Untersuchungen von Glucosinolaten bei Senf unterschiedlicher Standorte

Paul Veit

Untersuchungen von Glucosinolaten bei Senf unterschiedlicher Standorte

Masterarbeit

zur Erlangung des akademischen Grades Master of Science

an der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Karl Franzens-Universität Graz

Begutachterin:

Ao.Univ.-Prof. Dr.phil. Maria Müller Institut für Pflanzenwissenschaften

Graz, August 2015

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Gewidmet meiner Familie

Gelbsenfanbau bei Bernhardsthal (NÖ)

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Danksagung

Meiner Betreuerin, Frau Ao.Univ.-Prof. Dr.phil. Maria Müller, danke ich recht herzlich für Ihre tatkräftige Unterstützung während meiner gesamten Arbeit.

Mein besonderer Dank gilt ebenso Herrn Mag.rer.nat., René Rehorska, für seine kompetenten Ratschläge während der praktischen Arbeit, wobei ich seine realitätsnahen Lebensweisheiten nicht hätte missen wollen, die mich immer wieder zum Schmunzeln brachten.

Für die fachkundige Unterstützung bei den HPLC-Analysen und Auswertungen danke ich besonders Herrn Klaus Remele.

Den Mitarbeitern der Steirersaat, Herrn Ing. Michael Papadi und Josef Krenn, danke ich für die erfolgreiche und lehrreiche Zusammenarbeit, wodurch ich auch viel Praxiswissen vermittelt bekommen habe. Mein herzlicher Dank gilt auch folgenden Landwirten, ohne die diese Diplomarbeit nicht möglich gewesen wäre, und die mich immer wieder dankenswerterweise auch kulinarisch versorgt haben:

Herrn Boris Brumen, Herrn Philipp Frühwirth, Herrn Rudolf Haas, Herrn Erich Lehner, Herrn Reinhard Mayer und Herrn Erich Sailer.

Den Mitarbeitern von Mautner Markhof, Herrn DI Thomas Nedoma und Herrn Leo Stich, danke ich für die Einblicke in die Senferzeugung und ihrer fachlichen Expertise.

Des Weiteren bedanke ich mich bei den Mitarbeitern der Lagerhäuser für Ihre Unterstützung bei ihrer engagierten Suche nach „Freiwilligen“ für meine Mastarbeit.

Herrn Dr. agr. Hartwig Katzer danke ich für die Kontaktherstellung zur Versuchsstation Pommritz (Sächsischen Landesamt für Umwelt, Landwirtschaft und Geologie), wodurch ich Zugang zu zusätzlichem Probenmaterial erhalten habe.

Mein besonderer Dank gilt aber meinen Eltern. Sie haben mich während meines gesamten Studiums finanziell, emotional und mental unterstützt. Damit haben sie einen wesentlichen Beitrag zu meinem Studium geleistet.

Inhalt

1. Einleitung ... 6

1.1 Grundlegendes zu den Glucosinolaten ... 6

1.2 Glucosinolate und ihre Wirkung ... 9

1.3 Ziele dieser Masterarbeit ... 10

2. Material und Methoden ... 11

2.1 Material ... 11

2.1.1 Probenmaterial und Laborzubehör für HPLC und DC ... 11

2.1.2 Software ... 14

2.1.3 Chemikalien für HPLC und DC... 14

2.1.4 Standards ... 15

2.2 Methoden ... 16

2.2.1 Extraktion von Sinalbin bzw. Sinigrin aus den Senfsamen ... 16

2.2.2 Dünnschichtchromatographie ... 19

2.2.3 HPLC-Methodik ... 22

3. Ergebnisse... 25

3.1 Ergebnisse der Vorversuche ... 25

3.2 Ergebnisse der Klimadiagramme und Bodenanalysen ... 32

3.3 Ergebnisse der Hauptversuche ... 39

3.3.1 Ergebnisse der HPLC ... 39

3.3.1.1 Sinalbin- bzw. Sinigringehalt des österreichischen Senfs (Sinapis alba und Brassica juncea)(Run-138) ... 39

3.3.1.2 Chromatogramme des Runs-138... 41

3.3.1.3 Sinalbingehalt des deutschen Gelbsenfs (Sinapis alba)(Run-140) ... 44

3.3.1.4 Sinalbingehalt des österreichischen Gelbsenfs (Sinapis alba)(Run-153) ... 46

3.3.1.5 Chromatogramme des Runs-153... 49

3.3.2 Dünnschichtchromatographie ... 51

4. Diskussion ... 52

4.1 Vorversuche ... 52

4.2 Boden und Klimadaten ... 53

4.2 Auswertung der österreichischen und deutschen Proben ... 54

5. Anhang ... 56

5.1 Literatur ... 56

5.2 Internetquellen ... 59

5.3 Abbildungsverzeichnis ... 60

5.4 Tabellenverzeichnis ... 62

5.5 Abkürzungsverzeichnis ... 63

6. Zusammenfassungen ... 64

6.1 Deutsche Zusammenfassung ... 64

6.2 Abstract ... 65

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1. Einleitung

1.1 Grundlegendes zu den Glucosinolaten

Glucosinolate sind schwefelhaltige Moleküle des Sekundärmetabolismus, die hauptsächlich in Pflanzen der Familie Brassicaceae (Kreuzblütler) vorkommen. Die Glucosinolate werden aus Aminosäuren aufgebaut. In verschiedenen Gemüsesorten, wie beispielsweise Senf, Kresse und Kren, sind die Glucosinolate verantwortlich für deren typischen Geschmack.

Alle Glucosinolate sind chemisch stabile Moleküle mit einer gemeinsamen Grundstruktur, die aus einer Glucoseeinheit, einer schwefelhaltigen Gruppierung mit einem Aglukonrest, sowie einer Sulfatgruppe besteht (Abb.(=Abbildung) 1). Das für die Spaltung der Glucosinolate verantwortliche Enzym ist die Myrosinase (β-Thioglucosidase), die in der Pflanzenzelle räumlich getrennt von den Glucosinolaten vorliegt. Die räumliche Trennung wird durch mechanische Einwirkungen (durch Schneiden oder Kauen) aufgehoben, wodurch ein enzymatischer Abbau ausgelöst wird.

Abbildung 1: Grundstruktur der Glucosinolate (WATZL 2001)

Beim Abbau entstehen äquimolare Mengen an Glucose, Sulfat und dem jeweiligen Aglukon.

Ascorbinsäure wirkt dabei als Coenzym, vermutlich durch die Bereitstellung einer nukleophilen katalytischen Gruppe. Aus dem instabilen Aglukon werden primär Isothiocyanate sowie andere Abbauprodukte wie Thiocyanate und Nitrile gebildet (Abb. 2). Unter dem Begriff „Senföle“ werden die Isothiocyanate zusammengefasst. Welche Glucosinolatderivate entstehen, ist - außer vom Aglukonrest - stark von Faktoren wie Temperatur, pH-Wert, Lagerung und Konservierungsverfahren der Gemüsearten abhängig. So werden bei neutralem pH-Wert vermehrt Isothiocyanate gebildet, bei saurem pH-Wert sind es primär Nitrile (WATZL 2001).

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Die Myrosinase wurde als erstes von Bussy 1840 entdeckt und im Anschluss in allen glucosinolathaltigen Pflanzen nachgewiesen (BELLOSTAS et al. 2008). Alle bisher bekannten pflanzlichen Myrosinasen gehören zur Glucosylhydrolyase-Familie 1, der sowohl prokaryotische, als auch eukaryotische Enzyme angehören: O-β-Glucosidasen, 6-Phospho-β-Glucosidasen, 6-Phospho-β- Galactosidasen und Lactasen. Die pH-Optima der Myrosinasen aus verschiedenen Pflanzen sind oft sehr unterschiedlich und umfassen nach LOEBERS 2014 einen großen Varianzbereich (pH-Wert 5 bis zu pH-Wert 9). Gleiches gilt auch für die Inaktivierung der Myrosinase durch die Temperatur. Es konnte bereits nachgewiesen werden, dass die Inaktivierung der Gelbsenfmyrosinase bei einer Temperatur von 60 °C beginnt, wobei eine 10 minütige Hitzebehandlung bei 70 °C zu einem 60 % Verlust der Enzymaktivität führt (VAN EYLEN et al.2006).

Myrosinasen Isoenzyme sind Glycoproteine mit verschiedenen Stufen der Glykosylierung bzw. auch verschiedenen isoelektrischen Punkten, welche organ- bzw. speziesspezifisch sind. Myrosinasen bestehen typischerweise aus 2 identischen 75 kDa Untereinheiten. Konkret katalysiert die Myrosinase die Hydrolyse der thioglucosidischen Bindung in Glucosinolaten (BELLOSTAS et al. 2008).

Wie bereits erwähnt, sind die Produkte dieser Hydrolyse Glucose und verschiedene Abbauprodukte, wie z.B. Isothiocyanate, Nitrile und Thiocyanate.

Abbildung 2: Abbauwege der Glucosinolate (WATZL 2001)

2001 wurde allgemein anerkannt, dass es 120 verschiedene Glucosinolate gibt. Dies ist auch weiterhin der am häufigsten genannte Wert. 2004 wurde eine Studie, in der Samen untersucht wurden, veröffentlich, in der 66 intakte Glucosinolate detektiert wurden, wobei 4 davon nicht in diesen 120 Glucosinolaten inkludiert waren. Bellostas (BELLOSTAS et al. 2007) erhöhte die Anzahl der

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Glucosinolate auf 133, aber diese Liste wurde von vielen nachfolgenden Forschern nicht anerkannt.

Da diese 3 Listen sich nicht komplett überschneiden, betrug die Gesamtanzahl verschiedener Glucosinolate nach dem Bellostas Review 149. Diese Gesamtanzahl wurde seit dem Jahr 2001 nicht mehr vollständig systematisch überprüft, derzeit nähert sich die Zahl an entdeckten Glucosinolaten den 200 an. Während bei einigen wenigen Pflanzen nur ein Glucosinolat im Metabolismus vertreten ist, sind bei der Mehrheit 2 bis 5 vorhanden, bei einer Sammlung von verschiedenen Ökotypen von Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. wurden sogar 34 Glucosinolate nachgewiesen (CLARKE 2010).

Es ist nachgewiesen, dass bereits mehr als 430 Unkrautspezies eine Herbizidresistenz aufweisen. Bei mehr als 500 Insektenspezies konnte festgestellt werden, dass sie bereits eine Resistenz mindestens einem Insektizid gegenüber besitzen. In Hinsicht auf den Bedarf an neuen Pestiziden in der konventionellen Landwirtschaft herrscht eine dringende Notwendigkeit für den Ersatz von synthetischen Pestiziden vor (POPOVA & MORRA 2014a).

Den Markterfordernissen entsprechend haben glucosinolathaltige Pflanzen das Potential als Quelle für Komponenten der Schädlingsbekämpfung zu dienen, und damit die synthetischen Komponenten weitestgehend zu ersetzen. Obwohl Glucosinolate in allen Pflanzenteilen gefunden werden, sind sie am stärksten in den Samen konzentriert (BORREK &MORRA 2005). Damit könnte eine neue Ära der Schädlingsbekämpfung eingeleitet werden.

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1.2 Glucosinolate und ihre Wirkung

Untersuchungen, die sich mit der Rolle der Glucosinolate im menschlichen Metabolismus beschäftigten, brachten die Erkenntnis, dass Glucosinolate auch eine pharmakologische Wirkung aufweisen. Die Konsumierung von Lebensmitteln, welche Glucosinolate enthalten, senkt die Wahrscheinlichkeit an Brust- oder Leberkrebs zu erkranken. Glucosinolate sind dafür bekannt, als Antikrebsmittel zu wirken (z.B. Glucoraphanin). Weiters beinhalten sie eine große Menge von natürlichen bioaktiven Verbindungen (HERZALLAH & HOLLEY 2012). Diese Substanzen können als Antioxidanzien wirken, indem sie die freien Radikalen aufnehmen und den oxidativen Stress reduzieren, welcher mitverantwortlich ist für chronische degenerative Krankheiten. Glucosinolate sind außerdem bei Pflanzen auch Komponenten der pflanzlichen Verteidigung, wobei sie als Insektizid, Fungizid, Nematozid und natürliches Herbizid wirken. Gemüsesorten, welche biologisch angebaut wurden, weisen zum Großteil einen höheren Gesamtglucosinolatgehalt auf als Gemüsesorten, welche konventionell angebaut wurden (ROSETTO et al. 2013).

Isothiocyanate, die Hauptabbauprodukt von Glucosinolaten, spielen auch eine wichtige Rolle dabei, Pflanzen vor Krankheiten, verursacht durch Bakterielle- bzw. Pilzinfektionen zu schützen (HERZALLAH &

HOLLEY 2012). Manche Insektenarten konnten bereits Wege entwickeln, um mit den potentiell toxischen Isothiocyanaten der Pflanzen umgehen zu können. Zwei solcher Reaktionswege wurden bereits näher beschrieben, einer davon bei Plutella xylostella (L.). Plutella xylostella hat das Problem gelöst, indem der Schwefel vom Glucosinolat abgespalten wird, und somit die Myrosinase inaktiviert wird. Ein weiteres Beispiel für einen innovativen Lösungsweg wäre Pieris rapae (L.). Hierbei wird das Aglykone in ein Nitril konvertiert durch ein nitrile-specifier protein. Andere Spezialisten wiederum wie Brevicoryne brassicae (L.) und Lipaphis erysimi (Kaltenbach) nutzen ihr eigenes Myrosinase-Glucosinolat System als Verteidigung gegen Räuber. Eine kürzliche Arbeit belegt, dass die Larve von Athalia rosae (Linnaeus) Glucosinolate in ihrer Hämolymphe zu Verteidigungszwecken sammelt (BONES &ROSSITER 2006).

Welche Glucosinolate in einer Pflanze vorkommen ist sortenabhängig. Im Braunsenf (Brassica juncea (L.) Czern.) ist das dominante Glucosinolat Sinigrin (=Sng), welches primär zu Allylisothiocyanaten abgebaut wird (TSAO et al. 2002). Sinalbin (=Snb) wiederum ist das Hauptglucosinolat, welches im Gelbsenf (Sinapis alba L.) vorkommt (HERZALLAH &HOLLEY 2012), das dazugehörige Isothiocyanat ist in diesem Fall 4-Hydroxybenzylisothiocyanat (BORREK & MORRA 2005). Andere Glucosinolate, die in Sinapis alba vorkommen, wären z.B. Sinigrin oder Glucobrassicin (CIUBOTA-ROSIE et al. 2013).

Biosynthetisch gesehen wird Sinalbin von der Aminosäure Tyrosin abgeleitet (BUSKOV et al. 2000).

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Senfpflanzen wachsen seit Jahrtausenden in Asien, Europa und Nordafrika. Der moderne Anbau von Gelbsenf erfolgt aufgrund der Samen, die als Gewürz dienen. Laut der Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAOSTAT) lag die Weltsenfproduktion im Jahr 2009 bei 661.326 Tonnen. Kanada war der größte Produzent mit 208.000 t, im Vergleich dazu produzierte die USA 22.391 t. Die Senfproduktion in Europa lag bei 215.492 t, wobei der Großteil von der Ukraine mit 118.200 t gestellt wurde (CIUBOTA-ROSIE et al. 2013).

1.3 Ziele dieser Masterarbeit

Sinapis alba, auch Gelbsenf genannt, steht in einer langen Tradition als Gewürzpflanze. Trotz dieser Tatsache gibt es noch viele Fragen in Bezug auf die Rolle der Glucosinolate, bzw. deren Abbauprodukte im Metabolismus des Gelbsenfs.

Diese Masterarbeit dient der Entwicklung einer Extraktionsmethode von Glucosinolaten aus den Senfsamen von Sinapis alba und Brassica juncea, und in weiterer Folge auch der quantitativen Analytik von Sinalbin und Sinigrin mittels HPLC (=Hochleistungsflüssigkeitschromatographie), weiters der Entwicklung einer Methode, um Sinalbin mittels semiquantitativer DC (=Dünnschichtchromatographie) detektieren zu können. Zusätzlich hat diese Arbeit als Ziel, die zukünftigen Möglichkeiten von Gelbsenfanbau in der Steiermark zu bewerten.

Die verwendeten österreichischen Samenproben stammen aus verschiedenen, auch zum Teil klimatisch unterschiedlichen Gegenden. Ein Probeanbau von Sinapis alba wurde in der Steiermark (Wundschuh) vorgenommen und dient als Vergleich zu den Hauptanbaugebieten des Gelbsenfs in Niederösterreich und Teilen des Burgenlands.

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2. Material und Methoden 2.1 Material

2.1.1 Probenmaterial und Laborzubehör für HPLC und DC

Pflanzenmaterial

Die Senfsamen stammen von verschiedenen Landwirten und Anbaugebieten und wurden nach dem Erhalt bei einer Temperatur von 4 °C im Dunkeln gelagert. Genaue Details zu den Anbaugebieten sind in Kapitel 3.2 Ergebnisse der Klimadiagramme und Bodenanalysen einsehbar.

Die Abkürzungen in Klammern in Tab. (=Tabelle) 1 wurden für die Beschriftung der HPLC-Proben angewendet. Ergänzend sollte erwähnt werden, dass die Gelbsenfsorte „Accent“ eine hohe Nematodenresistenz besitzt (http://www.saaten-union.de/).

Tabelle 1: österreichische Senfsamenproben mit Erläuterung, von welchem Landwirt welche Sorte zur Verfügung gestellt wurde

Landwirt Senfsorte

Brumen (B) Veronika

Frühwirth (F) Veronika

Haas (H) Veronika

Lehner (L) Veronika

Mayer (M) Veronika

Sailer (S)

Gelbsenf (G): Verschnitt zwischen der Sorte Veronika und Accent

Braunsenf (B): Terrafit

Das gesamte deutsche Probenmaterial wurde von der Versuchsstation Pommritz zur Verfügung gestellt (Tab. 2).

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Tabelle 2: deutsche Senfsamenproben von verschiedenen Sorten, welche bereitgestellt wurden von der Versuchstation Pommritz

Senfsorte

1 Dr. Francks Hohenheimer Gelb

2 Zlata

3 Forum

4 Mikado

5 Severka

6 Comique

7 Sarah

8 Master

9 Pole Position

10 Energy

Geräte

Messzylinder: 10 bis 1000 ml

Bechergläser: 250 bis 600 ml (DURAN) Lineal

Nanomat 4 (CAMAG)

5 µl Kapillarpipetten(CAMAG) DC-Kammer (CAMAG, 20 x 20 cm) DC-Platten:

MERCK Kieselgel 60 , 20 x 10 cm

MERCK Kieselgel 60 mit Fluoreszenzindikator 254 nm, 20 x 10 cm UV-Kammer: CabuVIS (DESAGA-SARSTEDT)

Kamera: Alpha 5000 (SONY)

Navigationsgerät: GoPal P4440 (MEDION) Scanner: LiDE 220 (CANON)

Automatikpipetten

13 Pipettenspitzen: 200 und 1000 µl (SARSTEDT)

HPLC-System: U3000 mit Diodenarray-Detektor (DIONEX) Säule: Säule: Phenomenex Luna HILIC, 100 x 3mm, 3 µm Vials, 1,5 ml RR- Flasche, braun (Markus Bruckner Analysentechnik)

Membranfilter Porengröße 0,45 µm, Durchmesser 50 mm (Markus Bruckner Analysentechnik) Bördelkappe mit Loch (Markus Bruckner Analysentechnik)

Bördelzange

Membranvakuumpumpe (VACUUBRAND) Glasflasche 2,5 l braun

Glastrichter Mörser und Pistill

Trockenschrank (WTB BINDER) Uhrglas

Soxhlet-Apparatur

Ultra Turrax T25 basic (IKA Labortechnik) Vortex Mixer VF2 (JANKE & KUNKEL) Cryoröhrchen (Kunststoff): 10 ml

Wasserbad: julabo U3 (Juchheim Labortechnik)

Ultraschallbad: Bandelin Sonorex (BANDELIN ELECTRONIC) Zentrifuge: Jouan BR4i (JOUAN)

graduierte Röhrchen (Glas): 10 ml (DURAN) Gefriertruhe: Bio Freezer (Forma Scientific)

Laborwaage: Scaltec (Müller-Scherr Laborausrüstungsgesellschaft) Safe Seal Reagiergefäß 2ml („Eppi“) (SARSTEDT)

Advanced Handtuch GRUEN (Tork)

14 2.1.2 Software

Excel 2007 & 2010 Word 2007 & 2010 Chromeleon 6.80 ImageJ 1.48 Paint.NET

Corel Photo Paint X6 (64 Bit) Matlab R2013b

Statistica 6

2.1.3 Chemikalien für HPLC und DC

Aceton: 99,9 % (FISHER SCIENTIFIC) Acetonitril: ≥99,9 % (ROTH)

Ammoniumformiat: ≥ 95 % (ROTH) Ameisensäure: ≥ 98 % (MERCK) Methanol: 99,9 % (ROTH)

2-Propanol: ≥99,8 % (RdH Laborchemikalien) 1-Butanol: ≥99,8 % (ROTH)

Chloroform: ≥99 % (ROTH)

Petrolether: 40 - 60 °C, ACS, ISO (ROTH) Chloroform: ≥99 % (ROTH)

Essigsäureethylester: ≥ 99,9 %

Flüssigstickstoff Liquid N2 (Linde Gas) H2O: entionisiert

Reinstwasser: TKA Reinstwassersystem Micro Pure UV (THERMO SCIENTIFIC)

15 2.1.4 Standards

Sinalbin Kaliumsalz: ≥99,32 %; MG: 463,52 g/mol (ROTH) (-) - Sinigrin Hydrat: ≥99 %; MG: 397,46 g/mol (SIGMA-ALDRICH) Benzylisothiocyanat: 98 %; MG: 149,21 g/mol (SIGMA-ALDRICH) Phenethylisothiocyanat: 99 %, MG: 163,24 g/mol (SIGMA-ALDRICH) Allylisothiocyanat: 95 %, MG: 99,15 g/mol (SIGMA-ALDRICH)

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2.2 Methoden

2.2.1 Extraktion von Sinalbin bzw. Sinigrin aus den Senfsamen

Die für die Extraktion verwendete Methodik wurde entwickelt ausgehend von den Arbeiten

„Glucosinolates, structures and analysis in food“ nach CLARKE 2010, „Comparison of Glucosinolate Profiles in Leaf and Seed Tissues of Different Brassica napus Crops“ VELASCO et al. 2008, „Rapid separation of seed glucosinolates from Camelina sativa by thin layer chromatography“ RUSSO &

REGGIANI 2012, „Sinigrin and sinalbin quantification in mustard seed using high performance liquid chromatography–time-of-flight mass spectrometry“ POPOVA & MORRA 2014b.

Eine Extraktion wurde hierbei immer nach dem gleichen Muster durchgeführt:

- Es wurden ca. 250 mg Samen eingewogen.

- Die Samen kamen für 24 h bei 90 °C in den Trockenschrank.

- Die Samen wurden in Aceton für 48 h überführt zum Entfetten, aufbewahrt wurden die Proben während dieser Zeit im Kühlschrank bei +4 °C.

- Nach diesen 48 h kamen die Samen aus dem Aceton heraus in Uhrgläser, und man ließ sie 5 min stehen, damit das restliche Aceton abdampfen konnte.

- Als nächster Schritt wurden die Samen in Cryoröhrchen mit 2,5 ml 70 % MetOH (=Methanol) geleert und darauffolgend 1 min mit dem Ultra-Turrax zerkleinert (Einstellung 24.000 1/min, Abb. 3). Nach jeder Probe wurde der Ultra-Turrax mit 2,5 ml 70 % MetOH für 15 sec gesäubert. Diese Lösung wurde

danach mit den zerkleinerten Samen vereint. Zur Herstellung des 70% MetOH wurde TKA-Reinstwasser verwendet.

Abbildung 3: Ultra-Turrax, welcher zum Zerkleinern des Probenmaterials diente

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- Das Gesamtvolumen an Extrakt betrug im Cryoröhrchen zum Schluss folglich ca. 5 ml.

- Der gesamte Extrakt in den Cryoröhrchen wurde als nächstes für 10 sec gevortext, um eine gewisse Homogenität des Extraktes während der Extraktion gewährleisten zu können.

- Die Cryoröhrchen kamen danach für insgesamt 30 min in ein 50 °C Wasserbad (Abb. 4). Nach 15 min wurden die Proben für 5 min in einem wassergefüllten Becherglas in ein Ultraschallbad gestellt, daraufhin wurden sie wieder für 15 min im Wasserbad platziert.

Abbildung 4: Wasserbad mit Cryroröhrchen

- Nach diesem Extraktionsschritt wurden die Proben bei 10.000 rpm für 10 min zentrifugiert.

- Der Überstand wurde nach der Zentrifugation in graduierte Röhrchen abdekantiert.

- Das abgesetzte Pellet wurde mit 2,5 ml 70 % MetOH wieder in Suspension gebracht, durch 10 sec andauerndes Vortexen. Diese Arbeitsschritte wurden zwei Mal wiederholt, so, dass insgesamt drei Extraktionen durchgeführt wurden.

- Alle Überstände der Extraktionen wurden in graduierte Röhrchen vereint, wobei nach der letzten Extraktion das Röhrchen mit 70 % MetOH auf 10 ml Gesamtvolumen aufgefüllt wurde. Danach wurden die Röhrchen noch einmal für 10 sec gevortext.

- Die fertigen Extrakte kamen für die weitere Aufbewahrung bis zu den HPLC-Analysen in eine Gefriertruhe (-80 °C).

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Das Auftauen der Proben wurde auch einer einheitlichen Methodik unterzogen, welche sich aus folgenden Schritten zusammensetzte:

- Am Anfang wurden die Proben aus dem Gefrierschrank geholt und 30 min in ein kaltes Wasserbad gestellt, daraufhin 10 sec gevortext.

- Nach diesem Prozedere wurden die Proben über Nacht im Kühlschrank (+4 C°) gelassen.

- Am nächsten Morgen wurden alle Extrakte für 10 sec. noch einmal gevortext und danach für 20 min in ein warmes Wasserbad (ca. 30 °C) gestellt.

- Daraufhin kamen sie für 15 min in ein Ultraschallbad (warmes Wasser 30 °C).

- Anschließend wurden die Proben bei einer Temperatur von 18 °C für 15 min mit 10.000 rpm reinigungszentrifugiert.

- Zum Abschluss wurden 2 ml vom Überstand in Eppis pipettiert. Von diesen 2 ml wurden 250 µl

Extrakt in ein Vial überführt und dort 1:4 verdünnt mit 70 % MetOH (250 µl Extrakt + 750 µl 70 % MetOH). Das Vial mit dessen Inhalt wurde schlussendlich noch einmal gevortext, bevor es für

die HPLC-Untersuchungen verwendet wurde.

19 2.2.2 Dünnschichtchromatographie

Die für die DC (=Dünnschichtchromatographie) verwendeten LM sind Adaptionen aus FUCHS et al.

2011.

Obwohl es einige Bedenken gegenüber der breiten Anwendung von DC gibt (z.B. die geringere chromatographische Auflösung im Vergleich zu einer HPLC sowie die potentielle Oxidation des Analyten, verursacht durch den atmosphärischen Sauerstoff), existieren auch viele Vorteile, die Dünnschichtchromatographien wettbewerbsfähig im Vergleich zu Flüssigchromatographien machen:

- Sie sind einfach durchzuführen.

- Das Equipment ist verhältnismäßig günstig und in der Erhaltung weniger kostenintensiv.

- Die Anzahl verschiedener Proben, die gleichzeitig auf eine einzelne DC-Platte aufgebracht und simultan aufgetrennt werden können, macht die DC häufig schneller als eine Flüssigchromatographie (FUCHS et al. 2011).

Wie bereits beschrieben, ist der Hauptgrund, dass diese ausgewählt wurde wegen ihrer einfachen und schnellen Durchführbarkeit, um die Sinalbinanwesenheit in Extrakten zu bestätigen.

Weitere Versuche beschäftigten sich mit der Herstellung einer Standardreihe verschiedener Konzentrationen von Snb (10 mg/ml; 8 mg/ml; 7,5 mg/ml; 6 mg/ml; 5 mg/ml; 4 mg/ml; 2 mg/ml;

1 mg/ml; 0,5 mg/ml). Die konzentrationsabhängigen Substanzfleckgrößen wurden anschließend ausgemessen und es wurde mittels ImageJ eine Eichgerade erstellt, um die HPLC-Ergebnisse zu validieren.

Die Extrakte von B3 (Abb. 5) und B4 wurden ebenfalls mittels DC aufgetrennt und ihr Sinalbingehalt anhand der Eichgerade bestimmt. Pro Extrakt standen 16 Spots zur Verfügung, um einen MW (=Mittelwert) zu berechnen.

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Abbildung 5: Aufnahme einer DC-Platte mit B3-Extrakt nach dem Trocknen im Brutschrank; der 3 Spot ausgehend vom linken bzw. rechten Rand ist ein Snb-Standard (5mg/ml)

Die Herstellung einer Standardreihe lief nach folgenden Schritten ab:

- Eine DC-Kammer für 20 x 10 cm Folien wurde mit folgendem LM (=Laufmittel): Butanol (60 ml)- Isopropanol (20 ml)-Essigsäure (20 ml)-H2O (entionisiert, kalt, 20 ml) (3:1:1:1) gefüllt, danach wurde die Kammer zum Durchmischen des LM geschwenkt. Die Laufzeit betrug ca. 90 min. Die Laufmittelzusammensetzung wurde dem Buch „Pharmazeutische Biologie - 4 Drogenanalyse II:

Inhaltsstoffe und Isolierungen“ nach STAHL & SCHILD 1981 entnommen.

- Nachdem die DC mit LM gefüllt war, wurde eine Wartezeit von 40 min eingehalten, bis die DC-Kammer mit LM-Dämpfen gesättigt war.

- Das Eppi mit der Stammlösung (10 mg/ml Snb) wurde 15 min lang auf Raumtemperatur (ca. 25 °C) gebracht. Die Stammlösung wurde nach dieser Zeit für 10 sec gevortext und daraufhin die benötigte Konzentration mit 70 % MetOH aus der Stammlösung hergestellt.

- Die neue Konzentrationslösung wurde gevortext und danach konnte mit dem Nanomat (Abb. 6) 5 µl bei jedem Proben-Spot (18 pro Platte) aufgetragen werden. Beidseitig wurden bis zum ersten Spot 1,5 cm Abstand vom Rand eingehalten.

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Abbildung 6: Nanomat 4 mit Kapillardispenser

- Nachdem alle Spots aufgebracht wurden, mussten die Platten 5 min bei Raumtemperatur getrocknet werden, bevor sie in die Kammer überführt wurden. Die DC lief so lange, bis 5 mm unter dem oberen Rand eine gekennzeichnete Ziellinie erreicht war. Eine DC in der UV-Kammer zeigt Abb. 7, wobei die fluoreszierenden Snb-Spots gut erkennbar sind.

Abbildung 7: Aufnahme von einer DC in der UV-Kammer bei einer Wellenlänge von 254 nm

- Zur Detektion der Spots wurden die DC-Platten verschwefelt, wobei die Platten kurz in ein Tauchbad mit einer Zusammensetzung von 480 ml H2O, 480 ml EtOH (=Ethanol) 96 %, 38 ml H2SO4

und 5,04 g gelöstem MnCl2 eingetaucht wurden. Danach wurden die Platten mit Papierhandtüchern

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leicht abgetupft und kamen schlussendlich bei einer Temperatur von 140 °C für 15 min in den Brutschrank

- Nach dem Trocknen wurden die Platten eingescannt (Abb. 8). Verwendet wurden hierbei die Einstellungen: Farbmodus: Graustufen, Auflösung: 600 dpi, Dateiformat: TIFF. Weitere Bildbearbeitungen wurden mit Corel Photo Paint X6 (64 Bit) durchgeführt.

- Die Auswertung der eingescannten DC-Platten erfolgte mittels ImageJ in 8 Bit Graustufen und 1 Bit Binärfarben.

2.2.3 HPLC-Methodik

Grundsätzlich gibt es bei einer HPLC mehrere einsetzbare Trennverfahren, wobei die Adsorbtions- Chromatographie (=Normalphasen-Chromatographie) und die Umkehrphasen-Chromatographie (=Reversed-phase-Chromatographie) jene sind, die in Anlehnung an diese Masterarbeit kurz erklärt werden.

Bei Normalphasenchromatographie ist das Prinzip aus der klassischen Säulenchromatographie oder Dünnschichtchromatographie bekannt: Als stationäre Phase dient ein relativ polares Material mit hoher spezifischer Oberfläche, meistens Silicagel (Kieselgel), aber auch Aluminiumoxid oder Magnesiumoxid. Die mobile Phase ist relativ apolar (Pentan bis Tetrahdyrofuran). Die Trennung

Abbildung 8: eingescannte DC-Platte des 10 mg/ml Sinalbinstandards

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erfolgt durch unterschiedliche Adsorption der verschiedenen Molekülesorten im Gemisch an der stationären Phase. Ein apolares Lösungsmittel (z.B. Hexan) eluiert langsamer als ein stärker polares (z.B. Ether). Faustregel: polare Stoffe werden später eluiert als apolare.

Bei der Umkehrphasen-Chromatographie gilt das Umgekehrte: Die stationäre Phase ist stark apolar.

Die mobile Phase ist relativ polar (Wasser bis Tetrahydrofuran).

Ein polares Lösungsmittel (z.B. Wasser) eluiert langsamer als ein wenig polares (z.B. Acetonitril).

Faustregel: Apolare Stoffe werden später eluiert als polare (MEYER 2009).

Die HPLC-Untersuchungen sind angelehnt an KÜBLER 2010 und der Phenomex Application TN-1157 (http://phx.phenomenex.com). Die genauen Einstellungen während des Verlaufes der Probenanalysen sind in Tabelle 3 ersichtlich.

Tabelle 3: Einstellungen der HPLC während der Analyse der Proben

Flow 0,5ml/min

Injektionsvolumen 4µl

Säulentemperatur 40°C

Probentemperatur 8°C

Druck ca. 44 bar

Als HPLC-System wurde U3000 mit Diodenarray-Detektor verwendet (Abb. 9.), wobei die Säule eine Phenomenex Luna HILIC mit den Dimensionen 100 x 3 mm und einer Porengröße von 3 µm war. Die Laufzeit (=run time) der Proben betrug ca. 20 min, die Standards benötigten ca. 10 min.

Abbildung 9: U3000 (DIONEX)

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Die Hydrophilic-Interaction-Chromatographie (=Hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC)) wurde gewählt, weil sie die Möglichkeit bietet, sehr polare Analyten in einem Normalphasen-Modus zu trennen (MEYER 2009). Ein großer Nachteil der HILIC liegt in ihrem, im Vergleich zur Reversed Phase, langen Equilibrierungszeiten (http://www.knauer.net).

Generell ist zu erwähnen, dass mit HILIC polare Verbindungen, die im Reversed Phase Modus unmöglich zu trennen waren, nun trennbar sind. Die wässrige Phase ist hier ausschlaggebend für eine Trennung von polaren, hydrophilen Verbindungen (http://www.analytik-news.de).

Die eigentlich stationäre Phase ist hierbei Wasser, das auf einer geeigneten Packung adsorbiert wird, wenn die mobile Phase Wasser enthält. Der organische Anteil im Eluenten, z.B. Acetonitril, ist das starke, eluierende Lösungsmittel.

Der Unterschied zur klassischen Normalphasen-Chromatographie besteht darin, dass die mobile Phase wässrig ist. Dennoch werden die apolaren Analyten vor den polaren eluiert (MEYER 2009).

25

3. Ergebnisse

3.1 Ergebnisse der Vorversuche

Die Vorversuche dienten der Optimierung der Methodik und der Klärung von wichtigen Fragestellungen, deswegen sollten diese auch nicht vollkommen unerwähnt bleiben.

Beispiele hierfür wären: Was ist optimale Einwaagemenge der Samen? Wie viele Extraktionen sind sinnvoll bzw. notwendig, um einen Großteil des Sinalbins bzw. Sinigrins aus dem Probenmaterial herauszulösen?

Hochleistungs-Flüssigchromatographie

Zu Beginn der Versuche wurde eine Kombination zweier Laufmittel ausgetestet:

1. Laufmittel A: 15 mM Ammoniumformiat (pH=5,0 mit 98 % Ameisensäure eingestellt) in 90:10 - Acetonitril:Reinstwasser.

2. Laufmittel B: 15 mM Ammoniumformiat (pH=5,0 mit 98 % Ameisensäure eingestellt) in 50:50 - Acetonitril:Reinstwasser.

Beide LM wurden nach dem Lösen des Ammoniumformiates und Einstellen des pH-Wertes mit Ameisensäure durch einen Membranfilter genutscht und wurden danach für die HPLC eingesetzt. Zu Beginn wurde eine Kombination beider LM mit dem Verhältnis 1:1 ausgetestet.

Die Ergebnisse waren jedoch nicht zufriedenstellend. LM B wurde nur in den Vorversuchen verwendet. Da der Einsatz von LM A eine bessere Trennung ergab, wurde in späteren Versuchen auf LM B verzichtet. Für die Hauptversuche wurde 100 % LM A verwendet.

Eine der ersten HPLC-Untersuchungen, durchgeführt am 18.12.2014, diente dazu, die Fragen zu beantworten: Wie viele Extraktionen sind sinnvoll? Wie zerkleinere ich die Proben am besten?

Welchen Einfluss hat die Injektionsmenge auf die Auswertung? Das verwendete Probenmaterial stammte vom Versuchsfeld „Haas“.

Zu Beginn wurden 4 Gelbsenfproben (2 x S1 + 2 x S2) 5-mal extrahiert, jeweils 2 der Proben wurden mit Mörser, Pistill und LN2 aufgearbeitet, die anderen zwei mit Ultra-Turrax (Tab. 2 und 3).

Bei diesen Versuchen lag die Menge an Probenmaterial bei ca. 1 g. Die Samen wurden 24 h getrocknet und danach 48 h in kaltem Aceton aufbewahrt. Als Extraktionsmittel bei allen Proben dienten 10 ml 70 % MetOH.

Der Überstand wurde nach allen Extraktionen für Analysezwecke entnommen, und das Pellet wieder mit 10 ml 70 % MetOH in Suspension gebracht. Die Extrakte wurden für die HPLC 1:10 mit 70 %

26

MetOH verdünnt. Die Einstellungen bzw. die Dauer der Zerkleinerung mit dem Ultra-Turrax war gleich wie bei dem Hauptversuch.

Es waren nach der dritten Extraktion 96.30 % des gesamten Sinalbins von Probe 1, bzw. 94.98 % von Probe 2, extrahiert (Tab. 4). Es wird angenommen, dass bei 5 Extraktionen 100 % des vorhandenen Snb bzw. Sng herausgelöst sind. Diese Annahme war deswegen möglich, weil nur mehr sehr geringe Mengen der gesuchten Glucosinolate bei der 4. bzw. 5. Extraktion herausgelöst wurden.

Im Vergleich dazu sieht man bei den Proben, wo die Zerkleinerung des Samenmaterials mittels Ultra-Turrax geschah, dass der prozentuelle Wert an extrahierten Sinalbin nach der 3. Extraktion

höher liegt, nämlich bei 97,37 % bzw. 97,08 % (Tab. 5).

Tabelle 4: Run-U132: 5-fache Extraktion einer gemörserten Gelbsenfprobe (Probenmaterial „Haas“)

Sample Sample Name

Anteile in x.Extraktion

Summen- anteile bis x.Extraktion

No. in % in %

Sinalbin Sinalbin

10 S1-verd=1/10 in 70%MetOH (gemörsert-1.Extraktion) 71,87 % 71,87 % 11 S1-verd=1/10 in 70%MetOH (gemörsert-2.Extraktion) 17,99 % 89,86 % 12 S1-verd=1/10 in 70%MetOH (gemörsert-3.Extraktion) 6,43 % 96,30 % 13 S1-verd=1/10 in 70%MetOH (gemörsert-4.Extraktion) 2,50 % 98,80 % 14 S1-verd=1/10 in 70%MetOH (gemörsert-5.Extraktion) 1,20 % 100,00 % 15 S2-verd=1/10 in 70%MetOH (gemörsert-1.Extraktion) 62,99 % 62,99 % 16 S2-verd=1/10 in 70%MetOH (gemörsert-2.Extraktion) 23,25 % 86,25 % 17 S2-verd=1/10 in 70%MetOH (gemörsert-3.Extraktion) 8,73 % 94,98 % 18 S2-verd=1/10 in 70%MetOH (gemörsert-4.Extraktion) 3,39 % 98,36 % 19 S2-verd=1/10 in 70%MetOH (gemörsert-5.Extraktion) 1,64 % 100,00 %

Die Aufarbeitung der Brassica juncea-Proben in Tab. 6 und Tab. 7 verlief vollkommen gleich wie die Aufarbeitung des Gelbsenfs in Tab. 4 und Tab. 5. Der Wert des extrahierten Sinigrins liegt hier bei den gemörserten Proben nach der 3. Extraktion bei 90,83 %, bei Probe 1 bzw. 91,34 % bei Probe 2.

27

Tabelle 5: Run-U132: 5-fache Extraktion einer Gelbsenfprobe zerkleinert mit Ultra-Turrax (Probenmaterial „Haas“)

Sample Sample Name

Anteile in x.Extraktion

Summen- anteile bis x.Extraktion

No. in % in %

Sinalbin Sinalbin

31 S1-verd=1/10 in 70%MetOH (ULTRATURRAX-1.Extraktion) 72,46 % 72,46 % 32 S1-verd=1/10 in 70%MetOH (ULTRATURRAX-2.Extraktion) 18,55 % 91,01 % 33 S1-verd=1/10 in 70%MetOH (ULTRATURRAX-3.Extraktion) 6,35 % 97,37 % 34 S1-verd=1/10 in 70%MetOH (ULTRATURRAX-4.Extraktion) 1,98 % 99,34 % 35 S1-verd=1/10 in 70%MetOH (ULTRATURRAX-5.Extraktion) 0,66 % 100,00 % 36 S2-verd=1/10 in 70%MetOH (ULTRATURRAX-1.Extraktion) 72,14 % 72,14 % 37 S2-verd=1/10 in 70%MetOH (ULTRATURRAX-2.Extraktion) 18,88 % 91,02 % 38 S2-verd=1/10 in 70%MetOH (ULTRATURRAX-3.Extraktion) 6,07 % 97,08 % 39 S2-verd=1/10 in 70%MetOH (ULTRATURRAX-4.Extraktion) 2,19 % 99,27 % 40 S2-verd=1/10 in 70%MetOH (ULTRATURRAX-5.Extraktion) 0,73 % 100,00 %

Im Vergleich dazu die Sinigrin-Werte des mit Ultra-Turrax aufgearbeiteten Braunsenfs, welche bei 96,43 % bei Probe 1 und bei 96,36 % bei Probe 2 liegt.

Tabelle 6: Run-U132: 5-fache Extraktion einer gemörserten Braunsenfsenfprobe (Probenmaterial „Sailer“)

Sample Sample Name

Anteile in x.Extraktion

Summen- anteile bis x.Extraktion

No. in % in %

Sinigrin Sinigrin

20 B1-verd=1/10 in 70%MetOH (gemörsert-1.Extraktion) 56,00 % 56,00 % 21 B1-verd=1/10 in 70%MetOH (gemörsert-2.Extraktion) 23,88 % 79,88 % 22 B1-verd=1/10 in 70%MetOH (gemörsert-3.Extraktion) 10,95 % 90,83 % 23 B1-verd=1/10 in 70%MetOH (gemörsert-4.Extraktion) 5,66 % 96,49 % 24 B1-verd=1/10 in 70%MetOH (gemörsert-5.Extraktion) 3,51 % 100,00 % 25 B2-verd=1/10 in 70%MetOH (gemörsert-1.Extraktion) 57,43 % 57,43 % 26 B2-verd=1/10 in 70%MetOH (gemörsert-2.Extraktion) 23,31 % 80,74 % 27 B2-verd=1/10 in 70%MetOH (gemörsert-3.Extraktion) 10,60 % 91,34 % 28 B2-verd=1/10 in 70%MetOH (gemörsert-4.Extraktion) 5,48 % 96,82 % 29 B2-verd=1/10 in 70%MetOH (gemörsert-5.Extraktion) 3,18 % 100,00 %

28

-20 25 50 75 100 125 160

1 - U-133-GLUCOSINOLATE #2 [normalized] UV_VIS_1

mAU

1

Sinigrin - 2,853

Sinalbin - 3,460

WVL:235 nm

1 - Sinigrin 2 - Sinalbin

2,00 2,20 2,40 2,60 2,80 3,00 3,20 3,40 3,60 3,80 4,00 4,20 4,40 4,60 4,80 5,00

-2,00 -1,00 0,00 1,00 2,00

2 - U-133-GLUCOSINOLATE #4 [modified by dionex] UV_VIS_1

mAU

min 2

Sinigrin - 2,910 Sinalbin - 3,500

WVL:235 nm

1 - Sinigrin 2 - Sinalbin

Tabelle 7: Run-U132: 5-fache Extraktion einer Braunsenfprobe zerkleinert mit Ultra-Turrax (Probenmaterial „Sailer“)

Sample Sample Name

Amount anteile in x.Extraktion

Summen- anteile bis x.Extraktion

No. in % in %

Sinigrin Sinigrin

41 B1-verd=1/10 in 70%MetOH (ULTRATURRAX-1.Extraktion) 70,89 % 70,89 % 42 B1-verd=1/10 in 70%MetOH (ULTRATURRAX-2.Extraktion) 18,72 % 89,61 % 43 B1-verd=1/10 in 70%MetOH (ULTRATURRAX-3.Extraktion) 6,82 % 96,43 % 44 B1-verd=1/10 in 70%MetOH (ULTRATURRAX-4.Extraktion) 2,63 % 99,06 % 45 B1-verd=1/10 in 70%MetOH (ULTRATURRAX-5.Extraktion) 0,94 % 100,00 % 46 B2-verd=1/10 in 70%MetOH (ULTRATURRAX-1.Extraktion) 70,50 % 70,50 % 47 B2-verd=1/10 in 70%MetOH (ULTRATURRAX-2.Extraktion) 18,54 % 89,04 % 48 B2-verd=1/10 in 70%MetOH (ULTRATURRAX-3.Extraktion) 7,32 % 96,36 % 49 B2-verd=1/10 in 70%MetOH (ULTRATURRAX-4.Extraktion) 2,59 % 98,95 % 50 B2-verd=1/10 in 70%MetOH (ULTRATURRAX-5.Extraktion) 1,05 % 100,00 %

Bei diesem Run wurde außerdem der Einfluss der Injektionsmenge auf die Auswertung untersucht.

Von einer Probe (S1-U-1Extr.) wurde jeweils einmal 10, 5 und 2 µl eingespritzt. Die Ergebnisse bei 10 und 2 µl waren auf Grund unscharfer Peaks nicht zufriedenstellend. Eine weitere Frage, die mittels der Vorversuche beantwortet werden konnte ist, ob durch das 48 h Entfetten der Samen mittels Aceton auch eine, das Endergebnis relevant beeinflussende Menge Sinalbin, herausgelöst wurde (Abb. 10). Das verwendete Aceton wurde nach 48 h mittels HPLC untersucht (1:10 Verdünnung mit 70 % MetOH).

Abbildung 10: oberes Chromatogramm: Peaks des Mischstandards von Snb und Sng mit einer Konzentration von je 250 µg/ml; unteres Chromatogramm: Aceton mit Snb- und Sng-Peaks

29 Dünnschichtchromatographie

Zu Beginn der Versuche wurde mittels DCs getestet, welches LM am besten für die Sinalbindetektion geeignet ist (Tab. 8).

Tabelle 8: Zusammensetzung der Laufmittel

Laufmittelkomponenten Mischungsverhältnis

Hexan-Chloroform 3:2

Petroleumether-Chloroform 9:1

Ethylacetat-Wasser (WEK)-Ameisensäure 60:35:18

Butanol-Isopropanol-Essigsäure-Wasser (WEK) 3:1:1:1

Die Legende zu den Abkürzungen der Standards auf den DCs steht in Tab. 9. M1 (=1. Methode) und M2 (=2. Methode) stehen für die Art und Weise der versuchten Extraktion. Die erste Methode war angelehnt an RENUKA DEVI & BERLA THANGAM 2010, und die zweite Methode an „Glucosinolates, structures and analysis in food“ nach CLARKE 2010.

Tabelle 9: Legende für DC

Abkürzung Substanzen (gelöst in 70% EtOH)

A Allylisothiocyanat (10 mg/ml)

B Benzylisothiocyanat (10 mg/ml)

P Phenethylisothiocyanat (10mg/ml)

Sb Sinalbin (10mg/ml)

Sa Extrakt aus Senfsamen gewonnen mittels Soxleth

MM Estragon Senf(Mautner Markhof) (10 mg/ml)

M1, Met1 siehe Erklärung

M2, Met2 siehe Erklärung

Eine DC-Platte nach der Verschwefelung für die als LM Hexan-Chloroform verwendet wurde zeigt Abb. 11. Die Startpunkte (von links beginnend A, B, P, Sb, Sa, MM und Met2) bei einigen der aufgebrachten Substanzen sind sichtbar, hingegen lassen sich ansonsten weder bei den Standards noch bei den Proben zuordnungsbare Substanzflecken auf der Laufmittelstrecke erkennen.

Bei Sb und MM wurde mit Bleistift ein leicht ausgeprägter Substanzfleck markiert, dies geschah auch bei den späteren Abbildungen 13 und 14.

Dieses Laufmittelgemisch produzierte keine auswertbaren Substanzflecken auf den DC-Platten (Abb.

11, 12 und 13).

30

Abbildung 11: DC mit Hexan-Chloroform (3:2) mit cm-Maßstab am unteren Bildrand

Abbildung 12: DC mit Petroleumether-Chloroform (9:1) mit cm-Maßstab am unteren Bildrand

31

Abbildung 13: Ethylacetat-Wasser (WEK)-Ameisensäure (60:35:18) mit cm-Maßstab am unteren Bildrand

Eine DC-Platte mit gut erkennbaren Spots der Snb-Standards ist auf Abb. 14 sichtbar. Auf gleicher Höhe der Snb-Standards sind auch Substanzflecken bei Met 2 und Sa erkennbar. Bei Methode 1 hingegen konnte kein Snb im Extrakt nachgewiesen werden. Auf Grund der Tatsache, dass das Butanol-LM die einzig verwertbaren Ergebnisse brachte, wurde es auch für alle weiteren DC eingesetzt.

Abbildung 14: Butanol-Isopropanol-Essigsäure-Wasser (WEK) (3:1:1:1) mit cm-Maßstab am unteren Bildrand

32

Brumen Frühwirth Haas Lehner Mayer Sailer (G) Sailer (B)

Anbaudatum: 31.03.2014 18.04.2014 10.03.2014 01.04.2014 01.04.2014 29.03.2014 29.03.2014 Erntedatum: 07.08.2014 11.08.2014 24.07.2014 14.07.2014 20.07.2014 09.08.2014 09.08.2014 Ertrag: 1000 kg/ha 750 kg/ha 1280 kg/ha 800 kg/ha 850 kg/ha Veronika: 1170 kg/ha 840 kg/ha

Accent: 1220 kg/ha Mittelwert: 1195 kg/ha Tabelle 10: Anbaudaten der österreichischen Versuchsgebiete

3.2 Ergebnisse der Klimadiagramme und Bodenanalysen

Die in den folgenden Klimadiagrammen verwendeten Daten wurden von der ZAMG zur Verfügung gestellt. Die GPS-Koordinaten der Felder wurden mittels des Navigationsgerätes (GoPal P4440) ermittelt.

Details wie das Anbaudatum, Erntedatum oder der Ertrag der Versuchsfelder sind aus Tab. 10 zu entnehmen. Der höchste Ernteertrag liegt bei 1280 kg/ha („Haas“), und der niedrigste bei 750 kg/ha („Frühwirth“). Das Anbaudatum bzw. das Erntedatum unterschied sich von Versuchsfläche zu Versuchsfläche. Allgemein lässt sich sagen, dass der Anbau des Gelbsenfs bei den österreichischen Versuchsfeldern zwischen Mitte März bis Mitte April, und die Ernte zwischen Mitte Juli und Mitte August stattgefunden hat.

Beim Vergleich zwischen den Sorten „Veronika“ und „Accent“, welche nebeneinander angebaut wurden, lässt sich nur ein minimaler Ertragsunterschied ausmachen (ca. 50 kg).

Die Analyse der entnommenen Bodenproben wurde vom Referat Boden- u. Pflanzenanalytik in Haidegg/Stmk durchgeführt. Bei Betrachtung der Bodenanalysen kann man erkennen, dass die Versuchsflächen zum Großteil ausreichend mit Phosphor, Kalium und Magnesium versorgt sind (Abb.

15, 17, 19, 21, 23 und 25).

Ausnahmen bilden hier die Versuchsflächen „Frühwirth“ und „Lehner“, bei welchen ein niedriger Wert für den pflanzenverfügbaren Phosphor gemessen wurde. Außerdem wurde bei der Versuchsfläche „Frühwirth“ auch der Wert des pflanzenverfügbaren Kaliums als niedrig eingestuft.

Die erstellten Klimadiagramme zeigen die mittlere Temperatur (C°) und den summierten Niederschlag von den Monaten Jänner bis August 2014 in den Anbaugebieten (Abb. 16, 18, 20, 22, 24 und 26). Bei den Versuchsflächen in Niederösterreich und dem Burgenland erstreckte sich die Summe des Niederschlags in den vorher genannten Monaten von 360 mm bis 495 mm. Der meiste Niederschlag fiel im Bereich des Versuchsfeldes „Brumen“ mit 696 mm, der wenigste mit 360 mm beim Versuchsfeld „Sailer“.

33

00 10 20 30 40 50 60 70

00 20 40 60 80 100 120 140

J F M A M J J A

Flughafen Graz

N in mm T in C°

Bei genauerer Betrachtung der Temperaturkurven sieht man, dass sie sich jeweils nur gering zwischen den einzelnen Anbauflächen unterscheiden.

Brumen

GPS-Koordinaten des Feldes: B: 46° 56' 31" N L: 15° 27' 29" E

Abbildung 16: Klimadiagramm ausgehend von den Daten der Wetterstation (Flughafen Graz) im Zeitraum von Jänner bis August 2014

Abbildung 15: Ergebnis der Bodenanalyse vom 17.07.2014

34

00 10 20 30 40 50 60 70

00 20 40 60 80 100 120 140

J F M A M J J A

Gumpoldskirchen

N in mm T in C°

Frühwirth

GPS-Koordinaten des Feldes: B: 47° 56' 17" N, L: 16° 18' 22" E

Abbildung 18: Klimadiagramm ausgehend von den Daten der Wetterstation (Gumpoldskirchen) im Zeitraum von Jänner bis August 2014

Abbildung 17: Ergebnis der Bodenanalyse vom 11.07.2014

35

00 10 20 30 40 50 60 70

00 20 40 60 80 100 120 140

J F M A M J J A

Poysdorf (Ost)

N in mm T in C°

Haas

GPS-Koordinaten des Feldes: B: 48° 44' 15" N, L: 16° 39' 24" E

Abbildung 19: Ergebnis der Bodenanalyse vom 11.07.2014

Abbildung 20: Klimadiagramm ausgehend von den Daten der Wetterstation (Poysdorf (Ost)) im Zeitraum von Jänner bis August 2014

36

00 10 20 30 40 50 60 70

00 20 40 60 80 100 120 140

J F M A M J J A

Andau

N in mm T in C°

Lehner

GPS-Koordinaten des Feldes: B: 47° 50' 6" N, L: 16° 53' 57" E

Abbildung 21: Ergebnis der Bodenanalyse vom 11.07.2014

Abbildung 22: Klimadiagramm ausgehend von den Daten der Wetterstation (Andau) im Zeitraum von Jänner bis August 2014

37

00 10 20 30 40 50 60 70

00 20 40 60 80 100 120 140

J F M A M J J A

Gänserndorf

N in mm T in C°

Mayer

GPS-Koordinaten des Feldes: B: 48° 17' 35" N, L: 16° 33' 54" E

Abbildung 23: Ergebnis der Bodenanalyse vom 11.07.2014

Abbildung 24: Klimadiagramm ausgehend von den Daten der Wetterstation (Gänserndorf) im Zeitraum von Jänner bis August 2014

38

00 10 20 30 40 50 60 70

00 20 40 60 80 100 120 140

J F M A M J J A

Horn

N in mm T in C°

Sailer

GPS-Koordinaten des Feldes: B: 48° 40' 18" N, L:15° 54' 53" E

Abbildung 26: Klimadiagramm ausgehend von den Daten der Wetterstation (Horn) im Zeitraum von Jänner bis August 2014

Abbildung 25: Ergebnis der Bodenanalyse vom 11.07.2014

39

3.3 Ergebnisse der Hauptversuche

3.3.1 Ergebnisse der HPLC

Die Bestimmung des Sinalbins, bzw. Singringehaltes wurde, wie bereits in „Material und Methode“

beschrieben, durchgeführt.

Als Standards wurde jeweils Mischstandards von Snb und Sng genommen, mit den Konzentrationen 2000 µg/ml, 1500 µg/ml, 1000 µg/ml, 750 µg/ml, 500 µg/ml, 250 µg/ml und 100 µg/ml (LEE 2005).

Die österreichischen Proben wurden 2-mal untersucht: am 29.01.2015 und 12.05.2015. Dies diente dazu, eine Zu- bzw. Abnahme des Sinalbingehaltes im Probenmaterial festzustellen. Die in dieser Arbeit dargestellten Ergebnisse der HPLC wurden gerundet, für weitere Berechnungen wurden jedoch die Originalwerte herangezogen.

3.3.1.1 Sinalbin- bzw. Sinigringehalt des österreichischen Senfs (Sinapis alba und Brassica juncea)(Run-138)

Die österreichischen Proben wurden während des HPLC-Runs 138 untersucht. Die Ergebnisse der Sinigrinbestimmung von dem Probenmaterial „Sailer“ lassen sich aus Tab. 11 herauslesen. Im Durchschnitt enthält der untersuchte Braunsenf 3,75 % Sinigrin.

Tabelle 11: Ergebnis der Messung des Sinigringehaltes bei Braunsenf (Probe „Sailer“) die Gewichtsangaben(*) sind auf das FG (=Frischgewicht) bezogen

Sample Sample Name Sinigrin

No. Gew.% * Gew.% * µmol/g FG

Einzelwert MW S.D.(%) Einzelwert

16 Probe 1S-B 3,935 3,75 3,47% 94,71

17 Probe 2S-B 3,796 91,38

21 Probe 3S-B 3,596 86,57

22 Probe 4S-B 3,768 90,70

23 Probe 5S-B 3,663 88,18

40

Die Ergebnisse der Sinalbinuntersuchungen aus den österreichischen Anbaugebieten sind in Tab. 12 aufgelistet. Den höchsten durchschnittlichen Sinalbingehalt weist das Probenmaterial „Brumen“ mit 7,20 % auf, gefolgt von „Sailer“ mit 6,79 %. Der niedrigste durchschnittliche Sinalbingehalt wurde im Probenmaterial „Frühwirth“ mit 4,11 % gemessen.

Tabelle 12: Ergebnisse der Messungen des Sinalbingehaltes beim Gelbsenf (Ö) die Gewichtsangaben(*) sind auf das FG (=Frischgewicht) bezogen

Sample Sample Name Sinalbin

No. Gew.% * Gew.% * µmol/g FG

MW S.D.(%) Einzelwert

25 Probe 1S-G 7,152 6,79 3,80% 154,30

26 Probe 2S-G 6,527 140,82

27 Probe 3S-G 6,958 150,11

28 Probe 4S-G 6,621 142,83

29 Probe 5S-G 6,692 144,38

32 Probe H1 5,630 6,13 5,95% 121,46

33 Probe H2 6,035 130,21

34 Probe H3 6,414 138,38

35 Probe H4 6,553 141,37

36 Probe H5 6,013 129,72

38 Probe L1 6,803 5,32 15,68% 146,77

39 Probe L2 5,119 110,43

40 Probe L3 4,824 104,07

41 Probe L4 4,910 105,93

42 Probe L5 4,957 106,94

45 Probe M1 4,155 4,19 12,44% 89,64

46 Probe M2 4,567 98,53

47 Probe M3 4,462 96,27

48 Probe M4 3,295 71,08

49 Probe M5 4,447 95,95

51 Probe F1 3,979 4,11 3,93% 85,83

52 Probe F2 4,010 86,52

53 Probe F3 4,006 86,44

54 Probe F4 4,210 90,83

55 Probe F5 4,347 93,78

41

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0

-50 100 200 300 450

U-138-GLUCOSINOLATE #10 Standard Sinigrin + Sinalbin, je 250 µg/ml SUB_UV_VIS_2_Methanol_70__UV_VIS_2 mAU

min

1 - 2,130 Sinigrin - 2,55 Sinalbin - 3,01 4 - 4,210 5 - 5,210 6 - 5,427

230 nm-230 nm

1 2

57 Probe B1 7,180 7,20 1,43% 154,90

58 Probe B2 7,151 154,28

59 Probe B3 7,089 152,94

60 Probe B4 7,362 158,82

61 Probe B5 7,235 156,08

3.3.1.2 Chromatogramme des Runs-138

Die unter diesem Punkt gezeigten Daten wurden durch die HPLC-Untersuchungen gewonnen, wobei die Chromatogramme mittels Chromeleon erstellt wurden. Die Chromatogramme dienen unter anderem der grafischen Darstellung der im Punkt 3.3.1.1 beschriebenen Daten.

Die Standard-Peaks, wobei der erste Peak Sinigrin, der zweite Sinalbin zuzuordnen ist, sind in Abb. 27 sichtbar. Der negative Peak, kurz nach dem Einspritzen, bei 1 min 15 sec, lässt sich auf das verwendete 70 % MetOH zurückführen. Die Proben-Peaks zeigen die Abb. 28 bis 30, wobei die zwei letzteren Chromatogramme von aufgearbeitetem Gelbsenf stammen und das Erste von aufgearbeitetem Braunsenf. Beim Braunsenfchromatogramm ist Sinigrin eindeutig als Hauptglucosinolat erkennbar.

Abbildung 27: Peaks der Standards (Snb und Sng) bei einer Konzentration von 250 µg/ml

42

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0

-20 50 100 150 200 250

U-138-GLUCOSINOLATE #13 Probe 1S-B SUB_UV_VIS_2_Methanol_70__UV_VIS_2

mAU

min

Sinigrin - 2,54 Sinalbin - 3,04 3 - 3,373 4 - 4,560 5 - 5,000 6 - 5,267 7 - 5,417 8 - 5,870

230 nm-230 nm

1 2

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0

-50 100 200 300 400 500 600 700

U-138-GLUCOSINOLATE #25 [modified by dionex] Probe 1S-G SUB_UV_VIS_2_Methanol_70__UV_VIS_2

mAU

min

1 - 2,770 Sinalbin - 2,99 3 - 3,387 4 - 3,813 5 - 4,593 6 - 5,073 7 - 5,427 8 - 6,797 9 - 8,433

230 nm-230 nm

1 2

Abbildung 28: Chromatogramm der aufgearbeiteten Braunsenfprobe („Sailer 1“)

Abbildung 29: Chromatogramm der aufgearbeiteten Gelbsenfprobe („Sailer 1“)

43

U-138-GLUCOSINOLATE #10 Standard Sinigrin + Sinalbin, je 250 µg/ml : Sinigrin 100% at 2.55 min

-10,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0

210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340

%

nm 227.9

320.4

Sinigrin 100% at 2.54 min: 999.91

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0

-50 100 200 300 400 500 600

U-138-GLUCOSINOLATE #32 [modified by dionex] Probe H1 SUB_UV_VIS_2_Methanol_70__UV_VIS_2

mAU

min

1 - 2,757 Sinalbin - 2,98 3 - 3,377 4 - 4,580 5 - 5,087 6 - 5,180 7 - 5,347 8 - 5,447 9 - 5,640 10 - 8,370

230 nm-230 nm

1 2

Die Abb. 31 stellt das Absorbtionsspektrum im Maximum des Peaks dar, wobei die schwarze Linie die Probe 1S-B (RT: 2,54 min) darstellt, und die rote Linie den Sinigrin Peak des Mischstandards (RT: 2,55 min) mit einer Konzentration von 250 µg/ml.

Abbildung 31: Spektren im Maximum des Peaks mit ca. einer RT von 2,54 min Abbildung 30: Chromatogramm der aufgearbeiteten Gelbsenfprobe („Haas 1“)

44

3.3.1.3 Sinalbingehalt des deutschen Gelbsenfs (Sinapis alba)(Run-140)

Die Ergebnisse der Sinalbinanalyse der deutschen Proben sind in Tab. 13 und 14 festgehalten. Den höchsten durchschnittlichen Sinalbingehalt mit 6,37 % des Frischgewichtes wies die Sorte „Pole Position“ auf. Der geringste durchschnittliche Sinalbingehalt wurde in der Sorte „Dr. Francks Hohenheimer Gelb“ mit 5,08 % festgestellt.

Tabelle 13: Ergebnisse der Messungen des Sinalbingehaltes beim Gelbsenf (D) die Gewichtsangaben(*) sind auf das FG (=Frischgewicht) bezogen

Sample

Sample

Name Sinalbin

No. HPLC

Nummer intern

Probe Nr.

Pommritz Gew.% * Gew.% * µmol/g FG

Mittelwert S.D.(%) Einzelwert

19 Probe 1D-1

1

5,102 5,08 1,67% 110,06

20 Probe 1D-2 5,063 109,23

21 Probe 1D-3 5,131 110,69

22 Probe 1D-4 5,166 111,46

23 Probe 1D-5 4,946 106,71

25 Probe 2D-1

2

5,657 5,89 2,62% 122,04

26 Probe 2D-2 5,851 126,23

27 Probe 2D-3 5,898 127,25

28 Probe 2D-4 5,959 128,55

29 Probe 2D-5 6,076 131,07

32 Probe 3D-1

3

6,345 6,23 3,12% 136,88

33 Probe 3D-2 6,091 131,41

34 Probe 3D-3 5,975 128,90

35 Probe 3D-4 6,318 136,30

36 Probe 3D-5 6,444 139,02

38 Probe 4D-1

4

5,635 5,62 2,41% 121,56

39 Probe 4D-2 5,825 125,66

40 Probe 4D-3 5,506 118,78

41 Probe 4D-4 5,650 121,88

42 Probe 4D-5 5,488 118,41

44 Probe 5D-1

5

5,481 5,63 3,89% 118,24

45 Probe 5D-2 5,370 115,85

46 Probe 5D-3 5,769 124,47

47 Probe 5D-4 5,591 120,63

48 Probe 5D-5 5,914 127,60

45

Tabelle 14: Fortsetzung der Ergebnisse der Messungen des Sinalbingehaltes beim Gelbsenf (D) die Gewichtsangaben(*) sind auf das FG (=Frischgewicht) bezogen

Sample Sample Name Sinalbin

No. HPLC Nummer intern

Probe Nr.

Pommritz Gew.% * Gew.% * µmol/g FG

Mittelwert S.D.(%) Einzelwert

51 Probe 6D-1

6

5,561 5,74 1,89% 119,97

52 Probe 6D-2 5,779 124,68

53 Probe 6D-3 5,790 124,91

54 Probe 6D-4 5,846 126,12

55 Probe 6D-5 5,745 123,94

57 Probe 7D-1

7

5,590 5,86 3,23% 120,60

58 Probe 7D-2 6,125 132,15

59 Probe 7D-3 5,854 126,28

60 Probe 7D-4 5,880 126,86

61 Probe 7D-5 5,860 126,42

63 Probe 8D-1

8

5,677 6,05 3,79% 122,47

64 Probe 8D-2 6,306 136,05

65 Probe 8D-3 6,057 130,67

66 Probe 8D-4 6,086 131,30

67 Probe 8D-5 6,117 131,97

70 Probe 9D-1

9

6,404 6,37 2,52% 138,16

71 Probe 9D-2 6,181 133,35

72 Probe 9D-3 6,238 134,59

73 Probe 9D-4 6,480 139,80

74 Probe 9D-5 6,563 141,59

76 Probe 10D-1

10

5,570 5,64 1,82% 120,17

77 Probe 10D-2 5,560 119,95

78 Probe 10D-3 5,663 122,18

79 Probe 10D-4 5,605 120,92

80 Probe 10D-5 5,811 125,37