilateral oder kontralateral, wobei keine größer ist als maximal 6 cm im Durchmesser
N3 mindestens eine Metastasen im Lymphknoten größer als 6 cm im Durchmesser
Tabelle 3: N-Klassifikation (regionale Lymphknoten) UICC 2010
M-Klassifikation
Mx Fernmetastasen können nicht beurteilt werden M0 Keine Fernmetastasen nachweisbar
M1 Fernmetastasen nachweisbar
Tabelle 4: M-Klassifikation (Fernmetastasen) UICC 2010
Stadieneinteilung
Da sich durch die TNM-Klassifikation im Fall des oralen Plattenepithel- karzinoms eine große Breite an möglichen Kombinationen ergibt, wurden durch die UICC und American Joint Committee of Cancer (AJCC) vier Hauptstadien definiert, die bei Patienten mit verschiedener TNM-Klassifikation vergleichbar weit fortgeschrittene Tumorerkrankungen zusammenfasst.
Stadium T N M
0 is 0 0
I 1 0 0
II 2 0 0
III 1-2 1 0
3 0-1 0
Stadium T N M
IVa 1-3 2 0
4a 0-2 0
IVb 0-4b 3 0
4b 0-3 0
IVc 0-4b 0-3 1
Tabelle 5: Stadieneinteilung (Grundlage UICC 2010)
1.2 Metastasierung
Der Begriff Metastasierung kommt aus dem griechischen Metastasae (gr. µετάσταση, aus µετα meta ‚weg‘ und στάση stáse ‚Stelle‘, ‚Haltung‘, ‚Ort‘, also etwa „Übersiedelung an einen anderen Ort“) und wird übersetzt als „die Übersiedelung“. Man versteht darunter die Ausbildung von Tochtergeschwülsten aus Zellen des Primärtumors. 90% der Patienten mit bösartigen Erkrankungen versterben in Folge der Metastasierung.
Metastasierung stellt somit das zentrale Merkmal der Bösartigkeit dar (WAGENER & MÜLLER 2010).
1.2.1 Pathogenese
Die Metastasierung stellt einen komplexen mehrstufigen Prozess dar, der auch als Metastasierungskaskade bezeichnet wird. Er setzt sich aus folgenden konsekutiv ablaufenden Prozessen zusammen (FIDLER 2003).
• Lösung der individuellen Tumorzelle aus dem Gewebeverband des Primärtumors
• Durchbrechung der Basalmembran
• Intravasation, Eindringen in das Gefäßbett bzw. Lymphgefäßsystem
• Adaptation an den Strömungsdruck innerhalb der Blutbahn
• Anheftung an das Gefäßendothel
• Extravasation, Einnistung und Wachstum in einem fremden Organsystem ( HIDDEMANN 2010)
Abbildung 1: Metastatische Kaskade
Der Prozess der Metastasierung beginnt mit dem Abtrennen einer individuellen Tumorzelle vom Primärtumor. Die Progression der Metastasierung setzt voraus, dass sich die Tumorzelle an die Basalmembran anheftet und daraufhin in die extrazelluläre Matrix migrieren kann.
Anschließend folgt die Intravasation in das Gefäß- oder Lymphsystem und die Ausstreuung der Tumorzelle. Um eine solide Metastase im Zielorgan bilden zu können, muss die Tumorzelle das Gefäß- Lymphsystem verlassen. Anschließend kann sie sich im fremden Organ einnisten. In Anlehnung an Howell und Grandis 2005. Grafik: ieQ- health.
Nach Extravasation im Zielorgan sind invasive Kapazität, Proliferation und Angiogenese Schlüsselprozesse, die zur Entstehung eines metastatischen Focus nötig sind (HOWELL und GRANDIS 2005; BOGENRIEDER und HERLYN 2003; CHAMBERS et al. 2001).
An dem Prozess der Metastasierung sind eine Vielzahl von Faktoren wie Proteasen, Wachstumsfaktoren, Adhäsionsmoleküle, Zytokine und angiogene Moleküle beteiligt (Tabelle 6). Die genauen molekularen Mechanismen, die zur gerichteten Metastasierung in bestimmte Organe führen, sind jedoch bislang noch nicht eindeutig geklärt.
Molekül Funktion
E-cadherin/ catenin Durch Verlust von E-cadherin/catenin, welches für die Zell-Zell-Adhäsion notwendig ist, kann es zur
Dissoziation der Tumorzellen kommen.
Integrine Zelladhäsion und Signaltransduktion
zwischen Extra- und Intrazellularraum.
Tumorzellmigration.
CD44 Adhäsionsmolekül von
Tumorstammzellen durch welches Zell-Zell- und Zell-Matrix-
Wechselwirkungen entstehen.
Dadurch können dann spezielle Signalkaskaden ausgelöst werden.
Hauptligand Hyaluron.
EGFR Up-Regulation der PLCγ-1, MMP und
FAK, welche die Motilität und Invasion der Tumorzellen fördern.
MMPs Proteolytische Spaltung zur Motilität
und Durchdringen der ECM
PLC gamma-1 Modulation der EGFR- induzierten
Tumorzellmotilität.
FAK Modulation der EGFR- induzierten
Tumorzellmotilität und –adhäsion.
nm23 Geringe Expression des
Antimetastasierungsgens, fördert die Invasion und Metastasierung.
Tabelle 6: Bekannte molekulare Mediatoren der Metastasierung bei HNSCC (modifiziert nach HOWELL und GRANDIS 2005)
1.3 Chemokine
1.3.1 Allgemeines
Die Chemokine sind kleine chemotaktisch wirkende Zytokine.
Die Familie der Chemokine umfasst mehr als 50 (WAGENER UND MÜLLER 2010) strukturell sehr ähnliche sekretorische Proteine mit einer molekularen Größe zwischen sechs und zehn kD (MURPHY et al. 2000). Chemokine lassen sich in vier Familien einteilen, je nach Anzahl der konservierten N- terminalen Cysteinreste und der Anzahl dazwischen liegender Aminosäuren (Tab. 7).
Struktur Bezeichnung
NH2—CXC—C—C--COOH CXC Chemokinfamilie (alpha) NH2—CC—C—C--COOH CC Chemokinfamilie (beta) NH2—C—C—C--COOH C Chemokinfamilie (gamma) NH2—CX3C—C—C--COOH CX3C Chemokinfamilie (delta)
Tabelle 7: Struktur und Bezeichnung der Chemokine
Je nachdem, ob es sich bei dem Chemokin um einen Rezeptor oder um einen Liganden handelt, bekommt die Bezeichnung (CXC oder CC) den jeweiligen Zusatz R (CXCR) oder L (CXCL) (IUIS/WHO Subcommittee on Chemokine Nomenclature 2003).
CXC-Chemokine haben strukturelle Merkmale, wie das aus drei Aminosäuren bestehende ELR-Motiv. ELR-positive CXC-Chemokine gelten als potente Promotoren der Angiogenese, während ELR-negative CXC- Chemokine zumeist eine antiangiogenetische Wirkung besitzen. Des Weiteren lassen sich Chemokine noch in “inflammatorisch“ und “homöostatisch“ klassifizieren, wobei die meisten inflammatorisch sind. Ihre Produktion wird durch Entzündung, Verletzung oder Infektion ausgelöst und lockt Immunzellen an.
Die homöostatischen Chemokine werden regelmäßig produziert und sind für die Kontrolle von gesundem Gewebe verantwortlich (MOSER et al. 2004).
Chemokine sind an unterschiedlichst gerichteten Zellbewegungen beteiligt.
Sie sind verantwortlich für die Rekrutierung und Rezirkulation von Leukozyten, spielen eine wichtige Rolle in der Chemotaxis der Rezirkulation von Lymphozyten(FOXMAN et al. 1997; MÜLLER und LIPP 2003; ROSSI un ZLOTNIK 2000), sind an der Bildung und Differenzierung hämatopoetischer Stammzellen beteiligt (BROXMEYER und KIM 1999; BROXMEYER et al.
1999; MA et al. 1999) und sind verantwortlich für die Migration von Neuronen während der Embryonalentwicklung (LAZARINI et al. 2003) sowie für die Angiogenese und Angiostase (SZEKANECZ und KOCH 2001; TACHIBANA et al. 1998). Chemokine vermitteln ihre Wirkung über Chemokinrezeptoren (Murphy et al. 2000; Neote et al. 1993).
Rezeptor Liganden
CC-Rezeptoren
CCR1 CCL3, CCL5, CCL7, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL23
CCR2 CCL2; CCL7, CCL8, CCL13, CCL16
CCR3 CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL15, CCL16, CCL24, CCL26, CCL28
CCR4 CCL17, CCL22
CCR5 CCL3, CCL4, CCL5, CCL8, CCL11, CCL14, CCL16
CCR6 CCL20
CCR7 CCL19, CCL21
CCR8 CCL1
CCR9 CCL25
CCR10 CCL27, CCL28
Rezeptor Liganden
CCR11 CCL19,CCL21,CCL25
CXC-Rezeptoren
CXCR1 CXCL6, CXCL7, CXCL8
CXCR2 CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8
CXCR3-A CXCL9, CXCL10, CXCL11
CXCR3-B CXCL4, CXCL9, CXCL10, CXCL11
CXCR4 CXCL12
CXCR5 CXCL13
CXCR6 CXCL16
CXCR7 CXCL11, CXCL12
XC-Rezeptoren
XCR1 XCL1, XCL2
CX3C-Rezeptoren
CX3CR1 CX3CL1
Rezeptoren ohne Signalweiterleitung (Decoy-Rezeptoren)
D6 CCL2, CCL3L1, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL14, CCL17, CCL22
DARC/Duffy CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL11, CXCL13, CCL2, CCL7, CCL8, CCL11, CCL13, CCL14, CCL16, CCL17
Tabelle 8: Chemokinrezeptoren und ihre Liganden (Modifiziert nach ALLEN et al. 2007)
1.3.2 Der Chemokinrezeptor CXCR4
Der Chemokinrezeptor CXCR4, auch unter dem Synonym NPY-Rezeptor, LESTR oder Fusin bekannt (Herzog et al. 1993) wurde 1991 erstmalig im Locus coeruleus des Rindes gefunden ( RIMLAND et al. 1991). Zwei Jahre später isolierten Federsppiel das CXCR4 Protein aus der menschlichen Milz (FEDERSPPIEL et al. 1993). Dieser Chemokinrezeptor besitzt in Abgrenzung zu den meisten anderen Chemokinrezeptoren lediglich einen bekannten Liganden, CXCL12.
CXCR4 ist ein aus 352 Aminosäuren bestehender, G-Protein gekoppelter 7- Transmembrandomänen Rezeptor. Die heterotrimeren G-Proteine bestehen aus alpha- und beta Untereinheiten (ZLOTNIK et al. 2000).
CXCR4 ist mit einem heterotrimeren Gi-Komplex verknüpft. Nach Stimulation durch seinen Liganden CXCL12 dissoziiert er in eine Gαi -Untereinheit und in den Gβγ-Komplex. Diese Gαi- Untereinheit löst intrazellulär über die Aktivierung von Ras/MAPK (Mitogen- aktivierte Proteinkinase- Kaskade), PI3K/Akt (Phosphoinosid 3 Kinase) und Proteinkinase C (PKC) Aktivitäten, wie Zellpolarisation, Chemotaxis, Zellproliferation und Zelladhäsion aus. Der freie Gβγ- Komplex führt über die Aktivierung von Proteinlipase C (PLC) zur Bildung von Inositoltriphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DAG) (CHAN et al.
2000; BABCOCK, OWENS 2003). Eine Erhöhung von IP3 führt zur Entleerung von intrazellulären Kalziumspeichern, die für eine Polarisation wandernder Zellen notwendig ist (siehe Abb. 2 ).
Abbildung 2: A schematic of the CXCL12/CXCR4 intracellular signal transduction pathways.
Grafik: ieQ-health
Aus der embryonalen Entwicklung ist bekannt, dass die Kommunikation von CXCR4 und CXCL12 insbesondere für die Kolonisierung des Knochenmarks verantwortlich ist. Im adulten Organismus zeigt sich das CXCR4+ Zellen entlang eines CXCL12-Gradienten migrieren. Durch diesen Mechanismus werden adulte CXCR4+ hämatopoetische Stammzellen im CXCL12- exprimierenden Stoma des Knochenmarks immobilisiert.
Seit 2004 steht fest, dass es 23 unterschiedliche Tumorarten gibt, die CXCR4 positiv sind (BALKWILL 2004).
Zu den klassischen CXCR4+-Tumoren gehört das Mammakarzinom (SALVUCCI 2006), das Ovarialkarzinom (SCOTTON et al. 2001), das Prostatakarzinom (SUN et al. 2003), das Leberzellkarzinom (SCHIMANSKI et al. 2006), sowie hämatologische Malignome (PISTOIA et al. 2006).
Bei Patienten mit hepatozellulärem Karzinom ist eine Überexpression des Chemokinrezeptors signifikant mit erhöhter Tumorprogression, stärkerer metastatischer Streuung und schlechterem Outcome assoziiert (SCHIMANSKI et al. 2006). Bei Mammakarzinompatienten korreliert das Muster der CXCR4 Expression mit dem Grad der
Lymphknotenmetastasierung (KATO et al. 2003).
Während in diesen Tumorentitäten CXCR4 exprimiert wird, zeigen die Organe, welche häufig Ziel der Metastasierung sind, eine hohe CXCL12 Expression. Dazu gehören u. a. Knochenmark, Leber und Lymphknoten (DORSAM und GUTKIND 2007). Dementsprechend stellt eine hohe CXCR4- Expression ein erhöhtes Risiko für metastatische Prozesse dar (BALKWILL 2004). Durch Beteiligung des Rezeptors an der Zellmotilität und Kanzerogenese ist er von besonders großem wissenschaftlichem und pharmakologischem Interesse.
1.3.3 Der Chemokinligand CXCL12
Der Chemokinligand CXCL12 wird auch stromal cell derived factor 1 (SDF-1) genannt, da er von Stromazellen im Knochenmark sezerniert wird.
SDF-1 liegt in sechs unterschiedlichen Transkripten vor, SDF-1α, SDF-1β SDF-1γ, SDF-1δ, SDF-1ε und SDF-1φ, (YU et al. 2006), wobei SDF-1α die häufigste Splicevariante darstellt. Da sich die vorliegende Arbeit ausschließlich mit SDF-1α befasst, wird zur Vereinfachung die Bezeichnung
„SDF-1 oder CXCL12“ für diese Isoform verwendet.
CXCL12 ist ein 68- Aminosäure- großes Zytokin, das zur Familie der CXC- Chemokine gehört. CXCL12 ist im Gegensatz zu den anderen CXC- Chemokinen, die auf Chromsom 4 lokalisiert sind, auf dem Chromosom 10 lokalisiert (SHIROZU et al. 1995).
Wie oben beschrieben, vermittelt CXCL12 seine Wirkung über den Chemokinrezeptor CXCR4, ein zweiter Rezeptor – CXCR7- scheint die Signalgebung über den CXCR4- Rezeptor zu modulieren (TIVERON und CREMER 2008).
CXCL12 wird in zahlreichen Organen gebildet, dazu gehören Herz, Leber, Gehirn, Niere, Skelettmuskulatur sowie lymphatische Organe. Dabei liegt CXCL12 vorwiegend in vaskulären Epithelzellen, Fibroblasten und Osteoblasten vor (GRUNEWALD et al. 2006; KATAYAMA et al. 2006; PETIT et al. 2002; PONOMARYOV et al. 2000; ZOU et al. 1998). In der Tumorbiologie nimmt CXCL12 eine wichtige Rolle ein. Die meisten Tumoren
gehen aus chronischen Entzündungsprozessen hervor und besitzen selber deutliche Merkmale einer Entzündung wie das Einwandern von Immunzellen oder die Expression von Entzündungszellen.
CXCL12 fördert die Metastasierung in spezielle Organe. So beschrieb die Arbeitsgruppe Muller et al. 2001 die spezifische Absiedlung von CXCR4- produzierenden Mammakarzinomen in CXCL12- positive Organe. Außerdem fördert CXCL12 die Invasionssteigerung durch Synthese bestimmter Proteasen aus der Gruppe der Matrixmetalloproteinasen (MMPs), die die Extrazellularmatrix zersetzen und so eine Migration der Tumorzellen durch Extrazellularräume ermöglichen (Übersicht KRYCZEK et al. 2007).
CXCL12 gehört zur Gruppe der ELR- negativen Chemokine, die eine initiale Rolle als Promotoren in der Angiogenese spielen und somit eine Ausnahme in der Gruppe der ELR- negativen Chemokine darstellen. CXCL12 lockt plasmozytäre dendritische Zellen in das Tumorgewebe und induziert die Neoangiogenese durch Produktion von Interleukin 8 (IL-8) und Tumornekrosefaktor- alpha (TNF-α) (CURIEL et al. 2004).
Außerdem scheint es bezüglich der Neoangiogenese einen synergistischen Effekt zwischen einer pathologisch hohen CXCL12- Konzentration und dem endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF- vascular endothelial growth factor) zu geben (KRYCZEK et al. 2005). Die Abbildung 3 von KRYCZEK et al. aus dem Jahr 2007 stellt verschiedene Vorgänge dar, die durch das Chemokin CXCL 12 moduliert werden. Zum einen fördert CXCL12 das Tumorwachstum, es erhöht die Angiogenese und fördert zudem ein immunsupressives Umfeld.
Zum Anderen moduliert CXCL12 die Zellmigration, Zelladhäsion und die Zellinvasion in das Tumorgewebe.
Abbildung 3: Multiple modes of actions are implicated in CXCL12 mediated tumor biology Abkürzungen: mDC, myeloische dendritische Zellen; pDC, plasmozytäre dendritische Zellen.
In Anlehnung an Kryczek et al. 2005. Grafik: ieQ-health
Hall und Korach berichteten 2003 über einen Zusammenhang zwischen der CXCL12- Produktion und dem Östradiolspiegel. Des Weiteren wird die Synthese des Chemokins durch den Transkriptionsfaktor HIF-1 (hypoxia inducible factor) in Endothelzellen erhöht (CERADINI et al. 2004).
Sauerstoffmangel induziert die CXCL12 Produktion in synovialen Fibroblasten (HITCHON et al. 2002) sowie in hämatopoetischen Stammzellen (HSC) (CERADINI et al. 2004). Die Expression von CXCL12 wird also durch Sauerstoffmangel und hormongetriggerte Kaskaden gesteuert. In der in vivo- Blockade der CXCL12/CXCR4- Achse konnte im Mausmodel gezeigt werden, dass sich das Tumorwachstum sowie die Bildung von Metastasen reduzieren lassen (BERTOLINI et al. 2002; MULLER et al. 2001; RUBIN et al. 2003;
ZEELENBERG et al. 2003).
1.3.4 Organspezifische Metastasierung
Für Tumorzellen von Primärtumoren bestimmter Gewebe scheinen in manchen Organen besonders günstige Bedingungen für die Absiedlung beziehungsweise das Wachstum von Metastasen vorzuherrschen. Das Mammakarzinom beispielsweise metastasiert häufig in Knochen, Leber, Lunge und Gehirn; das Prostatakarzinom in Knochen und das kolorektale Karzinom vorzugsweise in die Leber (CHAMBERS et al. 2002).
Diese Organspezifität der Metastasierung durch ein speziell geeignetes Environment erklärte der Chirurg Paget 1889 mit der „Seed and Soil- Theorie“
(FIDLER 2001). Nachdem er Daten von Frauen analysierte, die an einem Karzinom verstorben waren, bemerkte er eine Korrelation zwischen der Ausbildung von Knochenmetastasen und der Art des Primärtumors. Bei seiner Theorie steht seed für die Abhängigkeit der Tumorzelle vom sekundären Organ soil. Diese Theorie wurde 1928 von dem Pathologen James Ewing angefochten. Er postulierte, dass die Organselektivität auf der Gefäßversorgung des Primärtumors und mechanischen Faktoren beruht (EWING 1928). Untersuchungen zeigten jedoch, dass keine der Theorien alleine genügt, um klinisch evidente Metastasierungsmuster zu erklären (FIDLER 2001). Minn et al. fanden 2005 heraus, dass auch das Expressionsprofil der Tumorzelle erheblich zur Organpräferenz bei der Metas- tasierung beiträgt. In Studien konnte gezeigt werden, dass Subpopulationen eines Tumoren unterschiedliche Muster metastasierungsassoziierter Gene exprimieren und dass den einzelnen Expressionsprofilen eine präferenzielle Metastasierung in bestimmte Organe zugewiesen werden kann. Es gelang den Autoren, einen speziellen Satz an Genen zu identifizieren, der für die Metastasierung von Mammakarzinomen zumindest mitverantwortlich sein könnte (MINN et al. 2005). Hierbei spielen neben Wachstumsfaktoren spezielle Chemokine und ihre Rezeptoren eine signifikante Rolle (ZLOTNIK 2004).
Beim Mammakarzinom konnte festgestellt werden, dass der Chemokinrezeptor CXCR4 besonders hoch exprimiert wird und der Tumor in Organe metastasiert, die besonders reich an dessen Ligand CXCL12 /SDFα-
1 sind. Da die hohe CXCR4- Expression in zahlreichen Karzinomen festgestellt werden konnte, zählt dieser Chemokinrezeptor zu den wichtigsten Rezeptoren bezüglich der organspezifischen Metastasierung, was ihn für die vorliegende Arbeit besonders interessant macht (BALKWILL 2004;
HIDDEMANN 2010).
1.4 Fragestellung
Das Chemokin CXCR4 und der Ligand CXCR12 stehen durch neuere Forschungsergebnisse im wissenschaftlichen Fokus und sind aktuell von einem großen pharmakologischen Interesse. Durch die Blockade des Re- zeptors mit spezifischen Antikörpern ist es möglich, das Metastasierungs- verhalten von bestimmten Tumoren zu kontrollieren und eventuell zu unterbinden. Um diesen therapeutischen Ansatz zu verfolgen, ist es notwendig, sich mit der Expression der CXCL12- CXCR4- Achse im Plattenepithelkarzinom zu beschäftigen.
In dieser Arbeit sollte überprüft werden, ob es im Rahmen der oralen Karzinogenese zu einer immunhistologisch detektierbaren Regulation von CXCR4 und/ oder CXCL12 kommt.
Diese Frage sollte in einem gut reproduzierbaren Tiermodell analysiert werden, um zu überprüfen, ob dieses für weiterführende in-vivo- Untersuchungen geeignet ist.
2 Material und Methoden
2.1 Tierversuchsantrag
Der im Folgenden dargestellte Tierversuch wurde von dem Nieder- sächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit unter der Antragsnummer AZ 33.14.42502-04-066/08 geprüft und am 17.9.2008 genehmigt.
2.2 Versuchstiere
Bei den Versuchstieren handelt es sich um Syrische Goldhamster (mesocricetus auratus), im Alter von fünf bis sechs Wochen, kommerziell erhältlich bei Charles River Laboratories International Inc.. Insgesamt wurden 30 männliche Tiere eingesetzt, deren Alter zu Beginn der Behandlung einheitlich acht Wochen betrug.
Es wurden jeweils 5 Tiere in einem Käfig mit freiem Zugang zu Wasser und Trockenfutter (ssniff Ha, Alleinfuttermittel Hamster), bei einer Umgebungs- temperatur von 22° C und einer Luftfeuchtigkeit von ca. 50% im Tierstall der Universitätsmedizin Göttingen (UMG) gehalten.
Die Beleuchtung erfolgte durch künstliches Licht in einem 12- stündlich wechselnden Hell-Dunkel-Rhythmus.
2.3 Tierversuch
Der Syrische Goldhamster ist für die experimentelle Arbeit am oralen Plattenepithelkarzinom besonders gut geeignet. Die mit der Mundhöhle kommunizierenden Wangentaschen, haben eine Tiefe von 2,5cm und 3,5cm
und garantieren so eine lange Verweildauer der dort aufgebrachten Noxe.
Darüber hinaus kann die Wangentaschenschleimhaut zur intraexperimen- tellen Beobachtung herausgezogen und invertiert werden.
Nach zweiwöchiger Akklimatisierung der Hamster erfolgte die Behandlung mit 9,10 Dimethyl-1,2 Benzanthracene (DMBA) (0,5%ig gelöst in U. S. P.
Mineralöl) nach dem Behandlungsschema von Salley (SALLEY 1954). DMBA wurde mittels eines Feinhaarpinsel Gr. 4 in der rechten Wangentasche aufgebracht.
Abbildung 4: Bepinselung der rechten Wangentasche mit DMBA-Lösung.
Das Abhalten der Wange erfolgte durch einen kleinen Langenbeck. Eine Sedierung der Tiere war nicht nötig. Es wurde dreimal wöchentlich (Montag, Mittwoch und Freitag) DMBA appliziert.
Um die natürliche Nahrungsaufnahme der Tiere während der Tumor- progression zu gewährleisten, wurde jeweils nur die rechte Wangentasche behandelt. Die Hamster wurden jede Woche gewogen und das Gewicht wurde dokumentiert. Die Versuchstiere wurden in drei Gruppen mit jeweils 10 Tieren eingeteilt.
Die Applikation der Testsubstanz erfolgte bei Gruppe A über 10 Wochen und bei Gruppe B über 14 Wochen. Gruppe C wurde ebenfalls über 14 Wochen behandelt. Anschließend folgten 5 Wochen ohne Behandlung zur Tumorprogression. Darauf erfolgte die Tumorresektion.
Gruppe Anzahl Gruppe A
Anzahl Gruppe B
Anzahl Gruppe C
Applizierte Substanz
DMBA 10 10 10 DMBA 0,5%
in Mineralöl
Tabelle 9: Behandlungsplan Regime A: Lokale Applikation der Testsubstanzen über einen Zeitraum von 10 Wochen, direkt im Anschluss Tumorresektion. Regime B: Lokale Applikation über einen Zeitraum von 14 Wochen, direkt im Anschluss Tumorresektion. Regime C: Lokale Applikation über einen Zeitraum von 14 Wochen, anschließend fünf Wochen ohne Applikation, im Anschluss Tumorresektion.
Aus Gruppe C wurde ein Tier, bedingt durch Verschlechterung des Allgemeinzustandes und starker Gewichtsreduktion, nach 16 (14+2) Wochen euthanasiert und aus dem Versuch ausgeschlossen.
Die Diagnose “Plattenepithelkarzinom“ und dessen Vorläuferläsion wurden durch die abschließende Tumorresektion und histologische Begutachtung bestätigt.
2.4 Probenentnahme
Die Resektion der Tumor- und Kontrollgewebe erfolgte nach Opferung der Tiere durch CO2 Narkose und darauffolgender intrapulmonaler T61-Injektion.
Die Schleimhaut aus der rechten (n=29) sowie randomisiert zum Teil auch aus der linken Wangentasche (n=12) wurde exzidiert. Wegen eines priorisierten parallel laufenden Projektes zur Genexpressionsanalyse auf RNA-Ebene konnten nur aus jenen Tumoren, die eine ausreichende Größe hatten, Biopsien zur histologischen Auswertung genommen werden.
2.4.1 Einbettung des Gewebes
Das Tumorgewebe wurde in einem Einbettautomaten „Citadel 2000“ und in Histoclear® als Intermedium überführt. Anschließend erfolgte die Einbettung
in Rotiplast®. Die Dehydrierung und Einbettung verlief nach folgendem Protokoll (Tab. 10):
70% Ethanol 3 Stunden
80% Ethanol 2 Stunden
90% Ethanol 2 Stunden
100% Ethanol 2 Stunden
100% Ethanol 2 Stunden
Isopropanol 30 Minuten
Isopropanol 30 Minuten
Histoclear® 45 Minuten
Histoclear® 45 Minuten
1:1 Histoclear® : Rotiplast® (bei 60°C) 1,5 Stunden
Rotiplast® (bei 60°C) 7 Stunden
Tabelle 10: Protokoll für die Einbettung der Gewebeproben
2.4.2 Anfertigung der Schnitte
Mit einem Mikrotom HM355 wurden 3 µm dicke Schnitte aus dem jeweiligen Paraffinblock hergestellt. Für die immunhistochemischen Färbungen von CXCR4 und CXCL12 wurden die paraffineingebetteten Gewebeschnitte auf SuperFrostPlus Objektträger aufgezogen. Anschließend wurden die Schnitte auf einer 37 Grad Celsius warmen Heizplatte getrocknet und gestreckt.
Danach erfolgte die Trocknung der Präparate über Nacht im Wärmeschrank bei 37 Grad Celsius. Die vorbereiteten Schnitte wurden darauf kurzzeitig in staubfreien Präparatekästen bis zur weiteren Bearbeitung gelagert.
2.4.3 Antikörper
CXCL12: Als Primärantikörper wurde ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper (Thermo Scientific PA1-29030) gegen CXCL12 eingesetzt, als Sekundär- antikörper für die Detektion der immunhistochemischen Reaktion diente EnVision + Dual Link System Peroxidase (Dako K4063).
CXCR4: Als Primärantikörper wurde ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper (abcam2074) gegen CXCR4 eingesetzt, als Sekundärantikörper für die Detektion der immunhistochemischen Reaktion diente ebenfalls EnVision + Dual Link System Peroxidase (Dako K4063).
2.4.4 Entparaffinierung und Rehydrierung der Schnitte
Die Entparaffinierung erfolgte in absteigender Alkoholreihe unter einem Abzug nach folgendem Protokoll:
Xylol 3 x 5 min
100 % Ethanol 3 x 3 min
96 % Ethanol 2 x 3 min
70 % Ethanol 2 x 3 min
40 % Ethanol 1 x 3 min
Aqua dest. 2 x 3 min
Tabelle 11: Entparaffinierung
2.4.5 Demaskierung der Präparate
Die Demaskierung erfolgte im Drucktopf (Pascal, Dako). In diesen wurde die Küvette gestellt, welche mit einem Citratpuffer pH 9 (Target Retrievel Solution pH 9, Dako) gefüllt war und für folgende Inkubationszeiten im Drucktopf belassen wurde.
SP1 125 °C 30 Sekunden
SP2 90 °C 10 Sekunden
Tabelle 12: Demaskierung
2.4.6 Protokoll für den immunhistochemischen Nachweis von CXCR4 und CXCL12
Blocken der endogenen Peroxidase 12 min Peroxidase Blocking, Reagent S001 Dako
Waschen und Puffern 5 x 2 min, TTBS
Inkubation mit Primärantikörper 2 Std, Polyclonal Anti-CXCR4 Verdünnung 1: 500 in AK Diluent
Waschen und Puffern 5 x 2 min TTBS
Inkubation mit Sekundärantikörper 30 min, in feuchter Kammer, EnVision Dako K 4063, 1 Tropfen
Waschen und Puffern 5 x 2 min, TTBS
Detektion der immunhistochemischen Reaktion
5 min, DAB- Lösung
Waschen 4 x 1 min A. dest., 1 x 5 min A. dest.
Tabelle 13: Protokoll CXCR4
Blocken der endogenen Peroxidase 12 min Peroxidase Blocking, Reagent S001, Dako
Waschen und Puffern 5 x 2 min, TTBS
Inkubation mit Primärantikörper 2 Std Polyclonal Anti-CXCL12 Verdünnung 1: 500 in AK Diluent
Waschen und Puffern 5 x 2 min TTBS
Inkubation mit Sekundärantikörper 30 min in feuchter Kammer EnVision Dako K 4063, 1 Tropfen
Waschen und Puffern 5 x 2 min, TTBS
Detektion der immunhistochemischen Reaktion
5 min DAB- Lösung
Waschen 4 x 1 min, A. dest.
1 x 5 min, A. dest.
Tabelle 14: Protokoll CXCL12
2.4.7 Gegenfärbung
Die Präparate wurden für 30 Sekunden mit Hämalaun (S2020, Dako 1:10 verdünnt) gegengefärbt und anschließende 5 Minuten mit langsam fließendem Leitungswasser gewaschen.
2.4.8 Dehydrierung und Eindecken der Präparate
Anschließend erfolgt die Dehydrierung unter einem Abzug mittels aufsteigender Alkoholreihe:
A. dest. 2 x 3 Minuten
40 % Ethanol 1 x 3 Minuten
70 % Ethanol 1 x 3 Minuten
96 % Ethanol 2 x 3 Minuten
100 % Ethanol 3 x 3 Minuten
Xylol 3 x 3 Minuten
Tabelle 15: Dehydrierung
Eingedeckt wurde mit Entellan- Schnelleindeckmittel und Deckgläschen.
Danach wurden die Präparate über Nacht unter einem Abzug getrocknet.
2.5 Dokumentation der Ergebnisse
Zur Bearbeitung der Schnitte wurden alle Präparate mit einem Photomikroskop und angeschlossenem Scanner (Olympus BX 51 ®) digitalisiert. Die entstandenen Bilder wurden zunächst durch die Software (Olympus dot Slide ®) als vsi- Datei gespeichert und zur weiteren Verwendung in eine tif- Datei überführt. Abschließend wurde diese Multipage Bilddatei (tif- Datei) durch das Programm Irfan View ® in seine vier Ebenen aufgeteilt. Die dritte Ebene wurde als JPEG. Datei gespeichert.
2.5.1 Semiquantitative Auswertung/ Randomisierung
Mit Hilfe einer Excel®- Tabelle wurden Zufallszahlen für die angefertigten Schnitte generiert. Dadurch war es Frau Dr. med. Julia Kitz (Zentrum Pathologie, UMG) möglich, an Hand der randomisierten und verblindeten Präparaten eine unvoreingenommene, semiquantitative, histologische Beurteilung der Schnitte durchzuführen.
2.5.2 Karzinogenitätsprüfung
Zur Beurteilung und Erfassung des karzinogenen Effekts wurde zur Objektivierung der histologischen Ergebnisse den pathologischen Veränderungen ein selbstdefiniertes Grading zugeordnet. Histologische Ausprägungen wurden einer Skala von Null bis Sechs zugeordnet (siehe Tab.
16).
Grad histologische Auswertung 0 keine Veränderungen 1 Hyperkeratose
2 Hyperplasie 3 Dysplasie
4 mikroinvasives Karzinom 5 gut differenziertes Karzinom 6 schlecht differenziertes Karzinom
Tabelle 16: Grading histologische Auswertung
2.5.3 Auswertung CXCL12 und CXCR4
Die Auswertung der Expression von CXCL12 und CXCR4 erfolgte semiquantitativ durch den Vergleich mit der Expression im Referenzgewebe welches dem gleichen Färbeprotokoll unterzogen wurde.
histologischer Färbegrad
Expression
0 keine Expression
1 schwache Expression
2 durchschnittliche Expression 3 überdurchschnittliche Expression
Tabelle 18: Färbegrade
Zur Analyse der CXCR4- und CXCL12- Expression wurden für die zellulären Lokalisationen Zytoplasma und Zellkern getrennt dokumentiert und ausgewertet.
2.5.4 Statistische Auswertung
Die Analyse wurde mit dem Statistikprogramm „statistica“ für Windows7 durchgeführt. Es erfolgte eine statistische Analyse der unterschiedlichen Färbegrade mit einem nicht-parametrischen Kruskal-Wallis Test. Zur Vermeidung der Alphafehler-Kumulierung wurde eine Bonferroni-Holm- Korrektur durchgeführt, wobei Expressionsänderungen bei einem korrigierten p-Wert von unter 0,05 angenommen wurden.
2.6 Verwendete Lösungen, Chemikalien und Geräte
2.6.1 Verwendete Lösungen
TBST Tris- Puffer- Saline mit Tween 20 “S3306“(DAKO, Hamburg)
Vor Gebrauch im Verhältnis 1:10 mit Aqua dest. verdünnen, die entstandene Lösung (=TTBS) besteht dann aus:
0,05mol/L Tris HCL, 0,3 mo/L NaCl, 0,1%Tween 20 und 0,01%
Konservierungsmittel ph 7,6
Liquid DAB + Substrate Chromogen System “K3465” (DAKO, Hamburg)
1ml DAB Chromogen (Diaminobenzidin in Chromogenlösung) 15ml DAB Substrat-Puffer (Imidazol-HCL-Puffer pH 7,5) 1 Tropfen DAB-Chromogen pro ml Substrat-Puffer Target Retrieval Solution pH 9 “S2367“ (DAKO, Hamburg)
TRIS/EDTA Puffer und Aqua dest. im Verhältnis 1:10 ansetzen
2.6.2 Verwendete Chemikalien
• DMBA DAKO, Hamburg
• Mineralöl DAKO, Hamburg
• Sekundärantikörper DAKO, Hamburg
• AK Diluent DAKO, Hamburg
• Peroxidase Blocking DAKO, Hamburg
• Aqua dest. eigene Herstellung
• Ethanol GeReSo, Dassel
• Hämalaun nach Mayer Merck, Darmstadt
• Histoclear Roth, Karlsruhe
• Rotiplast Roth, Karlsruhe
• Xylol Roth, Darmstadt
• Entellan O. Kindler, Freiburg
2.6.3 Verwendete Geräte und Materialien
• Aluminiumfolie (Bunzl, Gelsenkirchen)
• Becherglas 50 ml/ 500 ml (Schott, Mainz)
• Computer „Macintosh“
• Dako Pen “S2002” (DAKO, Hamburg)
• Dampfdrucktopf “PASCAL” (DAKO, Hamburg)
• Deckgläser (MENZEL-GLÄSER, Saarbrücken)
• Einbettautomat “Citadel 2000” (Shandon, Frankfurt/M.)
• Einbettkassetten (Medim, Gießen)
• Eppendorfgefäße 2 ml (Roth, Karlsruhe)
• Glastrichter (Schott, Mainz)
• Handschuhe Latex (Transatlantic, Bremen)
• Kühlschrank (GFL, Burgwedel)
• Lichtmikroskop (Zeiss, Oberkochen)
• Labortücher KIMTECH Science (Kimberley Clark, Koblenz)
• Messzylinder 100ml/500ml/1000ml/2000ml (Schott, Mainz)
• Mikroliterpipette 0,5-10µl (Eppendorf AG, Hamburg)
• Mikroliterpipette 5-50 µl (Eppendorf AG, Hamburg)
• Mikroliterpipette 10-100 µl (Eppendorf AG, Hamburg)
• Mikroliterpipette 100-1000 µl (Eppendorf AG, Hamburg)
• Mikrotom „HM 355“ (Microm, Walldorf)
• Mikrotomklingen „R 35“ (Feather, Osaka)
• Objektträger „Super Frost“ (Roth, Karlsruhe)
• Objektträger (MENZEL-GLÄSER, Saarbrücken)
• Paraffinausgießstation (Medim, Gießen)
• Parafilm (American National Can, Greenwich)
• Pasteurpipetten (Roth, Karlsruhe)
• Pipettenspitzen (Eppendorf AG, Hamburg)
• Pipettenspitzen “Tip one” (starlab, Hamburg)
• Photomikroskop mit Scanner “Olmypus BX 51” (Olympus GmbH, Hamburg)
• Polyethylenfolien (Heraeus Kulzer GmbH, Hanau)
• Reagenzglasschüttler “Reamix-2789” (Assistant, Sondheim)
• Skalpelle „techno cut“ (HMD Healthcare Ltd., Hereford, UK)
• Tiefkühlschrank (GFL, Burgwedel)
• Vortex Mixer (NeoLab Migge, Heidelberg)
• Waage ”Mettler PM460 Delta Range” (Mettler Instruments GMBH, Giessen)
• Zellstofftupfer (Fuhrmann GmbH, Much)
• Zentrifuge “3531” (ABBOTT, Ludwigshafen)
3 Ergebnisse
3.1 Makroskopische Ergebnisse
Beim syrischen Goldhamster wurden lokale Applikationen der DMBA- Lösung genutzt um ein Plattenepithelkarzinom zu induzieren welches mit dem humanen oralen Plattenepithelkarzinom vergleichbar war. Makroskopisch war erkennbar, dass durch die DMBA- Applikation deutliche Schleimhaut- veränderungen wie Rötung, Vergröberung und exophytisches Wachstum auftraten. Die Wangentaschenschleimhaut nach 10- wöchiger DMBA- Applikation zeigte erste lokale Rötungen. Vereinzelt waren erste Vergröberungen der Schleimhaut erkennbar. Weder endophytisches noch exophytisches Wachstum waren zu diesem Zeitpunkt sichtbar. Die Vaskularisierung erschien regelrecht (siehe Abb.5).
Abbildung 5: Wangentaschenschleimhaut nach 10- wöchiger DMBA- Applikation.
Die Wangentaschenschleimhaut nach 14- wöchiger DMBA- Applikation zeigte deutliche Unterschiede im Vergleich zu dem Präparat nach 10-wöchiger DMBA Applikation. Die entnommene Schleimhaut war gut vaskularisiert, das Präparat war deutlich gerötet. Außerdem stellten sich ausgeprägte Vergröberungen dar. Erste Anzeichen von exophytischem Wachstum waren sichtbar (siehe Abb.6).
Abbildung 6: Wangentaschenschleimhaut nach 14- wöchiger DMBA Applikation.
Nach 14-wöchiger DMBA Applikation und anschließendem 5-wöchigen Tumorwachstum zeigten sich deutliche Anzeichen eines kanzerogenen Geschehens. Die Schleimhaut war sehr stark vaskularisiert und gerötet.
Deutlich erkennbar waren das exophytische Wachstum sowie ausgeprägte Knotenbildungen (siehe Abb.7).
Abbildung 7: Wangentaschenschleimhaut nach 14- wöchiger DMBA Applikation und anschließendem 5- wöchigen Tumorwachstum.
3.2 Histologische Ergebnisse
Bei der Auswertung der 41 für die immunhistochemischen Färbungen verwendeten Schnitte zeigten sich alle Stadien des kanzerogenen Geschehens sowie gesunde Mundschleimhaut. Zur Objektivierung wurden die histologischen Veränderungen einem Grading zugeordnet (siehe Tabelle 16).
Dabei beschreibt Grad Null die gesunde Mukosa, die auch bei vier DMBA- behandelten rechten Wangentaschepräparaten nachgewiesen werden konnnte. Zur besseren Übersicht für die statistische Auswertung wurden die
Grade Eins, Zwei und Drei zusammengelegt und betreffen in den folgenden Grafen den Abschnitt den Dysplasie. Grad Vier und Fünf betreffen den Bereich des gut differenzierten Karzinoms und Grad Sechs den Bereich des schlecht differenzierten Karzinoms.
3.3 Auswertung CXCL12 und CXCR4
3.3.1 CXCR4 Zellkern
Im Folgenden sind die Ergebnisse der semiquantitativen Auswertung grafisch dargestellt.
Auf der y-Achse stellt sich die Häufigkeit der Expression des Proteins CXCR4 im Zellkern dar. Die x-Achse zeigt die einzelnen Veränderungen der oralen Mundschleimhaut entsprechend dem histologische Grading.
Abbildung 8: Expression des Proteins CXCR4 in den verschiedenen Stadien der Tumorentstehung, zelluläre Lokalisation – Kern.
CXCR4 lässt sich im Zellkern in jeder histologischen Ausprägung nachweisen. Es zeigt sich kein statistisch nachweisbarer Unterschied zwischen gesunder Mukosa, Dysplasie, dem gut differenzierten Karzinom und dem schlecht differenzierten Karzinom trotz relativ unterschiedlicher Farbintensität.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Gesunde Mukosa
Dysplasie gut diff.
Karzinom
schlecht diff.
Karzinom
Expression des Rezeptors CXCR4
histologische Ausprägung
CXCR4 Zellkern
Färbegrad 0 Färbegrad 1 Färbegrad 2 Färbegrad 3
3.3.2 CXCL12 Zellkern
Im Vergleich dazu die Expression des Liganden CXCl12:
Abbildung 9: Expression des Proteins CXCL12 in verschiedenen Stadien der Tumorentstehung, zelluläre Lokalisation – Kern.
Die Grafik verdeutlicht, dass im Zellkern der Zellen der unterschiedlichen Gewebe der Ligand CXCL12 nicht exprimiert wird.
Im Bereich der Zellkerne lässt sich also lediglich CXCR4 nachweisen.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
gesunde Mukosa
Dysplasie gut diff.
Karzinom
schlecht diff.
Karzinom
Expression des Liganden CXCL12
histologische Ausprägung
CXCL12 Zellkern
Färbegrad 0 Färbegrad 1 Färbegrad 2 Färbegrad 3
3.3.3 CXCR4 Zytoplasma
Abbildung 10: Expression des Proteins CXCR4 in den verschiedenen Stadien der Tumorentstehung, zelluläre Lokalisation – Zytoplasma.
Tendenziell ist die Expression von CXCR4 im Bereich des Zytoplasmas geringer als im Zellkern. Der Rezeptor wird jedoch in jedem Stadium der Mundschleimhautveränderung sowie auch in der gesunden Mukosa exprimiert.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
gesunde Mukosa
Dysplasie gut diff.
Karzinom
schlecht diff.
Karzinom
Expression des Rezeptors CXCR4
histologische Ausprägung
CXCR4 Zytoplasma
Färbegrad 0 Färbegrad 1 Färbegrad 2 Färbegrad 3
3.3.4 CXCL12 Zytoplasma
Abbildung 11: Expression des Proteins CXCL12 in verschiedenen Stadien der Tumorentstehung, zelluläre Lokalisation – Zytoplasma.
Im Vergleich dazu konnte nachgewiesen werden, das die Proteinexpression des Liganden CXCL12 im Zytoplasma, bei zunehmend entdifferenzierten Tumoren abnimmt.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
gesunde Mukosa
Dysplasie gut diff.
Karzinom
schlecht diff.
Karzinom
Expression des Liganden CXCl12
histologische Ausprägung
CXCL12 Zytoplasma
Färbegrad 0 Färbegrad 1 Färbegrad 2
4 Diskussion
4.1 Diskussion der Methode
4.1.1 Das Tiermodell
Zur Untersuchung der Expression von CXCL12 und CXCR4 in der oralen Karzinogenese ergibt sich die Notwendigkeit zum Einsatz von Tiermodellen.
Grundsätzlich gibt es drei Tiermodelle die geeignet sind:
• spontan wachsende Tumoren, wie beispielsweise das auriculäre Plattenepithelkarzinom des Schafes (HARKER und STEPHENS 1992)
• subkutane und orthotope Heterotransplantate aus Kopf-Halstumoren, induziert durch Inokulation geeigneter Zelllinien der Maus (SANO und MYERS 2009).
• Tumorinduktion durch topische Applikation von chemischen kanzerogenen Substanzen, wie 4-Nitroquinolin 1-Oxid (4NQO) bei Mäusen (STEIDLER & RIEDE 1984) oder Ratten (NAUTA et al. 1995) oder DMBA bei Hamstern (SALLEY 1954).
Da natürlich wachsende orale Karzinome bei Labortieren äußerst selten sind, ist es folglich nicht möglich, ein geeignetes Versuchsprotokoll zu erstellen.
Das Hamstermodell ist das am besten charakterisierte und erforschte Tiermodell im Bezug auf die oral induzierte Karzinogenese, so dass wir uns in der vorliegende Arbeit für dieses Tumormodell entschieden haben (MORRIS 1961).
Anatomisch gesehen sind die bilateralen Wangentaschen des syrischen Goldhamsters durch ihre Invertierbarkeit und Größe sehr gut für die lokale Applikation der DMBA-Lösung geeignet.
Histologisch ist die Wangentaschenmukosa mit dünn keratinisiertem Plattenepithel ausgekleidet. Ein großer Vorteil des DMBA- induzierten
Hamstermodells ist, dass jedes einzelne Stadium des kanzerogenen Geschehens genau beobachtet und beurteilt werden kann (LIN et al. 1996, LIN et al. 1997).
Des Weiteren spiegelt dieses Tiermodell essentielle Eigenschaften der Entwicklung prämaligner und maligner humaner Plattenepithelkarzinomen wieder. Dazu gehört unter anderem:
• die aberrierte mRNA und Proteinexpression der p53- Familie (p53, p63 und p73) (CHEN et al. 2003, CHEN et al. 2002, CHEN et al. 2003, CHEN et al. 2004)
• die Expression von proliferativen Markern (SCHWARTZ et al.1995, SCHWARTZ et al. 1989)
• eine sehr frühe Expression der gamma- Glutamyltranspeptidase (SOLT 1981, SUDA et al. 1981)
• der Anstieg der Zytokeratine ( ROBLES et al. 1993, SCHWARTZ 1995, GIMENZ-CONTI 1990)
• eine Erhöhung der zytotoxischen Lymphozyten und Zytokine (wie Tumornekrosefaktoren) (SCHWARTZ et al. 1989, SCHWARTZ et al.
1990, SCHWARTZ et al. 1989, SCHWARTZ et al. 1991)
• die Überexpression durch verschiedene Wachstumsfaktoren (wie epidermale oder transformative Wachstumsfaktoren) (WONG et al.
1988, WONG 1993)
• sowie die präventive Substanzen wie Tocopherol, Retinol und Carotinoide (SUDA et al. 1986, SHKLAR et al. 1982, SHKLAR et al.1989, SHKLAR 1993)
Im Hinblick auf die weitere Forschung bezüglich der Chemokine CXCL12 und CXCR4 und dem damit verbundenen Metastasierungsverhalten existieren jedoch Einschränkungen.
Leider kommt es nur selten zu Metastasen in die zervikalen Lymphknoten und andere Organe wie Lunge oder Leber (MOGNETTI et al. 2006, GIMENEZ- CONTI und SLAGA 1993). Hier würde sich eventuell das VX2- induzierte Karzinom am Kaninchen besser eignen, welches jedoch bisher nur selten
verwendet wurde und dadurch die wissenschaftliche Datenlage hierzu sehr gering ist. 2002 sind Chikui und Kollegen sehr erfolgreich damit gewesen, ein Mundbodenkarzinom durch eine Transplantation eines VX2- Tumors zu induzieren. Im Anschluss konnten 20 zervikale Lymphknotenmetastasen via Sonographie diagnostiziert werden (CHIKUI 2002). Zum Vergleich dieser Methoden siehe Tab. 16 Chen 2010.
Hamster: DMBA- Tumorinduktion
Kaninchen: VX2- Tumorinduktion Methode der
Tumorinduktion
topische DMBA Applikation auf die Mukosa
Implantation der frischen VX2 Tumormasse in die Mukosa oder Injektion einer VX2 Suspension Induktionszeit lang (12- 14 Wochen) kürzer ( 6 Wochen) Behandlungszeit 3 x pro Woche 1 x pro Woche Tumordifferenzierung gut differenzierte
exophytische Tumore;
moderat differenzierte endophytische Tumore
moderat bis wenig differenzierte Tumore
Ausbreitung in zervikalen Lymphknoten
nicht anwendbar anwendbar
Infiltration in den Kieferknochen
nicht anwendbar anwendbar
Fernmetastasierung nicht anwendbar nicht anwendbar Karzinogenes
Geschehen (Läsion- Karzinom)
anwendbar nicht anwendbar
Tabelle 19: Vergleich der Eigenschaften zwischen dem Hamster- und Kaninchenmodell bei induzierter Karzinogenese (modifiziert nach Chen 2010)
