Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchung der Thrombingenerierung des Hundes
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin - Doctor medicinae veterinariae -
(Dr. med. vet.)
vorgelegt von Christina Witten
Rathenow
Hannover 2011
Wissenschaftliche Betreuung: Univ.- Prof. Dr. R. Mischke (Klinik für Kleintiere)
1. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. R. Mischke 2. Gutachter: Univ.- Prof. Dr. G. Breves
Tag der mündlichen Prüfung: 21.11.2011
Meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
Seite Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
1. Einleitung 1
2. Literaturübersicht 3
2.1. Struktur und Entstehung von Prothrombin und Thrombin 3
2.2. Zell-basiertes Modell der Gerinnung 4
2.3. Biologische Funktionen des Thrombins 5
2.4. Geschichte der Messung der Thrombingenerierung in vitro 6
2.4.1. Etablierung der ersten Methode 6
2.4.2. Einführung einer chromogenen Methode 7
2.4.3 Fluorogene Methode 8
2.4.3.1. Etablierung der Methode 8
2.4.3.2. Substratauswahl 9
2.4.3.3. Innerer Filtereffekt und Substratverbrauch 9 2.4.3.4. Korrektur des inneren Filtereffekts und des Substratverbrauchs 10 2.4.3.5. Umrechnung der Fluorescence Units/min in nmol/l 10 2.4.3.6. Korrektur des α2-Makroglobulin-Thrombin-Komplex 11
2.4.4. Das Thrombogramm 11
2.4.5. Intra-assay und inter-assay Variabilität 11 2.4.6. Intra- und inter-individuelle Variabilität 12
2.5. Einflussfaktoren auf die Thrombingenerierung 13
2.5.1. Gefrierkonservierung 13
2.5.2. Tissue Factor-Konzentration 13
2.5.3. Phospholipidkonzentration 14
2.5.4. Thrombomodulin 14
2.5.5. Verschiedener Aktivitäten der pro- und antikoagulatorischen
Faktoren 15
2.5.6. Corn Trypsin Inhibitor 16
2.5.7. Präanalytische Bedingungen 18
2.5.8. Lagerungsdauer 20
2.5.9 Plättchenreiches Plasma zur Untersuchung der Thrombingenerierung 20 2.5.10. Abhängigkeit der Parameter der Thrombingenerierung vom Alter 21 2.6. Einsatzmöglichkeiten der Thrombingenerierung in der Humanmedizin 21
2.6.1. Hämophilie A 21
2.6.2. Substitution von Faktorkonzentraten und FEIBA 22
2.6.3. Entzündungen 24
2.6.4. Thrombosen 24
2.6.5. Einfluss verschiedener Antikoagulanzien auf die
Thrombingenerierung 26
2.6.5.1. Niedermolekulare und unfraktionierte Heparine 26
2.6.5.2. Vitamin-K Antagonisten 27
2.6.5.3. Thrombozytenaggregationshemmer 27
2.6.5.4. Direkte Thrombin- und FXa-Inhibitoren 28
2.7. Thrombingenerierung des Hundes 29
2.7.1. Thrombingenerierung gesunder Hunde 29
2.7.2. In vitro Heparin Sensitivität der Thrombingenerierung 30 2.7.3. Pharmakodynamischer Effekt des Heparins auf die
Thrombingenerierung 30
3. Material, Tiere und Methoden 31
3.1. Material 31
3.1.1. Geräte und Bezugsquellen 31
3.1.2. Reagenzien, Verbrauchsmaterial und Bezugsquellen 31
3.2. Versuchsplan 33
3.2.1. Methodischer Vorversuch 33
3.2.2. Erstellung von Referenzwerten 34
3.2.3. Untersuchung der Thrombingenerierung bei Hunden mit ausgewählten
Erkrankungen 34
3.3. Tiere 35
3.3.1. Klinisch gesunde Hunde 35
3.3.2. Patienten 36
3.4. Methode 37
3.4.1 Vorbereitung des CTI s 37
3.4.2. Probengewinnung 37
3.4.3. Probenbehandlung 38
3.5. Labormethoden 39
3.5.1. Fluorogene Bestimmung der Thrombingenerierung nach der
CAT-Methode 39
3.5.1.1. Prinzip 39
3.5.1.2. Reagenzien 39
3.5.1.3. Testdurchführung 39
3.5.2. Weitere gerinnungsanalytische Untersuchungen 42
3.6. Statistische Auswertung 42
4. Ergebnisse 44
4.1. Ergebnisse des methodischen Vorversuchs 44
4.1.1. Gesunde Hunde 44
4.1.2. Hämophilie A-Hunde 51
4.2. Erstellung von Referenzwerten für gesunde Hunde 53
4.3. Thrombingenerierung bei hämophilen Hunden 57
4.3.1. Hämophilie A 57
4.3.2. Hämophilie B 62
4.4. Thrombingenerierung bei Hunden mit entzündlichen Erkrankungen 63 4.5. Thrombingenerierung bei Hunden mit Morbus Cushing 69 4.6. Thrombingenerierung bei Hunden mit tumorösen Erkrankungen 74
4.6.1 Lymphom 74
4.6.2. Histiozytäres Sarkom 79
4.6.3. Akute lymphatische Leukämie 84
5. Diskussion 89
6. Zusammenfassung 98
7. Summary 101
8. Literaturverzeichnis 104
9. Tabellarischer Anhang 140
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
Abb. = Abbildung
AMC = Amino-4-methylcumarin
AP = Alkalische Phosphatase
APC = Aktiviertes Protein C
APTT = Aktivierte partielle Thromboplastinzeit
AUC = Fläche unter der Kurve
bzw. = Beziehungsweise
ca. = Circa
CAT = Calibrated automated Thrombography
CTI = Corn Trypsin Inhibitor
Da = Dalton
EDTA = Ethylendiamentetraessigsäure
ETP = Endogenes Thrombinpotential
F = Faktor, beispielsweise FVIII
FEIBA = Factor eight inhibitor bypassing activity
g = Erdbeschleunigung (1 g = 9,81 m/s2)
INR = International Normalized Ratio
I.E. = Internationale Einheiten
kcat = Katalytische Konstante
kg = Kilogramm
Km-Wert = Michaelis-Menten-Konstante
Max = Maximum
Min = Minimum
min = Minute
mol = Mol
µg = Mikrogramm
µl = Mikroliter
µmol = Mikromol
ml = Milliliter
n = Anzahl der Tiere
nmol = Nanomol
Nr. = Nummer
p = Irrtumswahrscheinlichkeit
PFP = Plättchenfreies Plasma
PL = Phospholipide
pmol = Picomol
PPP = Plättchenarmes Plasma
PRP = Plättchenreiches Plasma
PT = Prothrombinzeit
® = Eingetragenes Warenzeichen
RFU = „raw fluorescence units“
rVIIa = Rekombinanter Faktor VII
sec. = Sekunden
Tab. = Tabelle
TF = Tissue factor; Gewebethromboplastin
TG = Thrombingenerierung
TGA = Thrombin Generierung Assay
TM = Thrombomodulin
TZ = Thrombinzeit
UFH = Unfraktioniertes Heparin
vWF = Von Willebrand Faktor
x = Arithmetischer Mittelwert
z.B. = Zum Beispiel
1. Einleitung
Die Messung der Thrombingenerierung (TG) in vitro ist eine alte und seit langem bekannte hämostaseologische Technik. Das initiale Konzept des Testverfahrens wurde bereits 1953 von zwei britischen Arbeitsgruppen beschrieben (MACFARLANE & BIGGS 1953; PITNEY &
DACIE, 1953). Über einen langen Zeitraum hinweg fand die Methodik allerdings kaum Einzug in den Laboralltag, da die früheren koagulometrischen Messtechniken extrem zeitaufwendig und personalintensiv waren. Somit blieb diese Messtechnik für viele Jahre entsprechend spezialisierten Forschungslaboratorien vorbehalten (HEMKER & BÉGUIN 2000a, DARGAUD et al. 2009).
Erst die Weiterentwicklung des Tests in den 1980er Jahren (HEMKER et al. 1986) und vor allem die Einführung der „Calibrated automated Thrombography“ (CAT)-Methode im Jahre 2002 (HEMKER et al. 2002), basierend auf der kontinuierlichen Überwachung der Hydrolyserate eines fluorogenen Substrat, brachte den entscheidenden Fortschritt, um die TG im plättchenreichen oder -armen Plasma messen und graphisch darstellen zu können. Damit ist die Methode zumindest für spezialisierte klinische Labors attraktiv.
In der Humanmedizin werden inzwischen seit einigen Jahren intensiv die Einsatzmöglichkeiten der TG erforscht. Einige Untersuchungen zum Einfluss eines Faktor (F) VIII-Defizits auf die TG haben gezeigt, dass an Hämophilie A erkrankte Patienten zwar eine veränderte TG aufweisen, aber die Korrelation zum klinischen Phänotyp auch nicht besser gelingt, als mit der klassischen Einzelfaktoranalyse (BELTRAN-MIRANDA et al. 2005, BARROWCLIFFE 2006). Andere Studien beschreiben eine signifikante Korrelation zwischen der FVIII-Aktivität und dem endogenen Thrombinpotential (ETP), dem Peak, der Zeit bis zum Peak und dem klinischen Ausprägungsgrad der Hämophilie A und B (CHANTARANGKUL et al. 2003; DARGAUD et al. 2005a). In weiteren humanmedizinischen Arbeiten wird ein gesteigertes Thromboserisiko bei einem erhöhten endogenen Thrombinpotential beschrieben (WIELDERS et al. 1997; ROSING et al. 1997;
KYRLE et al. 1998; EICHINGER & KYRLE 2007). Weiterhin gibt es Untersuchungen, welche die TG im Rahmen von septischen Krankheitsverläufen untersuchen und dabei keine Erhöhung des ETP nachweisen konnten, allerdings eine deutliche Verlängerung der Latenzzeit und der Zeit bis zum Peak (COLLINS et al. 2006; PETROS et al. 2011).
Des Weiteren liegen Untersuchungen vor, welche die Auswirkung von Heparin, oralen Antikoagulanzien und direkten Thrombininhibitoren auf die Parameter der TG des Menschen darstellen (BOSTRÖM et al. 2004; AL DIERI et al. 2004; BROPHY et al. 2006; ALTMAN et al. 2007). Zur TG des Hundes liegt gegenwärtig nur eine Studie vor (ALLEGRET et al.
2011), welche die Auswirkung der Heparingabe auf die TG untersucht hat. Der geringe Kenntnisstand zu den Verhältnissen der TG beim Hund gab den Anlass für die vorliegende Arbeit. Die Messung der TG erfolgte in der vorliegenden Arbeit nach der von HEMKER et al.
(2002) entwickelten CAT-Methode. Zunächst wurden methodische Aspekte, wie der mögliche Einfluss der Gefrierkonservierung auf die TG untersucht. Dafür wurde das Plasma von gesunden Hunden frisch und nach vierwöchiger Gefrierkonservierung gemessen.
Außerdem wurde der Einfluss des Corn Trypsin Inhibitors (CTI), welcher in der Humanmedizin zur Ausschaltung der Kontaktaktivierung bei der Untersuchung hämophilen Plasmas zugefügt wird (VAN VEEN et al. 2008a), auf canines Plasma evaluiert. In der Folge sollten Referenzwerte durch die Untersuchung eines größeren Kollektivs gesunder Hunde erarbeitet werden. Schließlich sollten die Auswirkungen eines FVIII- und FIX-Defizits, von entzündlichen und tumorösen Erkrankungen und dem Morbus Cushing-Syndrom auf die Parameter der TG beim Hund untersucht werden.
2. Literaturübersicht
2.1. Struktur und Entstehung von Prothrombin und Thrombin
Die Vorstufe des Thrombins stellt das Zymogen Prothrombin (FII) dar (LICARI &
KOVACIC 2009). Prothrombin hat ein Molekulargewicht von 72000 Dalton (Da) und besteht aus einer einzelnen Polypeptidkette (LICARI & KOVACIC 2009). Der FII wird auf ribosomaler Ebene vor allem von Hepatozyten synthetisiert, ist als Proenzym biologisch inaktiv und zirkuliert frei im Blut (HEMKER et al. 1976). Auch das Gehirn, das Diaphragma, die Nieren, die Milz und das Intestinum sind zur Synthese von FII befähigt, allerdings im Vergleich zur Leber in einem limitierten Umfang (JENNY et al. 2006). Die hepatogene Synthese von FII, FVII, FIX und FX ist Vitamin K-abhängig. Diese Faktoren zeichnen sich durch eine NH2-terminale Domäne aus. Vitamin K fungiert als Coenzym bei der postribosomalen Modifikation der Faktoren im endoplasmatischen Retikulum der Hepatozyten. Hier erfolgt die γ-Carboxylierung der Glutamat-Reste der genannten Gerinnungsfaktoren und der Proteine C und S. Eine Carboxylase setzt die Glutamat-Reste, unter Verbrauch von CO2 und O2 zu γ-Carboxy-Glutamat um. Dieser Vorgang ist für die Überführung der Vorstufen der Gerinnungsfaktoren in die carboxylierte Form notwendig (LICARI & KOVACIC 2009). Das γ-Carboxy-Glutamat gibt Thrombin und anderen Vitamin- K-abhängigen Gerinnungsfaktoren die Fähigkeit an Phospholipidoberflächen zu binden (KUNG et al. 1994). Bei der Aktivierung des Thrombins aus FII werden die Prothrombinfragmente F1 und F2 abgespalten (AHRENS & BODE 2005).
Der aktivierte FII, das Thrombin, stellt das zentrale Enzym des plasmatischen Gerinnungssystem dar. Dieses bioregulatorische Enzym kann im Verlauf der komplexen Mechanismen der sekundären Gerinnung nicht umgangen werden (HEMKER 1994;
BUTENAS et al. 1999). Biochemisch handelt es sich um eine Serinprotease, bestehend aus einem zweikettigen Polypeptid, welches durch eine einzelne Disulfidbrücke verbunden ist (FENTON 1986). Thrombin hat ein Molekulargewicht von 36000 Da. Die kleinere A-Kette hat keine dokumentierte proteolytische Funktion, die B-Kette hingegen hat mehrere molekulare Bindungsstellen (DI CERA et al. 1995; PAGE et al. 2005). Thrombin verfügt über verschiedene molekulare Bindungsstellen, wie das aktive Zentrum und die Anionen- Bindungsstellen Exosite I und Exosite II, um Liganden wie Fibrinogen, Thrombomodulin
(TM), den Heparin Kofaktor II, Hirudin und vor allem FV, FVIII und FXIII zu binden (JENNY et al. 2006; CRAWLEY et al. 2007).
2.2 Zell-basiertes Modell der Gerinnung
Die Bildung von Thrombin erfolgt erst im Bedarfsfall, beispielsweise bei einer Gefäßläsion oder aufgrund eines entzündlichen Stimulus auf vaskulärer Ebene (GENTRY 2004). Ein solches Ereignis geht mit der Exprimierung von Gewebethromboplastin (Tissue factor, TF) einher (MANN et al. 2003b; MONROE & HOFFMANN 2006, OSTERUD & BJORKLID 2006). TF ist ein lipid-gebundenes transmembranäres Glykoprotein (GENTRY 2004), welches vom subendothelialen Gewebe der Gefäßwände und adventitial gelegenen Fibroblasten und Perizyten exprimiert wird (DRAKE et al. 1989; WILCOX et al. 1989;
FLECK et al. 1990). Weiterhin kann TF in den Adventitiae von Organkapseln und in gut durchbluteten Organen, wie Gehirn, Lunge und Plazenta synthetisiert werden (EDDLESTON et al. 1993; MACKMAN et al. 1993; MONROE & KEY 2007). Auch auf der Oberfläche von Mikropartikeln konnte TF identifiziert werden (OSTERUD 1998). Monozyten sind ebenfalls in der Lage TF zu exprimieren (RIVERS et al. 1975; OSTERUD 2001; EGORINA et al.
2005), vor allem im Zuge von endotoxämischen oder septischen Zuständen (OSTERTRUD &
FLAEGSTAD 1983, ALMDAHL et al. 1987; MORRISSEY et al 1993; FRANCO et al.
2000).
Nach dem zell-basierten Modell der Hämostase lässt sich die plasmatische Gerinnung in drei Phasen aufteilen: Initiation, Amplifikation und Propagation. Während der Initiationsphase interagiert das membrangebundene TF mit dem aktivierten FVII (FVIIa), Ca2+-Ionen und Phospholipiden (PL). Dieser Komplex führt zur initialen Aktivierung des FX (CRAWLEY et al. 2007). Der aktivierte FX bewirkt zunächst die Bildung einer geringen Menge Thrombin.
Nun folgt die Amplifikationsphase, während welcher das initial gebildete Thrombin an die Membranoberfläche von Thrombozyten bindet. Thrombin stellt dabei einen effektiven Plättchenaktivator dar (BRUMMEL et al. 2001; SAMBRANO et al. 2001; LEGER et al.
2006). Die Plättchenaktivierung wird durch einen Protease-aktivierten-Rezeptormechanismus vermittelt (MONROE & HOFFMAN 2006). Durch die Aktivierung der Thrombozyten werden über den Flip-Flop-Mechanismus gerinnungsaktive Substanzen, wie
Thrombin vermittelt während dieser Phase weiterhin die Aktivierung von FV und FVIII.
Dieser Vorgang kann als positiver Feedbackmechanismus für die Thrombinbildung verstanden werden (MANN et al. 1988; BUTENAS et al. 1997; BRUMMEL et al. 2002).
Darüber hinaus wird durch FVIIa auch der zirkulierende FIX aktiviert (GAILANI & BROZE 1991; MANN et al. 1998; DAHLBACK, 2000).
Im Verlauf der Propagationsphase aktiviert Thrombin den FXI, welcher seinerseits den FIX aktiviert. FIXa bindet an FVIIIa auf der Oberfläche von aktivierten Thrombozyten. Die Interaktion dieser Faktoren resultiert in einer weiteren Aktivierung von FX, welcher seinerseits an den aktivierten FV bindet und zur weiteren Generierung von Thrombin beiträgt (GAILANI & BROZE 1991; BUTENAS et al. 1997; MINNEMA et al. 1999).
2.3. Biologische Funktionen des Thrombins
Thrombin hat eine Vielzahl von Funktionen. Die wohl bedeutendste Aufgabe des Thrombins ist die Induktion der Fibrinpolymerisation (LEGER et al. 2006). Von dem löslichen Protein Fibrinogen werden die Fibrinopeptide A und B abgespalten (HEMKER et al. 1976). Die entstehenden instabilen Fibrinmonomere lagern sich zu unlöslichen Fibrin-Polymeren zusammen, welche schließlich durch kovalente Doppelbindungen zwischen benachbarten D- Domänen vernetzt werden (SIDELMANN et al. 2000; GREENBERG & LAI 2003). An diesem Vorgang ist auch der aktivierte FXIII, der Fibrin-stabilisierenden Faktor, welcher seinerseits von Thrombin aktiviert werden muss, beteiligt (HEMKER et al. 1976, GENTRY
& DOWNIE 1993; BICK & MURANO 1994).
Dem Thrombin werden weiterhin unterschiedliche Effekte auf Zellen zugeschrieben, so fördert es die Chemotaxis, proliferative Vorgänge und stimuliert die Cytokinfreisetzung (GOLDSACK et al. 1998). Möglich wird dies durch die proteolytischen Fähigkeiten dieses Enzyms und seiner aktivierenden Eigenschaften auf proteaseaktivierte Rezeptoren auf Zelloberflächen (COUGHLIN 2000).
2.4. Geschichte der Messung der Thrombingenerierung in vitro 2.4.1. Etablierung der ersten Methode
Erstmalig wurde die Messung der TG durch die beiden britischen Arbeitsgruppen MACFARLANE & BIGGS (1953) und PITNEY & DACIE (1953) beschrieben.
MACFARLANE & BIGGS (1953) verwendeten als Probenmaterial für die Messung der TG Vollblut. Für die Darstellung der TG-Kurve wurde zunächst eine Eichkurve erstellt, mittels verschiedener Verdünnungsstufen einer Thrombinlösung, welche in eine Fibrinogenlösung überführt wurden. Die jeweiligen Gerinnungszeiten wurden notiert und zur Erstellung der Eichkurve herangezogen. Die Eichkurve diente in der Folge als Grundlage zur Abschätzung des unbekannten Thrombingehaltes der Vollblutproben. Für die eigentliche Messung der TG wurden 2 ml Vollblut in ein Glasgefäß überführt und in einem Wasserbad bei 37°C für 1 Minute inkubiert. Danach wurden 0,1 ml der Probe entnommen und in ein Reaktionsgefäß überführt, welches 0,4 ml der Fibrinogenlösung enthielt. Die weitere Probenentnahme erfolgte im 1-Minuten-Intervall. Mit fortschreitender Versuchsdauer bildete sich in dem Reaktionsgefäß mit dem Vollblut ein Gerinnsel, welches entfernt wurde, um die weitere ungestörte Probenentnahme gewährleisten zu können. Allerdings stellte die Fibrinentfernung eine erhebliche Störung der regelmäßigen Probenentnahme dar und führte entsprechend zu Messungenauigkeiten. Die Gerinnungszeiten der entnommenen Proben wurden notiert und die Thrombinkonzentration jeder einzelnen Probe mit Hilfe der Eichkurve bestimmt. In einem weiteren Versuch haben MACFARLANE & BIGGS (1953) dem Vollblut aus humanem Hirngewebe extrahiertes TF zugefügt und dessen Einfluss auf den Kurvenverlauf beschrieben.
So konnte eine deutliche Verkürzung der Latenzzeit und ein steilerer Anstieg der Thrombinkurve beschrieben werden. Des Weiteren untersuchten MACFARLANE & BIGGS (1953) bereits den Einfluss der Thrombozyten auf die TG. Dafür wurden Plasmen mit unterschiedlichen Plättchenzahlen untersucht. Es konnte ein direkt proportionaler Zusammenhang zwischen der Thrombozytenzahl und der gebildeten Thrombinmenge hergestellt werden. Der Einfluss auf die Latenzzeit blieb verhältnismäßig gering. Diese frühe Technik zur Messung der TG wurde bereits eingesetzt, um den Einfluss verschiedener
thrombozytopenischen Patienten ergab ähnliche Ergebnisse, wie zuvor bei der experimentell reduzierten Plättchenzahl. Bei der Untersuchung hämophilen Plasmas konnte festgestellt werden, dass die Latenzzeit im Vergleich zum Kontrollplasma um mehrere Minuten verlängert war. Bei schweren Fällen von Hämophilie konnten MACFARLANE & BIGGS (1953) hingegen keine messbare TG nachweisen.
Die zweite britische Arbeitsgruppe PITNEY & DACIE (1953) verwendeten als Untersuchungsmedium plättchenreiches Plasma (PRP), wobei auch sie den Einfluss verschiedener Plättchenzahlen auf die TG untersuchten und dabei zu denselben Schlussfolgerungen wie MACFARLANE & BIGGS (1953) kamen. PITNEY & DACIE (1953) bestätigen weiterhin die verlängerte Latenzzeit von hämophilem Plasma und wiesen bereits auf eine notwendige Standardisierung bei der Plasmaherstellung hin, um eine Vergleichbarkeit von Untersuchungsergebnissen zu ermöglichen. Über den Ansatz von MACFARLANE & BIGGS (1953) hinaus, untersuchten PITNEY & DACIE (1953) zusätzlich den Einfluss einer mehrtägigen Gefrierkonservierung bei -20°C auf die Messung der TG, mit dem Ergebnis, dass die Fähigkeit des Plasmas zur TG eingeschränkt war.
2.4.2. Einführung einer chromogenen Methode
Seit dem Ende der 1980er Jahre wurden chromogene Testmethoden zur Messung der TG bei verschiedenen humanen Krankheitsbildern etabliert. Bei dieser Methode kommt ein chromogenes Substrat zur Anwendung, welches durch Thrombin enzymatisch aufgespalten wird. Der Substratumsatz wird durch die photometrische Exktinktionsbestimmung überwacht (HEMKER 1983). Die Auswahl des chromogenen Substrates richtet sich nach dessen Eigenschaften. Das Thrombinsubstrat sollte eine niedrige Affinität zum Thrombin aufweisen, d.h. über eine hohe Michaelis-Menten-Konstante (Km-Wert) verfügen, um einer nachteiligen Beeinflussung der Wechselwirkungen zwischen Thrombin und dessen natürlichen Reaktionspartnern entgegenzuwirken. Außerdem sollte die Substratkonzentration weitestgehend konstant bleiben. Der erwünschte Substratumsatz sollte < 10% sein, um einen proportionalen Zusammenhang zwischen der Spaltungsrate des Substrates und der Enzymkonzentration herstellen zu können. Demnach muss das Substrat über eine niedrige katalytische Konstante (kcat-Wert) verfügen (HEMKER et al. 1993). HEMKER & BÉGUIN
(1995) konnten ein Substrat isolieren, welches die geforderten Eigenschaften erfüllt: das Methylmalonyl-Methylalanyl-Arginyl-p-Nitroanilin (SQ 68). Dieses Substrat nutzt als Bindungsstelle das aktive Zentrum des Thrombins. Der natürliche Thrombininhibitor α2- Makroglobulin bindet hingegen an die Exosite I-Bindungsstelle des Thrombins. Der α2- Makroglobulin-Thrombin-Komplex ist unter physiologischen Bedingungen inaktiv, da aber das aktive Zentrum des Thrombins unbesetzt bleibt, kann SQ 68 trotzdem binden und durch den α2-Makroglobulin-Thrombin-Komplex konvertiert werden, wenngleich kein freies Thrombin mehr verfügbar ist (HEMKER et al. 1986; BÉGUIN et al. 1992; HEMKER &
BÉGUIN 1995). Hieraus resultiert eine amidolytische Restaktivität. Um die enzymatische Aktivität des freien Thrombins, ohne die amidolytische Restaktivität, von der gemessenen Thrombinkurve abzuleiten, ist die Verwendung eines Algorithmus notwendig. Auf diese Weise kann die Fläche unter der Kurve und die tatsächliche enzymatische Aktivität des Thrombins errechnet werden (HEMKER & BÉGUIN 1995). Ein Nachteil der chromogenen Methode besteht darin, dass Antithrombin keine inhibierende Wirkung auf Chromophor- gebundenes Thrombin hat (HEMKER et al. 1993). Ein weiterer großer Nachteil der chromogenen Messmethode zur Bestimmung der TG besteht darin, dass defibriniertes Plasma verwendet werden muss, da jegliche Gerinnselbildung während der Messung eine Trübung der Plasmaprobe bedingen würde, wodurch die Messung der TG beeinträchtigt werden würde.
Die Defibrinierung kann beispielsweise durch die Versetzung des Plasmas mit dem Gift der Malayischen Grubenotter erreicht werden, welches die Gerinnselbildung initiiert (HEMKER et al. 2009).
2.4.3. Fluorogene Methode 2.4.3.1. Etablierung der Methode
Das Konzept der Thrombographie wurde durch HEMKER et al. (2002) etabliert. Es stellt eine Weiterentwicklung zuvor bestehender Testsysteme zur Bestimmung der TG dar, in Form eines langsam reagierenden fluorogenen Substrates (HEMKER et al. 2000b; RAMJEE 2000;
HEMKER et al. 2003), wodurch die kontinuierliche Registrierung der Thrombinaktivität einer Plasmaprobe in einem einzigen Reaktionsgefäß möglich wird (HEMKER et al. 1993). Das
sich die Defibrinierung der Plasmaproben erübrigt. Dadurch wird es außerdem möglich PRP zu verwenden und damit zelluläre Elemente der Hämostase in die Messung einzubeziehen (HEMKER et al. 2003). Die Reaktion wird durch die Zugabe von TF getriggert, sowohl bei der Verwendung von Plättchenarmes Plasma (PPP) als auch PRP (DUCHEMIN et al. 2008).
Zurzeit sind zwei fluorogene Testsysteme verfügbar. Die CAT-Methode (Thrombinoscope Bv., Maastricht, Niederlande) und der Technothrombin® Thrombingenerierungs Assay (TGA- Test; Technoclone, Wien, Österreich). Bei beiden Tests wird die TG graphisch in Form einer Kurve dargestellt, welche sowohl die Bildung des Thrombins, wie auch dessen Inhibierung ausdrückt.
2.4.3.2. Substratauswahl
Die Anforderungen an fluorogene Substrate zur Bestimmung der TG sind hoch. Wie zuvor bei der Auswahl chromogener Substrate zur Messung der TG beschrieben, muss auch das fluorogene Substrat eine niedrige Affinität zum Thrombin aufweisen und eine relativ geringe Umsatzrate haben. Diese Kriterien werden von dem Substrat Z-Gly-Gly-Arg- Aminomethylcumarin erfüllt (HEMKER et al. 1993; 2002; TAPPENDEN et al. 2007). Zu berücksichtigen ist, dass auch Fluorophor-Thrombin-Komplexe nicht mit Antithrombin interagieren (BUTENAS & MANN 2007), wodurch laut HEMKER & DE SMEDT (2007) eine verlangsamte Thrombininaktivierung durch die Plasmaserpine auftritt. Problematisch stellt sich, ähnlich wie bei der chromogenen Methode, auch die Umsetzung des Substrates durch den physiologisch inaktiven α2-Makroglobulin-Thrombin-Komlex dar (2.4.3.5.).
2.4.3.3. Innerer Filtereffekt und Substratverbrauch
Der innere Filtereffekt ist ein Störfaktor bei quantitativen Fluoreszenzmessungen und tritt vor allem bei hohen Konzentrationen einer fluorogenen Substanz auf. Der Effekt entsteht dadurch, dass das emittierte Fluoreszenzlicht durch andere fluorogene Moleküle der Probe absorbiert wird, wodurch die Fluoreszenzintensität unterschätzt werden würde. Aufgrund dessen besteht kein linearer Zusammenhang zwischen der Menge des Fluorophors und dem Fluoreszenzsignals (VAN VEEN et al. 2008a). Bei der CAT-Methode wurde diese
Substratverbrauch stellt einen weiteren Störfaktor dar, da mit sinkender Substratkonzentration, die Geschwindigkeit des Substratumsatzes abnimmt (HEMKER et al.
2003).
2.4.3.4. Korrektur des inneren Filtereffekts und des Substratverbrauchs
Die CAT-Methode verwendet zur Korrektur des inneren Filtereffekts und des Substratverbrauchs den Thrombin Calibrator der Firma Thrombinoscope Bv. Der Thrombin Calibrator enthält eine konstante Thrombin-ähnliche Aktivität, welche nicht durch Plasmainhibitoren beeinträchtigt wird und probenspezifisch parallel zur Messung der TG bestimmt wird (HEMKER et al. 2002). Dabei wird angenommen, dass die Thrombin Calibrator Kurve ohne den Einfluss des inneren Filtereffekts und des Substratverbrauchs eine Gerade darstellen würde. Durch die genannten Störfaktoren weist die Thrombin Calibrator Kurve allerdings eine Krümmung auf. Daher transformiert die Thrombinoscope Software den gekrümmten Kurvenverlauf des Thrombin Calibrators in eine Gerade und überträgt diese Korrektur auf die gemessenen TG-Kurven, um auch hier den negativen Einfluss des inneren Filtereffekts und des Substratverbrauchs zu korrigieren (HEMKER et al. 2009). Weiterhin ermöglicht der Thrombin Calibrator die Korrektur weiterer Störfaktoren, wie unterschiedlicher Verfärbungen des Plasmas und alternde Lampen und Filter des Fluorometers. (HEMKER et al. 2003).
2.4.3.5. Umrechnung der Fluorescence Units/min in nmol/l
Die TG-Kurve wird zunächst in Fluorescence Units (FU)/min angeben. Der initiale Anstieg der Thrombin Calibrator Kurve korrespondiert direkt mit der Aktivität des Thrombin Calibrators, d.h. je steiler der initiale Anstieg der Kurve, desto höher ist die Aktivität des Thrombin Calibrators (HEMKER et al. 2002). Die Thrombinoscope Software verwendet diesen initialen Anstieg der Thrombin Calibrator Kurve zur Umrechnung der FU/min in nmol/l. Da der initiale Anstieg der Thrombin Calibrator Kurve sensitiv auf wechselnde Färbungen des Plasmas reagiert, wird verständlich, weshalb der Thrombin Calibrator
2.4.3.6. Korrektur des α2-Makroglobulin-Thrombin-Komplex
Die Inaktivierung von Thrombin erfolgt durch Antithrombin und α2-Makroglobulin, wie oben bereits angeführt. Der α2-Makroglobulin-Thrombin-Komplex ist physiologisch inaktiv, kann allerdings das fluorogene Substrat umsetzen, auch wenn kein freies Thrombin mehr verfügbar ist (HEMKER et al. 1995). Dies wird anhand des Kurvenverlaufes sichtbar, welcher die Nulllinie nicht wieder erreicht. Die Thrombinoscope Software analysiert den Kurvenverlauf und definiert den Zeitpunkt, an dem die TG gestoppt hat und korrigiert auf Basis eines mathematischen Algorithmus den Kurvenverlauf (HEMKER et al. 2003; 2006).
2.4.4. Das Thrombogramm
Das Thrombogramm stellt die graphische Darstellung der TG in vitro dar. Anhand der TG- Kurve (Abb. 2; siehe 3.5.1.3.) lassen sich verschiedene Parameter ableiten. Die Latenzzeit, auch als lag time oder lag phase bezeichnet, beschreibt den Abschnitt der Kurve vom Beginn der Messung bis zum Anstieg der Kurve (HEMKER et al. 2006). Die Latenzzeit korreliert dabei gut mit der Gerinnungszeit. Die Latenzzeit wird auch als Zeitabschnitt definiert, während welchem 1/6 der maximalen Thrombinmenge gebildet wird (CASTOLDI &
ROSING 2011). Der Thrombinpeak entspricht der maximal generierten Thrombinkonzentration und wird in nmol/l angegeben. Die Zeit bis zum Peak erstreckt sich dementsprechend vom Start der Messung, durch Rekalzifizierung und Zugabe des fluorogenen Substrates, bis zum Erreichen des Peaks und wird in Minuten ausgedrückt (HEMKER et al. 2003). Der Parameter Reaktionsdauer umfasst die Gesamtdauer der TG in Minuten, vom Start bis zum Abfall der Kurve hin zur Nulllinie, wenn kein freies Thrombin mehr messbar ist. Das ETP entspricht der Area under curve (AUC) und repräsentiert die absolute Menge des aktiven Thrombins im Plasma (MANN et al. 2003b; HEMKER et al.
2006; CASTOLDI & ROSING 2011).
2.4.5. Intra-assay und inter-assay Variabilität
Verschiedene Studien beschreiben eine intra-assay Variabilität von 1,4–20% und eine inter-
DIELIS et al. 2008b). Eine Multicenter-Studie (DARGAUD et al. 2007) wurde mit dem Ziel durchgeführt, die intra- und inter-assay Variabilität zu ermitteln und zudem die Inter-Center- Variabilität festzustellen. In 5 verschiedenen Forschungseinrichtungen wurden in einem ersten Schritt 18 plättchenarme Plasmen, die Hälfte mit CTI versetzt, die Hälfte ohne Zusatz von CTI über 3 Tage jeweils fünffach gemessen. Die Messung der TG erfolgte in jedem Labor nach der CAT-Methode. Im ersten Versuchsteil verwendete jedes Labor selbsthergestellte, statt kommerzielle Reagenzien nach der jeweils üblichen Methodik. In einem weiteren Schritt wurde die Messung derselben Plasmen nach demselben Protokoll mit kommerziellen Reagenzien und einer einheitlichen Methodik wiederholt. Mit dem Zusatz von CTI zu den Plasmen ließ sich bei allen Multicenter-Studienteilnehmern die intra-assay Variabilität deutlich auf weniger als 9% reduzieren. Dieses Ergebnis deckt sich mit vergleichbaren Untersuchungen von HEMKER et al (2003) und LAWRIE et al. (2003). Der Inter-Center Vergleich der Studie von DARGAUD et al. (2007) zeigte zudem, dass eine Variabilität von weniger als 7,5% zwischen den verschiedenen Versuchsstätten bestand, allerdings nur bei den exakt gleichen Versuchsbedingungen, bei der Verwendung selbsthergestellter Reagenzien lag die Inter-Center Variabilität deutlich höher bei mehr als 40%. Die Studie zeigte aber auch, dass verschiedene Versionen der Thrombinoscope Software und unerfahrenes Laborpersonal die Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Laboratorien erschwert.
2.4.6. Intra- und inter-individuelle Variabilität
Verschiedene Studien beschäftigen sich mit der intra-individuellen Variabilität der TG gesunder Menschen. HEMKER et al (2003) und DEVREESE et al. (2007) untersuchten dies durch wöchentliche Wiederholungsmessungen an 9 bzw. 10 aufeinanderfolgenden Wochen mit der CAT-Methode, DARGAUD et al. (2009) wählten sogar einen Untersuchungszeitraum von einem Jahr, wobei die Messungen aber nur alle 3 Monate erfolgten. Die intra-individuelle Variabilität des ETPs schwankte zwischen 8 und 19% (HEMKER et al. 2003; DEVREESE et al. 2007; DARGAUD et al. 2009). GEROTZIAFAS et al. (2005) konnten eine deutliche inter- individuelle Variabilität der TG-Parameter Latenzzeit, ETP, Peak und Zeit bis zum Peak mit
2.5. Einflussfaktoren auf die Thrombingenerierung 2.5.1. Gefrierkonservierung
CHANTARANGKUL et al. (2003) haben einen signifikanten Einfluss der Gefrierkonservierung auf das ETP nachweisen können. Das ETP zeigte deutlich höhere Werte im gefrierkonservierten PPP im Vergleich zum frischen PPP, v.a. bei einer niedrigen Konzentration der zugesetzten PL von 0–1 µmol/l. Dieser Effekt konnte nicht beobachtet werden, wenn das Plasma vor der Gefrierkonservierung gefiltert wurde, um verbleibende Thrombozyten zu entfernen. Im Gegensatz dazu wiesen GATT et al. (2008b) darauf hin, dass sie, nach zweifache Zentrifugierung des Plasma bei 2000 g für 10 Minuten, keinen signifikanten Einfluss der Gefrierkonservierung auf die Thrombinaktivität im PPP nachweisen konnten.
2.5.2. Tissue Factor-Konzentration
Viele Studien fordern die Standardisierung der Versuchsbedingungen zur Messung der TG, insbesondere in Bezug auf die verwendete TF-Konzentration zur Initiierung der TG, da variable TF-Konzentrationen, neben der PL-Konzentration, einen wichtigen limitierenden Faktor für die internationale Vergleichbarkeit darstellt (WIELDERS et al. 1997; DARGAUD et al. 2007; VAN VEEN et al. 2008a, 2009a). Sofern die Reagenzien der Firma Thrombinoscope für die CAT-Methode verwendet werden, welche eine definierte Menge TF enthalten, besteht eine gewisse Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Laboratorien (DARGAUD et al. 2010).
Die TG ist im hohen Maße abhängig von der verwendeten TF-Konzentration (HEMKER et al.
2003), insbesondere da MACHLUS et al. (2009) nachweisen konnten, dass ohne die Zugabe von TF über einen Zeitraum von 120 Minuten keine TG gemessen werden konnte.
CHANTARANGKUL et al. (2003) konnten bis zu einer TF-Konzentration von 10 pmol/l einer Erhöhung des ETPs erreichen, noch höhere TF-Konzentrationen produzierten keinen weiteren Anstieg des ETPs.
Von besonderer Bedeutung scheint die TF-Konzentration bei der Untersuchung von hämophilen Plasmaproben zu sein, da gezeigt wurde, dass bei der Messung der TG hämophiler Proben bei TF-Konzentrationen über 10 pmol/l das ETP sogar im Normbereich lag (CHANTARANGKUL et al. 2003; LEWIS et al. 2007). KEULARTS et al. (2001) und VAN VEEN et al. (2008b) halten die Messung der TG bei niedrigen Aktivitäten von FVIII und IX mit TF-Konzentrationen von 5 pmol/l für ausreichend sensitiv. Zu berücksichtigen ist allerdings, dass bei TF-Konzentration von weniger als 15 pmol/l der Einfluss der Kontaktaktivierung der Probe an Bedeutung gewinnt (BAGLIN 2005).
2.5.3. Phospholipidkonzentration
Die Verwendung von PPP für die Messung der TG, erfordert den Zusatz von PL.
CHANTARANGKUL et al. (2003) haben den Einfluss der PL-Konzentrationen 0,5 bis 20 µmol/l auf die Messung der TG untersucht. Eine Erhöhung des ETPs bei steigender PL- Konzentration konnte so nachgewiesen werden. Durch eine PL-Konzentration von mehr als 5 µmol/l ist jedoch keine weitere Erhöhung des ETPs zu erreichen gewesen. Aus diesen Ergebnissen schlossen die Autoren, dass der Einfluss der PL auf die TG zu vernachlässigen sei, wenn deren Konzentration über 5 µmol/l liegt. Wenn es möglich ist eine Thrombinkurve im PPP auch ohne Zugabe von PL zu messen, so ist dies zumeist auf die Kontamination des Plasmas mit Thrombozyten, Zelltrümmern oder Mikropartikeln zurückzuführen (HEMKER et al. 2006). Wird PRP als Untersuchungsmedium verwendet, so kann auf die Zugabe von PL verzichtet werden, da die Thrombozyten als PL-Quelle dienen (VAN VEEN et al. 2008b).
2.5.4. Thrombomodulin
Die Interaktion des Thrombins mit Thrombomodulin (TM) ist als negative Feedbackschleife für die TG anzusehen (ESMON 1989). Die Untersuchung der TG humanen Plasmas gesunder Spender hat gezeigt, dass die TG-Kapazität bei der Präsenz von TM vermindert ist (HEMKER et al. 2003; DARGAUD et al. 2006a; MACHLUS et al. 2009). MACHLUS et al.
(2009) konnten durch den Zusatz von TM zum Plasma gesunder Menschen eine verlängerte
Latenzzeit, einen niedrigeren Peak und ein erniedrigtes ETP nachweisen, wobei der Einfluss des TMs mit steigender TF-Konzentration abnahm.
Einige Studien berichten von der Messung der TG nach der CAT-Methode und dem Zusatz von TM mit dem Ziel eine bessere Differenzierung zwischen gesunden Spendern und Patienten mit einer venösen Thrombembolie zu erreichen und so die Rezidivgefahr für Thrombosepatienten besser prognostizieren zu können (DARGAUD et al. 2006a; TRIPODI et al. 2007; TRIPODI et al. 2008). DARGAUD et al. (2006a) und TRIPODI et al. 2008 konnten dabei nachweisen, dass der Zusatz von TM die Einschätzung des Rezidivrisikos tatsächlich erleichtert, da so ein signifikanter Unterschied des ETPs der Patienten mit einem Rezidiv zu den Patienten ohne Rezidiv festgestellt werden konnte.
2.5.5. Verschiedener Aktivitäten der pro- und antikoagulatorischen Faktoren Der Einfluss variabler Aktivitäten von Gerinnungsfaktoren (100, 200, 400%) auf die Parameter der TG wurde von MACHLUS et al. (2009) evaluiert, sowohl für die Messung der TG im PPP als auch im PRP. Die TG wurde dabei im PPP mit 1 und 5 pmol/l TF initiiert und im PRP mit 1 pmol/l TF. Die unterschiedlichen Konzentrationen von FVIII, FIX und FXI führten in keinem der Ansätze zu signifikant unterschiedlichen Latenzzeiten. Hohe FV- Aktivitäten bewirkten jedoch eine signifikant verkürzte Latenzzeit. Hohe Prothrombinaktivitäten von 400% und eine Fibrinogenkonzentration von 200% führten zu einer signifikanten Verlängerung der Latenzzeit, unabhängig von der verwendeten TF- Konzentration. Für das PRP konnten für keinen der Faktoren ein signifikanter Einfluss auf die Latenzzeit nachgewiesen werden. Lediglich der FXI (400%) führte zu einer Verkürzung der Latenzzeit. Die Zeit bis zum Peak wird durch hohe Konzentrationen (400%) von FXI, FIX und FVIII deutlich verkürzt, allerdings nur im PPP (1 pmol/l TF). Hohe FXI-, FIX-, FVIII-, FX-, FII-Aktivitäten (400%) und eine Fibrinogenkonzentration von 200% bewirkten eine deutliche Erhöhung des Peaks im PPP und PRP. Hohe Aktivitäten von FIX, FVIII, FX, FII und Fibrinogen führten auch zu einer Erhöhung des ETPs.
Ähnliche Untersuchungen wurden auch von DUCHEMIN et al. (2008) vorgenommen.
Allerdings untersuchten sie den Einfluss reduzierter Faktoraktivitäten (100, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 2,5, 1, 0%) von humanen Mangelplasmen auf die TG-Parameter ETP, Peak und Latenzzeit.
Mit einem vollständigen Mangel jeweils einer der FII, FV, FVII und FX war keine messbare
Thrombinkurve zu erzielen. Die verschiedenen Faktoraktivitäten bedingten nach dieser Studie einen sehr unterschiedlichen Einfluss auf die TG-Parameter und die Berücksichtigung der TF- Konzentration schien dabei unerlässlich. Der Einfluss verschiedener FII-, FV- und FIX- Aktivitäten und Fibrinogenkonzentrationen auf die TG blieb von unterschiedlichen TF- Konzentrationen unbeeinträchtigt. Allerdings wurde der Einfluss der TF-Konzentration bei der Untersuchung des Effekts verschiedenen FX-Konzentrationen auf die TG deutlich.
Beispielsweise führte eine FX-Aktivität von 15% zu einer Reduktion des ETPs um 50%, bei einer TF-Konzentration von 1 pmol/l. Lag die TF-Konzentration bei 5 pmol/l TF, so trat die Halbierung des ETPs erst bei einer Restaktivität des FX von 2,5% auf. Nur 1% von FV oder FVII waren ausreichend, um ein ETP von 60–70% des Normalwertes zu erhalten. Diese Erkenntnisse deckten sich mit den Ergebnissen von AL DIERI et al. (2002), welche das Plasma von Patienten mit angeborenen Gerinnungsfaktordefiziten untersuchten. Dabei soll die Sensitivität des Tests bei der niedrigeren TF-Konzentration von 1 pmol/l gegenüber verschiedenen FVIII- und FIX-Aktivitäten deutlich höher sein (BELTRAN-MIRANDA et al.
2005; DEVREESE et al. 2007). DUCHEMIN et al. (2008) konnten ein ETP von 60–70%
bezogen auf den Normalwert in kommerziellen lyophilisierten FVIII- und FIX-Mangelplasma messen, was bei humanen hämophilen Plasmaproben jedoch nicht der Fall war. Daher scheint die Aussage von GIANSILY-BLAIZOT et al. (2003) bestätigt, wonach die Untersuchung von in vitro-Mangelplasma nicht mit Patientenplasma gleichzusetzen ist.
Der absolute Mangel an FXI produzierte ein ETP von 90% bei einer TF-Konzentration von 1 pmol/l. Dies legt die Vermutung nahe, dass der Einfluss des FXI auf die TG als gering zu erachten ist (DUCHEMIN et al. 2008). Im Widerspruch dazu steht allerdings die Studie von KEULARTS er al. (2001), welche eine deutliche Reduzierung des ETP bei einem FXI- Mangelplasma mit einer TF-Konzentration von 0,2 pmol/l zeigen konnten, so dass zu vermuten ist, dass bei höheren TF-Konzentrationen der Einfluss von FXI auf die TG maskiert ist. Eine reduzierte Aktivität von Antithrombin führt zu einer deutlichen Erhöhung der TG- Parameter (DUCHEMIN et al. 2008).
2.5.6. Corn Trypsin Inhibitor
Die potentielle Kontaktaktivierung des Plasmas stellt einen Störfaktor bei der Messung der
durch künstliche und negativ geladene Oberflächen (SILVERBERG et al. 1980). Dies geschieht entweder während der Blutabnahme selbst oder im Verlauf der Probenaufbereitung bzw. der Analyse (SPRONK et al. 2009) und kann zu Messungenauigkeiten führen (LUDDINGTON & BAGLIN 2004).
Für die Humanmedizin wurde die Bedeutung verschiedener Blutabnahmesysteme für die Kontaktaktivierung untersucht (siehe Kapitel 2.5.7.). Dies führte zu keinem einheitlichen Ergebnis (HEMKER et al. 2003; SPRONK et al. 2009; DARGAUD & NEGRIER 2010). Der Einfluss der Kontaktaktivierung kommt bei der Messung der TG vor allem dann zum Tragen, wenn niedrigere TF-Konzentrationen von 1 pmol/l oder weniger zur Initiierung der TG verwendet werden (DARGAUD et al. 2007; VAN VEEN et al. 2008b; CHANDLER &
ROSHAL 2009).
Aufgrund dieser Problematik wird für humanmedizinische Studien der TG, insbesondere wenn es sich um Analysen hämophilen Plasmas handelt, die Zugabe eines selektiven FXII- Inhibitors empfohlen. Dafür geeignet ist CTI, ein kleines Protein mit einem Molekulargewicht von 12500 Da, welches aus frischen Süßmaiskörnern gewonnen wird (HOJIMA et al. 1980).
CTI ist ein Trypsin-Inhibitor, bildet mit FXII einen Eins-zu-eins-Komplex und wird dem Zitratröhrchen vor der Blutabnahme hinzugefügt. SPRONK et al. (2009) konnten keinen signifikant unterschiedlichen Einfluss zwischen den CTI-Konzentration von 25 und 50 µg/ml auf die TG im Humanplasma feststellen und empfehlen daher eine finale Konzentration von 40 µg CTI/ml Plasma, dies entspricht einer Konzentration von 20 µg/ml Vollblut. Bereits LUDDINGTON & BAGLIN (2004) hatten in einer Studie die ausreichende Wirksamkeit dieser CTI-Konzentration beschrieben. Die selektive Funktionalität des Inhibitors wurde von SPRONK et al. (2009) bewiesen, indem sie die TG von FXII-Defizit-Plasma mit und ohne CTI, bzw. mit verschiedenen CTI-Konzentrationen, gemessen haben und keinen Unterschied nachweisen konnten. Als Gegenprobe hat man Zitratplasma Kaolin (1mg/ml) zur Aktivierung des FXII hinzugefügt. Mit der Folge, dass sich die Latenzzeit deutlich verkürzt hat und sowohl eine signifikante Erhöhung des Thrombinpeaks, wie auch des ETPs vorlag. Der Einfluss einer solch künstlich herbeigeführten Kontaktaktivierung ließ sich durch den Zusatz von CTI neutralisieren (SPRONK et al. 2009).
SPRONK et al (2009) haben außerdem zeigen können, dass mit steigender Konzentration des TFs der Einfluss des CTIs sinkt. Über die Höhe der TF-Konzentration sind sich die Studien
allerdings nicht einig. Während SPRONK et al. (2009) eine TF-Konzentration von 1 pmol/l als ausreichend erachten, um auf den CTI-Zusatz zu verzichten, fordern anderen Autoren auch bei einer TF-Konzentration von 5 pmol/l den Einsatz von CTI (LUDDINGTON & BAGLIN 2004; VAN VEEN et al. 2008b). Im Gegensatz dazu schließen TROSSAËRT et al. (2008) zwar den möglichen Einfluss der Kontaktaktivierung bei niedrigen TF-Konzentrationen nicht aus, konnten aber bei ihrer Studie die beste Korrelation zwischen den TG-Parametern und der FVIII-Aktivität bei niedrigen TF-Konzentrationen ohne den Zusatz von CTI nachweisen.
Auch TAPPENDEN et al. (2007) konnten im PPP eine signifikante Reduzierung des Thrombinpeaks durch die Zugabe von CTI nachweisen, nicht jedoch auf die Höhe des ETPs, obwohl bei dieser Studie sehr hohe TF-Konzentrationen von 30 pmol/l verwendet wurden.
Die bestehende Diskrepanz zwischen den verschiedenen Studien erklären sich SPRONK et al.
(2009) durch unterschiedliche Art und Weisen der Plasmaherstellung und verschiedener Reagenzien für die Messung der TG. So weisen SPRONK et al. (2009) ausdrücklich darauf hin, dass bei der zweimaligen Zentrifugierung im zweiten Schritt eine Geschwindigkeit von 11000 x g oder mehr für 10 min unabdinglich ist. Andernfalls besteht die Gefahr, dass Mikropartikel im Plasma verbleiben, welche eine Kontaktaktivierung begünstigen würden (BERCKMANS et al. 2001).
Des Weiteren soll die Zugabe von CTI nach der Plasmaherstellung keinen ausreichenden Effekt mehr auf die TG haben (LUDDINGTON & BAGLIN 2004; SPRONK et al. 2009).
Grundsätzlich führt der Zusatz von CTI zu einer erheblichen Kostenintensivierung der Messung der TG (SPRONK et al. 2009).
2.5.7. Präanalytische Bedingungen
Wie bereits angeführt, kann bereits der Vorgang der Blutgewinnung zu einer Voraktivierung der Gerinnung und somit zu einer signifikanten Beeinflussung der TG führen. Für die Gewinnung humanen Zitratblutes werden verschiedene Blutentnahmesysteme verwendet. In einer Studie von DARGAUD & NEGRIER (2010) wurden drei Systeme verglichen. Es kamen Monovetten® von Sarstedt, mit welchen das Blut aspiriert wird, Vacutainer®- Röhrchen, bei welchen das Blut mittels Unterdruck ins Röhrchen gesogen wird und ein
NEGRIER (2010) keine signifikanten Unterschiede der Messwerte verschiedener TG- Parameter feststellen. Dem entgegen steht die Empfehlung von HEMKER et al. (2003), welche einen freien Blutfluss empfehlen, um die Gefahr der Kontaktaktivierung zu minimieren.
Auch für verschiedene Kanülengrößen (19 und 21 G) konnten DARGAUD & NEGRIER (2010) keinen signifikanten Einfluss auf das ETP, den Peak oder die Latenzzeit nachweisen.
GATT et al. (2008b) vermuten, dass auch der pH-Wert des Zitrats zu unterschiedlichen Messwerten führen kann, dieser liegt bei Vacutainer®-Röhrchen bei 6,0, bei Monovetten®- Zitratröhrchen hingegen bei 8,3. Daher empfehlen die Autoren nur eine Bezugsquelle der Blutröhrchen zu nutzen.
Als kritisch ist die Herstellung von PPP anzusehen. Die zweifache Zentrifugierung ist notwendig, um ein weitestgehend plättchenfreies Plasma zu erhalten. Dies erfolgt mit der Zielsetzung alle Thrombozyten, weiße Blutkörperchen und Mikropartikel aus dem Plasma zu entfernen, da andernfalls mit einer Verkürzung der Latenzzeit und einer Erhöhung des Peaks und des ETP zu rechnen wäre (DARGAUD & NEGRIER 2010). DARGAUD & NEGRIER (2010) vermuten, dass verbleibende Leukozyten dabei als zusätzliche TF- und Plättchen als ergänzende PL-Quelle fungieren.
Einige Autoren empfehlen die Verwendung von PRP für die Messung der TG. Allerdings birgt dies den Nachteil, dass die Standardisierung erschwert ist und es sich für die Gefrierkonservierung nicht eignet (LIPPI et al. 2006; LEWIS et al. 2007). LIPPI et al. (2006) begründet dies dadurch, dass die Gefrierkonservierung eine Plättchenaktivierung und Membranbeschädigung der Thrombozyten induziert. Des Weiteren, wie bereits erwähnt, stellen die Plättchen eine zusätzliche Quelle für PL dar. Daraus resultieren eine beschleunigte TG und ein erhöhter Peak.
Hämolytisches Plasma ist eine klassische Fehlerquelle in der Routinegerinnungsdiagnostik.
Die CAT-Methode ist dafür wenig anfällig, da bei jeder Messung die konstante Thrombin- ähnlichen Aktivität des Thrombin Calibrator parallel bestimmt wird und so die Korrektur dieses Störfaktors ermöglicht wird (HEMKER et al. 2003; DARGAUD & NEGRIER 2010).
Schon kleine Unterschiede der präanalytischen Bedingungen führen zu einer signifikanten Beeinflussung der Sensitivität des Tests bei verschiedenen Erkrankungen. Ohne eine
detaillierte Beschreibung der Probenaufbereitung und der Messmethode lassen sich Ergebnisse folglich nicht interpretieren bzw. vergleichen (VAN VEEN et al. 2008b).
2.5.8. Lagerungsdauer
MEMBRÉ et al. (2007) haben eine Studie zur Lagerungsfähigkeit des PPPs veröffentlicht.
Die TG des Plasmas wurde 1 und 3 Stunden nach der Blutentnahme gemessen und verglichen. Sofern die Blutabnahme mit Monovetten® erfolgte, konnte kein Einfluss der Lagerungsdauer nachgewiesen werden. Bei Verwendung von Vacutainern® hingegen konnten deutliche Abweichungen beobachtet werden. Der Peak und das ETP waren 3 Stunden nach Blutabnahme niedriger als nach einer Stunde. Dies wird dahingehend interpretiert, dass es zu einer Plättchenaktivierung bei der Blutabnahme mit Vacutainer®-Röhrchen kommt (MEMBRÉ et al. 2007).
2.5.9 Plättchenreiches Plasma zur Untersuchung der Thrombingenerierung Die Messung der TG aus PRP birgt den Vorteil, dass der prokoagulatorische Einfluss der Thrombozyten auf die TG erfasst wird (BÉGUIN et al. 1989, LEE & BAGLIN 1995;
VANSCHOONBEEK et al. 2004). Ebenso kann der Einfluss der Thrombozyten auf die TG bei hämophilen Patienten (SIEGEMUND et al. 2003) evaluiert werden, Defekte der Plättchenfunktion identifiziert werden (BÉGUIN et al. 2004) und die Potenz von Thrombozytenaggregationshemmer im Hinblick auf die TG untersucht werden (KESSELS et al. 1994b; HERAULT et al. 1998).
Eine Studie von FABER et al. (2003) konnten im PPP von Patienten mit einem vorangegangenen Schlaganfall keine veränderten TG-Parameter im Vergleich zur Kontrollgruppe feststellen. Hingegen zeigte sich bei der Messung der TG im PRP ein signifikant erhöhtes ETP bei den Schlaganfallpatienten. Solche mit einem Rezidiv hatten allerdings ein erhöhtes ETP im PPP und PRP. Daher halten die Autoren PRP für das geeignetere Untersuchungsgut zur Messung der TG.
2.5.10. Altersabhängigkeit der Thrombingenerierung
HAIDL et al. (2006) und FILIPPIN et al. (2011) konnten nachweisen, dass eine Altersabhängigkeit zu den TG-Parametern besteht. So steigen sowohl die Peakhöhe als auch die Höhe des ETPs mit zunehmendem Alter signifikant an. Weisen Kinder im Alter zwischen 0,5–16 Jahren noch ein ETP von 1068–1227 nmol/l x min und einen Peak von 185–237 nmol/l auf, so zeigen Erwachsene im Alter von 17 Jahren bis > 50 Jahren ein ETP von 1925–
2253 nmol/l x min und einen Peak von 265–367 nmol/l. Die Latenzzeit und die Zeit bis zum Peak bleiben hingegen blieben relativ konstant (FILLIPIN et al. 2011). Die Autoren schließen aus der gesteigerten Aktivität des Thrombins mit zunehmendem Alter ein Korrelat zum erhöhten Thromboserisiko. Die signifikanten Unterschiede zwischen den Altersgruppen für die TG-Parameter lassen sich durch die deutlich geringeren Faktoraktivitäten, insbesondere des Prothrombins, der Kinder erklären (ANDREW et al. 1992).
2.6. Einsatzmöglichkeiten Thrombingenerierung in der Humanmedizin 2.6.1. Hämophilie A
An Hämophilie A erkrankte Menschen haben eine reduzierte Aktivität von FVIII und können langsamer Thrombin generieren als gesunden Individuen, aufgrund ihrer Unfähigkeit den Tenase-Komplex zu bilden (MANN 2003a). Der klinische Schweregrad der Erkrankung wird u.a. anhand der FVIII-Aktivität bestimmt. Bereits seit 1988 (PARQUET-GERNEZ et al.) ist allerdings bekannt, dass eine Diskrepanz zwischen dem klinischen Ausprägungsgrad der Hämophilie A und der FVIII-Aktivität bestehen kann, da Etwa 25% der Patienten mit moderater Hämophilie häufiger Blutungskrisen und Gelenkerkrankungen zeigen, als es zu erwarten wäre (DEN UIJL et al. 2009). Hingegen weisen 3–10% der humanen Patienten mit einer schweren Hämophilie (FVIII-Aktivität < 1%) nur eine milde Blutungsneigung auf und entwickeln keine Arthropathien aufgrund rezidivierender Gelenkblutungen (VAN DER
BERG et al. 2003). Man vermutet hier das zusätzliche Vorliegen prothrombotische Risikofaktoren, wie die FV-Leiden-Mutation (FV G1691A) (BERTINA et al. 1994; ARBINI et al. 1995; NICHOLS et al. 1996; LEE et al. 2000; NOWAK-GOTTL et al. 2003) oder dem Prothrombin G20210A Polymorphismus (TIZZANO et al. 2002; VAN DIJK et al. 2004).
Andere Studien konnten einen solchen Zusammenhang jedoch nicht bestätigen (BELTRAN- MIRANDA et al. 2005). Um die individuelle Blutungsneigung, auch milder Krankheitsverläufe, besser einschätzen bzw. vorhersagen zu können, ist man bemüht, neue Tests zu evaluieren (DARGAUD & NEGRIER 2010).
Bei der Messung der TG zeigen hämophile Patienten gegenüber gesunden Menschen einen niedrigeren Peak und ein erniedrigtes ETP (DARGAUD et al. 2005b). Die Höhe des ETPs und des Peaks korrelieren dabei mit der FVIII-Aktivität (CHANTARANGKUL et al. 2003;
SIEGEMUND et al. 2003; DARGAUD et al. 2005a). TROSSAËRT et al. (2008) konnten zudem eine Korrelation der Zeit bis zum Peak und der FVIII-Aktivität feststellen. Auch eine in vitro Studie von SALVAGNO et al. (2009) konnte mittels eines kommerziellen FVIII- Mangelplasmas verschiedene FVIII-Aktivitäten generieren und mit steigender FVIII-Aktivität eine Erhöhung des Peaks und des ETPs erreichen. Bei dieser Studie konnte schon ab einer FVIII-Aktivität von 40% ein dem gesunde Menschen entsprechendes Niveau von ETP und Peak erreicht werden. KEULARTS et al. (2000) konnten sogar für eine FVIII-Aktivität von ~ 30% normale Messwerte für die TG nachweisen.
Inwiefern die Untersuchung der TG hämophiler Menschen zur Einschätzung der individuellen Blutungsneigung geeignet bzw. der Bestimmung der FVIII-Aktivität überlegen ist, bleibt abzuwarten, da die Studien sich dahingehend nicht einig sind. So halten TROSSAËRT et al.
(2008) die TG für geeignet um das individuellen Blutungsrisiko von Hämophilen einschätzen zu können. BELTRAN-MIRANDA et al. (2005) kamen hingegen zu keinem eindeutigen Ergebnis. DARGAUD et al. (2005a) konnten für Patienten mit einer ausgeprägten klinischen Blutungsneigung eine Reduzierung des ETPs von 50% ermitteln, wobei die Patienten unterschiedliche FVIII-Aktivitäten aufwiesen.
2.6.2. Substitution von Faktorkonzentraten und FEIBA
Die klassische Therapie der humanen Hämophilie A oder B besteht in der Substitution von
Blutungskrisen oder häufigen Sekundärfolgen der Hämophilie, wie Arthropathien, entgegen zu wirken (FISCHER et al. 2003). Die Dosierungen der Faktorkonzentrate für Langzeitbehandlungen richten sich, in Ermangelung weiterer Studien, nach dem Malmö- Regime, dem Goldstandard der prophylaktischen Behandlung mit Faktorkonzentraten (LJUNG 1998). Die TG könnte sich als wertvolles Instrument für die Individualisierung der Therapie und Prophylaxe der Hämophilie A herausstellen, insbesondere im Hinblick auf die Kosten für eine prophylaktische Behandlung und die limitierte Verfügbarkeit der Präparate (TURECEK et al. 2003; DARGAUD et al. 2005b; BELTRAN-MIRANDA et al. 2005;
DARGAUD et al. 2009; SALVAGNO et al. 2009). Einige Studien halten eine Faktorbestimmung für die Einschätzung der Effektivität der Therapie mit Gerinnungsfaktorkonzentraten für nicht ausreichend (DARGAUD et al. 2009; ANSTRÖM et al. 2004). Die vorhandenen Dosierungsschemata neigen tendenziell zu einer Überdosierung, da die minimal notwendige Faktoraktivität, um Blutungen zu unterbinden, nicht bekannt ist (DARGAUD et al. 2009). So konnten LEWIS et al. (2007) und DARGAUD et al. (2009) zeigen, dass 24 Stunden nach der Applikation von FVIII-Konzentraten die FVIII-Aktivität der Patienten zwar gleich waren, jedoch die verschiedenen Parameter der TG unterschiedlich hoch ausfielen, daher könnte die Messung der TG ein nützliches Hilfsmittel für die individuelle Dosisanpassung darstellen.
In einigen Fällen reagieren Patienten zudem auf die Gabe von Faktorkonzentraten mit einer immunologischen Reaktion. Die Folge ist die Bildung von Alloantikörper gegen die applizierten exogenen Faktoren, wodurch deren Wirkung neutralisiert wird (DARGAUD &
NEGRIER 2010). Solchen Hämophilie A-Patienten kann mit FEIBA (Factor eight inhibitor by-passing activity) geholfen werden. Es handelt sich dabei um ein Konzentrat aus einem partiell aktivierten Prothrombinkomplex (NEGRIER et al. 2006). Weiterhin kann der rekombinante aktivierte FVII (rFVIIa) zur Behandlung eingesetzt werden (ROBERTS et al.
2004). Allerdings werden individuell unterschiedliche Reaktionen der Patienten auf eine solche Therapie beobachtet (BERNTROP 2009). Daher wurde in mehreren Studien der Einfluss von FEIBA auf die Parameter der TG untersucht. TURECEK et al. (2003) stellten fest, dass sich der Thrombinpeak nach der Gabe von FEIBA dosisabhängig erhöht und normale Werte ab einer applizierten FEIBA-Konzentration von 1 U/ml erreichte können. Die Autoren halten daher die Messung der TG geeignet für das Monitoring einer solchen
Therapie. Auch VARADI et al. (2003) sehen in der Messung der TG eine vielversprechende Möglichkeit die pharmakologischen und pharmakokinetischen Wirkungen von z.B. FEIBA zu überwachen und die Therapie mit solchen Präparaten zu optimieren. In ihrer Studie konnten sie ebenfalls die dosisabhängige Erhöhung des Peaks und ETPs nach der Applikation von FEIBA nachweisen.
2.6.3. Entzündungen
Systemische Entzündungsgeschehen erhöhen das Risiko für thrombotische Komplikationen deutlich (MIEHSLER et al. 2004). SAIBENI et al. (2009) haben die Auswirkungen der Inflammatory Bowel Disease (IBD) des Menschen auf die Hämostase untersucht. Dafür wurden die Aktivität von FII und FVIII und von Protein C bestimmt und es erfolgte die Messung der TG nach der CAT-Methode. Für den FVIII und das Protein C konnte eine erhöhte Aktivität bei IBD-Patienten nachgewiesen werden. FII blieb unverändert. Das ETP der IBD-Patienten zeigt keinen signifikanten Unterschied zu gesunden Menschen. Jedoch konnte eine signifikante Erhöhung des ETPs bei IBD-Patienten gegenüber gesunden Menschen nach Zugabe von Thrombomodulin zum Plasma nachgewiesen werden.
Die Auswirkungen der IBD auf die Hämostase von Kindern wurden ebenfalls mittels der CAT-Methode untersucht, mit dem Ergebnis, dass das ETP, die Latenzzeit und die Zeit bis zum Peak beim Vorliegen dieser Erkrankung signifikant ansteigen (BERNHARD et al. 2009).
COLLINS et al. (2006) und PETROS et al. (2011) untersuchten die Auswirkungen der Sepsis auf die TG-Parameter. Es konnte, bezogen auf Kontrollplasmen gesunder Menschen, eine Verlängerung der Latenzzeit und der Zeit bis zum Peak und eine reduzierte Peakhöhe nachgewiesen werden. Das ETP blieb hingegen unverändert. COLLINS et al. (2006) vermuten, dass die geringeren Aktivitäten von FII, VII und X, welche sie bei den Sepsispatienten nachweisen konnten, ursächlich für die Veränderungen der TG-Parameter gegenüber gesunden Menschen sind.
2.6.4. Thrombosen
Es wurden etliche Risikofaktoren beschrieben, welche die Entstehung einer Thrombose begünstigen sollen. Dazu zählen ererbte Faktoren, wie ein Defizit von Antithrombin (WIELDERS et al. 1997; REGNAULT et al. 2004), ein Überschuss an Prothrombin (KYRLE et al. 1998), die FV-Leiden-Mutation (LINCZ et al. 2006) und die FII-G20210A-Mutation (HÉZARD et al. 2006), bei welcher die Patienten einen erhöhten Thrombinpeak aufweisen, im Vergleich zu Patienten ohne diese Mutation (396,1 nmol/l vs. 353,6 nmol/l). Eine hohe Plasmaaktivität von FVIII konnte ebenso in einen Zusammenhang mit Thromboserezidiven gebracht werden (KEARON 2004). Zu den erworbenen Faktoren müssen die Einnahme oraler Kontrazeptiva (ROTTEVEEL et al. 1993; NICOLAES et al. 1997; ROSING et al. 1997;
CHANTARANGKUL et al. 2003), chirurgische Eingriffe, maligne Tumore, Schwangerschaft und Immobilisation (EICHINGER et al. 2007) gerechnet werden.
Die Messung der TG nach der CAT-Methode ermöglicht auch die Diagnostizierung von Hyperkoagulopathien und scheint somit geeignet das individuelle Thromboserisiko eines Patienten abschätzen zu können (HEMKER et al. 2002). Zahlreiche Studien beschreiben einen Zusammenhang zwischen einem erhöhten Thrombingenerierungspotential und dem erhöhten Rezidivrisiko für venöse Thromboembolien (REGNAULT et al. 2004; EICHINGER et al. 2008). EICHINGER et al. (2008) konnten nachweisen, dass die Höhe des ETPs und der D-Dimere mit dem Risiko eines Rezidivs assoziiert sind. HRON et al. (2006) stellten die Hypothese auf, dass Patienten mit einer vorangegangen venösen Thrombembolie anhand der Messung der TG in Risikogruppen bezüglich der Rezidivgefahr eingeteilt werden könnten.
Um diese Hypothese zu bestätigen, wurde die TG von 914 Patienten mit einer ersten spontanen venösen Thrombembolie gemessen. Die Patienten wurden im Mittel 13 Monate nach Beendigung der Therapie mit Antikoagulanzien in die Studie eingeschlossen. Das Zitratblut wurde abzentrifugiert und bis zur Messung der TG bei -80°C gefrierkonserviert.
Die Messung erfolgte mit der TGA-Methode (Technoclone). Für die Initiierung der TG wurde ein rekombinanter humaner TF in einer Konzentration von 71,6 pmol/l verwendet und eine PL-Lösung mit einer Konzentration von 3,2 µmol/l. Patienten mit einem Rezidiv wiesen einen signifikant höheren Thrombinpeak (419 nmol/l) auf, als solche ohne Rezidiv (349 nmol/l).
EICHINGER et al. (2008) beschrieben für Patienten mit einem Peak < 400 nmol/l ein 60%
niedrigeres Risiko, nach Absetzten der Therapie mit Vitamin K-Antagonisten, ein Thromboserezidiv zu erleiden. Einer Studie von VAN HYLCKAMA VLIEG et al. (2007) zu
Folge haben Menschen mit einem erhöhten ETP, bezogen auf Kontrollgruppen, ein 1,5 fach höheres Risiko eine tiefe Beinvenenthrombose zu erleiden. Auch Patienten, welche einen Schlaganfall erlitten haben, zeigen ein signifikant höheres Thrombinpotential als gesunde Menschen (FABER et al. 2003).
2.6.5. Einfluss verschiedener Antikoagulanzien
2.6.5.1. Niedermolekulare und unfraktionierte Heparine
Niedermolekulare und unfraktionierte Heparine verstärken die Wirkung des Antithrombins, um das etwa Tausendfache. Antithrombin hat eine inhibierende Wirkung vor allem auf Thrombin und den FXa (BÉGUIN et al. 1999). Der Einsatz von Heparin und Thrombininhibitoren ist aufgrund der Applikationsart limitiert (HIRSH et al. 2001). Das Monitoring der Heparintherapie erfolgt durch die Messung der aktivierten partiellen Thrombinzeit (APTT) und durch die Bestimmung der Anti-FXa-Aktivität (HIRSH er al.
2001). Die Messergebnisse der APTT sind jedoch stark von den verwendeten Reagenzien und Messinstrumenten abhängig (BJORNSSON & NASH 1986; VAN DEN BESSELAAR et al.
1995). Weiterhin zeigen sich in den pharmakodynamischen Eigenschaften des Heparins zwischen verschiedenen Individuen deutliche Schwankungen (BENCHEKROUN et al. 1986).
Für den Menschen konnten verschiedene Einflussfaktoren nachgewiesen werden, welche die Wirkung des Heparins beeinflussen können, dazu zählen u.a. Schwangerschaft (SEPHTON et al. 2003), Körpergewicht (AL DIERI 2006), Nierenerkrankungen (VERMYLEN et al. 1987;
BROPHY et al. 2006) und Thrombosen (WHITE et al. 1997). Für ca. 10% der humanen Bevölkerung ist der Effekt des Heparins sogar derart gering, dass manche Autoren die Diagnose einer Heparinresistenz für gerechtfertigt halten würden (LEGNANI et al. 2002).
Heparin wird in der Humanmedizin in Standarddosierungen verabreicht, welche sich an Studien orientieren, die die Sicherheit und Effektivität dieser Dosierungen erprobt haben (HIRSH et al. 2001). Es ist allerdings bekannt, dass beispielsweise bei übergewichtigen Menschen eine Dosisanpassung von Vorteil wäre (FREDERIKSEN et al. 2003).
Daher haben AL DIERI et al. (2004) zur Einschätzung der Effektivität einer Heparintherapie die Eignung der Messung der TG überprüft. In dieser Studie wurde die TG nach einer chromogenen Methode bestimmt, wie es auch schon von WIELDERS et al. (1997)
Heparinplasmaaktivitäten, welche den Peak und das ETP signifikant reduzieren, zu keiner nennenswerten Verlängerung der APTT führten. ROBERT et al. (2009) berichten in einer Studie über den Einfluss verschiedener Antikoagulanzien auf die TG-Parameter. Dabei führte Enoxaparin zur effektivsten Reduzierung der Peakhöhe und des ETPs von allen getesteten Antikoagulanzien. Enoxaparin bewirkte zusätzlich eine deutlichere Verlängerung der Zeit bis zum Peak als der Latenzzeit. Auch GATT et al. (2008a) konnten für fünf verschiedene Heparine einen dosisabhängigen Effekt auf die TG-Parameter nachweisen. Mit steigender Konzentration des jeweiligen Gerinnungshemmers verlängerten sich die Latenzzeit und die Zeit bis zum Peak und reduzierten sich der Peak und das ETP.
2.6.5.2. Vitamin-K Antagonisten
Oral applizierbare Vitamin K-Antagonisten, wie beispielsweise Warfarin, verhindern in der Leber die Reduktion von Vitamin K, welches bei der γ-Carboxylierung von FII, VII, IX und X mitwirkt. Die Standardüberwachungsmethode der Therapie mit oralen Vitamin K- Antagonisten ist die Bestimmung der INR (International normalized ratio), anhand der Messergebnisse der Prothrombinzeit (PT) (HIRSH & POLLER 1994; GEROTZIAFAS et al.
2005). ALTMAN et al. (2007) haben den dosisabhängigen Einfluss von Vitamin K- Antagonisten auf die Parameter der TG untersucht. Die Behandlung mit Warfarin bewirkte dabei eine Erniedrigung des ETPs und des Thrombinpeaks und verlängerte die Latenzzeit und die Zeit bis zum Peak. Es zeigt sich außerdem eine deutliche Variation der TG trotz gleicher INR. So zeigte beispielsweise ein Patient mit einer INR von 2,3 ein ETP von 233 nmol/l/min, ein anderer Patient mit derselben INR jedoch ein ETP von 840 nmol/l/min (GATT et al.
2008b).
2.6.5.3. Thrombozytenaggregationshemmer
Thrombozytenaggregationshemmer, dieser Gruppe zugehörig sind Aspirin, Clopidogrel und Abciximab, behindern die Anheftung der Plättchen an die Gefäßwand. Clopidogrel, ein potenter und selektiver Inhibitor der ADP-induzierten Plättchenaggregation, führte im Tierversuch mit Ratten bei einer Dosierung von 25 mg/kg per os zu einer signifikanten
