Evaluation der Effekte des endogenen NO-Synthase-Inhibitors Asymmetrisches Di-Methylarginin (ADMA) auf die zerebrale Perfusion und die arterielle Compliance bei gesunden Probanden: eine doppelblinde, Placebo-kontrollierte Studie

Aus der Abteilung Nephrologie des Zentrums Innere Medizin der

Medizinischen Hochschule Hannover

(Direktor: Prof. Dr. med. H. Haller)

Evaluation der Effekte des endogenen NO – Synthase - Inhibitors Asymmetrisches Di - Methylarginin (ADMA)

auf die zerebrale Perfusion und die arterielle Compliance bei gesunden Probanden: eine doppelblinde, Placebo - kontrollierte Studie

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Humanmedizin in der Medizinischen Hochschule Hannover

Erarbeitet und vorgelegt von Sandra Gasper

aus Wolfen

Angenommen vom Senat der Medizinischen Hochschule Hannover am 05.03.2007 Gedruckt mit Genehmigung der Medinzinischen Hochschule Hannover

Präsident: Prof. Dr. Dieter Bitter – Suermann Betreuer: Prof. Dr. Danilo Fliser

Referent: Prof.’in Dr. Karin Weißenborn Korreferent: Prof. Dr. David Groneberg

Tag der mündlichen Prüfung: 05.03.2007

Promotionsausschussmitglieder:

Prof. Dr. Michael Peter Manns Prof. Dr. Arnold Ganser

Frau Prof.’in Dr. Marion Haubitz

Meiner Tochter Hannah

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung...6

2. Grundlagen...9

2.1. Regulation des zerebralen Blutflusses ...9

2.2. Risikofaktoren des Apoplex...12

2.3. NO...15

2.3.1. NO-Synthese...15

2.3.2. NO-Stoffwechsel ...17

2.4. ADMA ...18

2.4.1. ADMA - Synthese ...19

2.4.2. ADMA - Stoffwechsel ...20

2.4.3. Ursachen eines erhöhten ADMA - Spiegels ...22

2.5. Augmentationsindex ...23

3. Fragestellung...26

3.1. Zielsetzung...26

4. Methoden ...27

4.1. Probanden ...27

4.1.1. Ein- und Ausschlusskriterien ...27

4.2. Ablauf der Untersuchung...28

4.2.1. Gliederung des Untersuchungungsablaufes...28

4.2.1.1. Ruhephase...29

4.2.1.2. Infusionsphase ...29

4.2.1.3. Messphase...30

4.3. Probenasservation ...31

4.4. ADMA- Bestimmung ...31

4.5. Bestimmung des Augmentationsindex ...33

4.6. Hirnperfusionsmessung mittels MRT...34

4.6.1. T2-gewichtete Sequenz mit Flüssigkeitsunterdrückung (FLAIR)...35

4.6.2. Diffusionsgewichtete Sequenz (GR EPI – DWI) ...35

4.6.3. TOF (Time of flight)...36

4.6.4. EPI – echoplanar imaging...36

5. Ergebnisse...39

5.1. Probandendaten...39

5.2. ADMA ...41

5.3. Zerebraler Blutfluss ...43

5.4. Augmentationsindex ...46

6. Diskussion...48

6.1. Probandendaten...48

6.2. ADMA ...48

6.3. Zerebrale Perfusion...49

6.4. Augmentationsindex ...50

7. Zusammenfassung ...52

8. Ausblicke und Möglichkeiten ...53

9. Abkürzungsverzeichnis...54

10. Probandeninformation ...56

11. Veröffentlichung...58

12. Literaturquellen...65

11. Danksagung ...78

12. Erklärung nach § 2 Abs. 2 Nm. 5 und 6 ...79

13. Curiculum vitae...80

1. Einleitung

Jährlich erleiden deutschlandweit ungefähr 300.000 und in den USA circa 750.000 Menschen einen Schlaganfall. Laut statistischem Bundesamt muss ungefähr die Hälfte der hierzulande Erkrankten stationär behandelt werden, im Durchschnitt für die Dauer von 43 Tagen. Der insgesamt resultierende Pflegebedarf führt zu einer psychosozialen Belastung des Einzelnen sowie zu einer erheblichen ökonomischen Belastung der Kostenträger.¹ Die Gesamtkosten werden im Mittel auf 7,2 Milliarden Euro pro Jahr in Deutschland geschätzt, wobei nur die Behandlungskosten und nicht die Rehabilitationskosten berücksichtig wurden.

Der Schlaganfall steht an dritter Stelle der häufigsten Erkrankungen mit Todesfolge in der Bundesrepublik Deutschland (Letalität 10%

)

Abbildung 1: Sterblichkeit laut Gesundheitsbericht des Statistischen Bundesamtes 1998

Für den umgangssprachlich genannten Schlaganfall existieren verschiedene Synonyme, wie der zerebrale Insult, der Apoplex oder die zerebrale Ischämie.

Die Menschen, die einen Schlaganfall überleben, erleiden häufig erhebliche neurologische Ausfälle. Beispielsweise ist eine Hemiparese oft Symptom der zerebralen Ischämie, meist mit guter Rückbildungstendenz. Des Weiteren sind insgesamt 25000 Patienten mit Aphasie bei Zustand nach einem zerebralen Insult zu behandeln.

Motorische Störungen wie Chorea und Athetose kommen ebenso wie sensorische

Störungen (Hyperpathie, Allodynie) vor. Je nach Lokalisation der Infarktzone ergeben sich entsprechende Symptome. Nur ein Fünftel der Erkrankten können wieder so leben wie vor dem Schlaganfall. Von den Erkrankten sind mehr als 80 % über 65 Jahre alt und 10 % unter 40 Jahre alt.

Pathophysiologisch betrachtet, ist eine der Ursachen für eine zerebrale Ischämie der thrombotische oder thrombembolische Verschluss eines hirnversorgenden Gefäßes mit konsekutiver Reduktion des zerebralen Blutflusses. Daraus resultiert eine Hypoxie, wobei der Verlust der ATP – Reserven über die Aktivierung verschiedener Signalkaskaden den Gewebsschaden herbeiführt.

Die Einteilung des Apoplex erfolgt nach klinischen Verlaufsstadien in

1. die transitorisch – ischämische Attacke (TIA, vollständige Rückbildung des neurologischen Defizits innerhalb der ersten 24 Stunden),

2. das prolongierte reversible ischämisch neurologische Defizit (PRIND, Rückbildung der Symptomatik zwischen den ersten 24 Stunden und 7 Tagen), 3. den progredienten Schlaganfall (ohne vollständige Reversibilität)

4. sowie den kompletten Hirninfarkt.

Derzeit beruht die Akuttherapie und Sekundärprävention auf der Gabe thrombolytischer oder thrombozytenaggregationshemmender Medikamente.² Selten kann in zeitnah diagnostizierten Fällen nach entsprechender Risiko – Nutzen – Abwägung auch lokal, intraarteriell die Lyse des Thrombus angiographisch gestützt durchgeführt werden.

Unter klinischem Aspekt fällt auf, dass Erkrankungen und Zustände, die als etablierte Risikofaktoren für einen zerebralen Insult angesehen werden¹, auch mit einem erhöhtem ADMA - Spiegel einhergehen, wie z.B. hohes Alter^{4, 5}, Diabetes^{6, 7}, Hypertonus^{4, 5}, Atherosklerose der A. carotis^{5, 8}, Hyperlipidämie^9-11 und Sichelzellanämie.¹² Aber auch weniger gut etablierte Risikofaktoren für einen zerebralen Insult¹ wie Hyperhomocysteinämie^{13, 14}, Übergewicht^{15, 16} und Entzündungen ^{8, 17} sind Erkrankungen, bei denen erhöhte ADMA - Spiegel auftreten.

Seit der Entdeckung der neuronalen Stickstoffmonoxid - Synthase (nNOS) im Gehirn und in den Hirngefässen³ gibt es zunehmend Beweise dafür, dass NO die entscheidende Rolle bei der Regulation der zerebralen Perfusion spielt. Der Basaltonus der Hirnarterien wird von verschiedenen Stoffen moduliert, wobei NO eine Vasodilatation auslöst. Die Synthese des Stickstoffmonoxids wird durch die NO – Synthase katalysiert.

naheliegend, zu vermuten, dass der endothelialen Dysfunktion und somit einer gestörten zerebralen Perfusion eine Dysregulation in der NO – Homöostase zugrunde liegt.

Folglich zeigt sich ein am ehesten direkter Zusammenhang zwischen einem erhöhten Risiko für einen Schlaganfall und erhöhten ADMA - Spiegeln. Yoo et Lee formulierten jedoch auch, dass noch zu klären ist, ob ein erhöhter ADMA – Spiegel die Ursache oder die Folge eines Apoplex ist.¹⁸

Die Ursache des statistisch signifikanten Zusammenhangs zwischen Apoplex und erhöhten ADMA – Serumwerten könnte in einer verminderten arteriellen Compliance liegen, welche ein unabhängiger Prädiktor von zerebrovaskulären Ereignissen sowie von kardiovaskulären Ereignissen ist^{19, 20} und direkt von der NO - Verfügbarkeit abhängt.^19-22 Die Ergebnisse mehrerer in vitro - Studien und tierexperimenteller Arbeiten zeigten, dass ADMA den Tonus der zerebralen Gefäße beeinflussen kann.^23-25

Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, den Einfluss von ADMA auf die zerebrale Perfusion und die Gefäßsteifigkeit bei gesunden Probanden zu evaluieren.

Es wurde auch gemutmaßt, dass ADMA wesentlich zum erhöhten Tonus der arteriellen Gefäße beiträgt.²⁶ Die Funktion des Gefäßendothels wird durch das Vorhandensein und die Verfügbarkeit von e – NOS moduliert. Daher wurde im Rahmen dieser Studie die Änderung des Augmentationsindex, einem etablierten Parameter der Gefäßelastizität, unter ADMA– Gabe untersucht.

2. Grundlagen

2.1. Regulation des zerebralen Blutflusses

Das zentrale Nervensystem ist nach der Niere das Organ mit dem höchsten Blutfluss und der effektivsten Sauerstoffausnutzung im Körper. Das Gehirn erhält 15 – 20 % des normalen Herzzeitvolumens (circa 700 – 900 ml/min), obwohl das Gewicht des Gehirns nur 2 % des Körpergewichtes beträgt. Es verbraucht 20 % des gesamten Sauerstoffbedarfs des Körpers.

Um den zerebralen Blutfluss den wechselnden metabolischen Bedarfszuständen des Gehirns anzupassen, ist eine strikte Autoregulation der zerebralen Durchblutung innerhalb enger Grenzen erforderlich. Unter Autoregulation versteht man die Fähigkeit, den CBF trotz Änderungen im Perfusionsdruck konstant zu halten. Bei einem mittleren Blutdruckwert zwischen 50 und 150 mm Hg systolisch wird der CBF unter physiologischen Bedingungen konstant gehalten. Dabei gilt folgende Abhängigkeit.²⁷

NO ist der wichtigste Vasodilatator bei der Regulation des CBF. Es beeinflusst wesentlich den Tonus der Arterien aber auch der Venen im zerebralen Stromgebiet.^{2, 28} Eine Vielzahl experimenteller Studien konnte die Bedeutung von NO für die Regulation des Tonus der zerebralen Gefäße ^23-25 und für den zerebralen Blutfluss belegen.²⁹

Unter physiologischen Bedingungen wird die zerebrale Perfusion über Veränderungen des Widerstandes der Gefäße reguliert. Zerebral nehmen auch die größeren Gefäße an der Regulation des Widerstandes der zerebralen Zirkulation teil, beispielsweise die Arteria cerebri media.³⁰

Die Modulation des Gefäßtonus ist eng mit dem Gefäßaufbau verknüpft. Entsprechend den drei Schichten einer Gefäßwand (Tunica interna, media et adventitia) unterscheidet man das Endothel, die glatten Muskelzellen und die Glia sowie die terminalen Nervenfasern.

Je nach Bedarf werden konstringierende oder dilatierende Faktoren aus den

Endothelin (ET), Thromboxan A2 (TxA2), Endothelium-derived-constricting-factor (EDCF) sowie Leukotriene.

Faktoren, die eine Vasodilatation auslösen, sind Endothelium-derived-relaxing-factor (NO), Prostazyklin (PGI2)³¹ sowie Endothelium-derived-hyperpolarizing-factor (EDHF). Stimuli für eine endotheliale Mediatorenfreisetzung können Neurotransmitter (Acetylcholin, Noradrenalin), Autakoide (z.B. Bradykinin) oder Scherstress sein.

Lokal chemische Mediatoren, die direkt an den glatten Muskelzellen der Gefäße wirken, werden aus dem Hirnparenchym freigesetzt. Dabei wird eine Vasodilatation zum Beispiel durch die Erhöhung der CO₂ - Konzentration, die Erniedrigung des pH - Wertes, Kaliumkonzentrationen zwischen 3 und 20 mM sowie durch die Erhöhung der perivaskulären Osmolarität herbei geführt. Adenosin und ATP bewirken ebenso eine Vasodilatation.³²

Die zerebralen Arterien werden von verschiedenen neurogenen Systemen innerviert.

Die neuronale Aktivität und der lokale CBF können eng miteinander gekoppelt sein, bekannt als neurovaskuläre Kopplung.³³ Dabei führt die Stimulation des Symphatikus (über Noradrenalin und Neuropeptid Y) und des zentralen aminergen Systems (Noradrenalin und Serotonin) zur Vasokonstriktion. Hingegen wird durch die Anregung des Parasympathikus (Mediatoren sind hier das Acetylcholin sowie vasoaktives intestinales Peptid) und des N. trigeminus (Substanz P) eine Vasodilatation ausgelöst.

Der CBF ist rein physikalisch betrachtet vom zerebralen Perfusionsdruck (CPP) und dem zerebrovaskulären Widerstand (CVR) abhängig. Er wird analog zum Ohmschen Gesetz als Quotient des zerebralen Perfusionsdruckes und dem Gefäßwiderstand berechnet:

CBF = CPP/CVR

Dabei errechnet sich die Höhe des Perfusionsdruckes aus dem mittleren arteriellen Blutdruck (MAD) und dem intrakraniellen Druck (ICP):

CPP = MAD – ICP

Da sich der zerebrovaskuläre Widerstand aus dem Hagen – Poiseuilleschen – Gesetz ableitet, wird deutlich, dass dieser vom Gefäßdurchmesser abhängt.

CVR = l x ⁴

Dabei ist l die Länge des Gefäßes,

Demnach führt die Vasokonstriktion (Ursachen siehe oben) zur Erhöhung des Widerstandes und eine Vasodilatation zur Abnahme des Gefäßwiderstandes, wovon die zerebrale Perfusion abhängt.

Es gibt folgende, derzeit klinisch angewandte Möglichkeiten, die Hirndurchblutung zu messen:

- Transkranielle Dopplersonografie - Stable- Xenon- Computertomografie - Positronenemissionstomographie - Magnetresonanztomografie.

In der Literatur finden sich für die unterschiedlichen Messmethoden verschiedene Werte für den zerebralen Blutfluss.

Tabelle 1: Messung des zerebralen Blutflusses Arbeits- CBF

gruppe

Anzahl der Probanden

Probanden-

alter Messmethode

ml/min/100g ml/min Kety &

Schmidt (1948)³⁴

NO 54 756*

Nylin et al.

(1961)³⁵

10 34 ± 6 markierte

Erythrozyten k. A. 879 ± 55

Shirahata et al.

(1985)³⁶

39 43 ± 13 133Xe

SPECT 56 ± 8 784 ± 91*

Müller et al.

(1988)³⁷

100 45

Duplex (totaler jugulärer Blutfluss in

ml /min)

63 ^# 839 ± 226

Marks et al.

(1992)³⁸

24 44 MRT 65 858 ± 36

* berechnet für ein Hirngewicht von 1400 g

# berechnet für ein durchschnittliches Hirngewicht von 1252 g für Frauen und 1392 g

Die Literaturübersicht erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit und ist insbesondere keine Metaanalyse aller publizierten Studien.

Da wir im Rahmen unserer Studie gesunde Probanden untersuchten, nutzten wir die strahlungsfreie, nebenwirkungsarme, minimal invasive Methode der Magnetresonanztomografie, um reproduzierbare, aussagekräftige Werte des zerebralen Blutflusses zu erzielen.

2.2. Risikofaktoren des Apoplex

Goldstein et al. teilen die Risikofaktoren eines Apoplex in nicht modifizierbar, modifizierbar und potentiell modifizierbar ein.¹

Nicht modifizierbare Risikofaktoren sind Alter, Geschlecht, ethnische Zugehörigkeit und die Familienanamnese hinsichtlich Apoplex. Mit zunehmendem Alter steigt das Risiko, einen cerebralen Insult zu erleiden. Nach dem 55. Lebensjahr verdoppelt sich das Risiko in jeder Lebensdekade. Männer weisen eine höhere Prävalenz auf als Frauen. Jedoch ist die Zahl der Todesopfer durch einen Apoplex deutlich höher in der weiblichen Bevölkerung (z.B. waren 1997 60,8 % der Todesopfer durch einen Schlaganfall Frauen). Rodriguez et al. wiesen geschlechtsabhängige Unterschiede der regionalen CBF-Werte nach, wobei die Frauen in jeder Altersgruppe um 11% höhere CBF-Werte zeigten.³⁹

höhere Inzidenz und Mortalität als Kaukasier (93/100000). Bei einem zerebrovaskulären Ereignis in der mütterlichen Anamnese steigt das relative Risiko auf 1,4 und gab es in der Familie väterlicherseits einen Apoplex, liegt das relative Risiko einen Apoplex zu erleiden bei 2,4.

Modifizierbare Risikofaktoren sind Hypertonus, Rauchen, Diabetes, asymptomatische Carotisstenose, Sichelzellanämie (Risikoreduktion bei regelmäßigen Bluttransfusionen laut der STOP – Studie bei Senkung des Hb S), Hyperlipidämie sowie Kammerflimmern.

Bei Hypertonikern steigt ab dem 50. Lebensjahr das relative Risiko auf 4, einen Apoplex zu erleiden, bei Rauchern auf 1,8. Bei Diabetes mellitus steigt das relative Risiko auf 1,8 bis 6. Patienten mit asymptomatischer Carotisstenose weisen ein relatives Risiko, einen zerebralen Insult zu erleiden von 3 auf. Patienten mit Sichelzellanämie

zeigen ohne Therapie ein fulminant hohes relatives Risiko von 200 bis 400, weisen jedoch auch eine Risikoreduktion um 91 % bei effektiver Behandlung (Bluttransfusionen) auf. Patienten mit einer Hyperlipidämie zeigen bei einer Therapie mit Statinen eine Risikoreduktion von 20 – 30 % auf, wobei das Risiko von der der Konzentration der Blutfettwerte abhängt und positiv korreliert. Das erhöhte relative Risiko unter Kammerflimmern kann mit einer Warfarintherapie erheblich gesenkt werden. Zusammenfassend stellten Goldstein et al. fest, dass mit zunehmendem Alter die jährliche Ereignisrate steigt und mit Vorliegen von Risikofaktoren diese nochmals angehoben wird.¹

Potentiell modifizierbare Risikofaktoren sind Adipositas (Relatives Risiko (RR) 1,75 – 2,37), fehlende körperliche Bewegung (RR 2,7), Alkoholabusus (mengenabhängig RR 1,6 -1,8), Hyperhomocysteinämie (alters- und geschlechtsabhängig zwischen RR 1,3 – 2,3), Drogenmissbrauch, orale Kontrazeptiva (RR 0,6 -7,09), postmenopausale Hormontherapie (RR 0,23 – 1,46), entzündliche Alterationen des Gefäßendothels (Atherosklerose) sowie Gerinnungsstörungen (Faktor V – Leiden, APC – Resistenz, Prothrombin 20210 Mutation, Protein C- bzw. S – Mangel).

Tabelle 2: Zusammenfassung der Risikofaktoren des Apoplex¹ Nicht modifizierbare

Risikofaktoren

Modifizierbare

Risikofaktoren Potentiell modifizierbare Risikofaktoren Alter Hypertonus Adipositas

Geschlecht (männlich) Diabetes mellitus Fehlende körperliche Bewegung Ethnische Zugehörigkeit Rauchen Alkoholabusus

Familienanamnese Asympt.

Carotisstenose Hyperhomocysteinämie Sichelzellanämie Drogenabusus

Hyperlipidämie Orale Kontrazeptiva

Kammerflimmern Postmenopausale Hormontherapie

Entzündliche Alterationen des Gefäßendothels

Gerinnungsstörungen

keine der oben genannten Risikofaktoren vorliegen. Leiden ältere Menschen an mehreren Risikofaktoren, steigert sich die jährliche Ereignisrate im Alter erheblich.

Tabelle 3: Jährliche Ereignisraten des Apoplex nach Risikostratifizierung¹

Erkrankungen, die als Risikofaktoren des Apoplex gelten und bei denen ein erhöhter ADMA – Spiegel in Studien nachgewiesen werden konnte, sind zum Beispiel der Hypertonus, die Arteriosklerose, Diabetes mellitus, Hypercholesterinämie, Rauchen sowie Hyperhomocysteinämie.

Abbildung 2: Erkrankungen und Eigenschaften, bei denen erhöhte ADMA – Spiegel nachgewiesen wurden und die als Risikofaktoren des Apoplex gelten

Es ist also nahe liegend zu vermuten, dass bei erhöhten ADMA – Spiegeln aufgrund der endothelialen Dysfunktion ein am ehesten direkter Zusammenhang zum erhöhten Schlaganfallrisiko besteht.

Alter Jährliche Ereignisrate ohne Risikofaktoren in %

Jährliche Ereignisrate mit Risikofaktoren

< 65 Jahre 1,0 4,9

65 -75 Jahre 4,3 5,7

> 75 Jahre 3,5 8,1

Modifizierbare Risikofaktoren:

Hypertonus Diabetes mellitus

Rauchen Asymptomatische

Carotisstenose Sichelzellanämie

Hyperlipidämie

Potentiell modifizierbare Risikofaktoren:

Fehlende körperliche Bewegung Hyperhomocysteinämie Entzündliche Alterationen

des Gefäßendothels Nicht

modifizierbare Risikofaktoren:

Alter

AD M A↑

2.3. NO

Stickstoffmonoxid (NO) ist der stärkste bekannte Vasodilatator. Erstmals wurde im Jahre 1879 in „The Lancet“ eine Studie über Angina - pectoris - Patienten veröffentlicht, bei denen die biologische Wirksamkeit von Nitroglycerin beschrieben wurde.⁴⁰ Nachfolgend gab es für mehrere Jahrzehnte keine richtungweisende Erklärung, worauf dieser beschriebene Effekt der besseren Durchblutung zurückzuführen sei. Bis dann im Jahre 1980 Robert Furchgott die Fähigkeit der Vasodilatation einem „vom Endothel gebildeten Relaxationsfaktor“ (EDRF) zuschrieb, der erst 1987 von Louis Ignarro⁴¹ und Salvador Moncada⁴² als NO identifiziert wurde. Für diese Entdeckung wurde neben Furchgott und Ignarro der Forscher Murad 1998 zu je einem Drittel mit dem Nobelpreis für Physiologie und Medizin 1998 geehrt.

2.3.1. NO-Synthese

NO entsteht bei der Umwandlung von L-Arginin zu L-Citrullin in zwei Teilschritten durch die Stickstoffmonoxidsynthase (EC 1.14.13.39.)⁴³ Initial wird an der terminalen Guanidino-Gruppe des Arginins ein Stickstoffatom oxidiert. Es wird das Zwischenprodukt Hydroxyarginin gebildet. Unter Abspaltung des freien Radikals NO entsteht dann die Aminosäure L-Citrullin.⁴⁴

Als Cofaktoren fungieren Nicotinamidadenindinucleotid (NADPH), Biopterin in Form von 6(R) - 5, 6, 7, 8 - Tetrahydrobiopterin, Flavinadenindinucleotid (FAD) und Flavinadeninmononucleotid (FMN).⁴⁵

L - Arginin NO + L-Citrullin

Abbildung 3: Die NO-Synthese

Tetrahydrobiopterin, FAD, FMN, O₂ NO-Synthase

NADPH NAD

L-Arginin ist eine semiessentielle Aminosäure (Strukturformel siehe Abbildung 6). Die beschriebene Reaktion läuft vorwiegend in der Endothelzelle ab⁴⁴, wobei die mit der Nahrung aufgenommenen 4-5 g L-Arginin täglich⁴⁶ nach Resorption über das Jejunum⁴⁷ mittels spezifischer Aminosäuretransporter dorthin gelangen.⁴⁸

Die NOS nimmt durch Bindung an Calmodulin (über eine Sequenz zwischen der Oxygenase- und Reduktasedomäne) ihre Funktion auf. Für diese Bindung wird Calcium benötigt.⁴⁹

Inzwischen sind drei verschiedene Formen der NO-Synthase identifiziert, die entsprechend der Reihenfolge ihrer Purifikation und der ersten Isolation ihrer cDNA nummeriert wurden.

Tabelle 4: Charakterisierung der Stickstoffmonoxidsynthase, Isoformen I – III^{50, 69}

NO-

Synthase Isoform I Isoform II Isoform III

Genort Chromosom 12 12q24.2→24.31

Chromosom 17 17p11→17q11

Chromosom 7 7q35→7q36

Bezeichnung

n-NOS b-NOS c-NOS bc-NOS

i-NOS mac-NOS

e-NOS EC-NOS

c-NOS (irreführend zur Bezeichnung der

Isoform I)

Vorkommen

Konstitutiv in neuronalen Zellen

(zentrales und peripheres Nervensystems)

Induzierbar von Zellen und Geweben in Abhängigkeit von Lipopolysacchariden und Cytokinen. Nicht im gesunden Gewebe.

Konstitutiv in arteriellen und venösen Endothelzellen, Synzytiotrophoblasten der humanen Plazenta, LLC-PK1-Epithelzellen

im Nierentubulus Wirkung des von

der Isoform produzierten NO

Neurotoxizität bei zerebraler

Ischämie

Verzögerter neuronaler Zelltod in der Spätphase der zerebralen Ischämie, Verschärfung der glutamatvermittelten Neurotoxizität.

Hauptregulator der vaskulären

Hämodynamik

(Hauptmessenger der die Dilatation der Blutgefäße bewirkt), neuroprotektiv

Molekulare Masse

160 kDa 130 kDa 130 kDa je Untereinheit

(hat zwei

Untereinheiten) Kofaktoren/

Induktoren

Calcium Calmodulin

Lipopolysaccharide Cytokine

Calcium Calmodulin Spezifische

Inhibitoren

7-Nitroindazol ARL 17477 BN 80933

Aminoguanidin 1400W

Des Weiteren wird NO auch von der glatten Gefäßmuskelzelle direkt⁵¹, von Neuronen, Astrozyten⁵² und von perivaskulären Nerven⁵³ ausgeschüttet.

2.3.2. NO-Stoffwechsel

Stickstoffmonoxid aktiviert die lösliche Guanylzyklase und führt durch die Bildung von cGMP zur Vasorelaxation. Dies wird durch Abnahme der intrazellulären Calciumkonzentration erreicht. Es wurden jedoch auch calciumunabhängige Signaltransduktionswege nachgewiesen, zum Beispiel die Modulation von Caspasen und Transkriptionsfaktoren über S- Nitrolysierung dieser Enzyme.⁵⁴

Die Zunahme der NO-Konzentration bei Freisetzung aus dem Endothel unterdrückt den vasokonstriktorischen Effekt von Noradrenalin, Endothelin, Angiotensin II und Serotonin.⁵⁵ NO als membranpermeabler parakriner Messenger, der in der glatten Gefäßmuskulatur die lösliche Guanylatzyklase aktiviert (indem er an das zweiwertige Eisen der hämhaltigen Untereinheit bindet und somit eine Konformationsänderung herbeiführt, die die Konversionsrate von GTP zu zyklischem GMP steigert) löst neben der Vasodilatation weitere Effekte aus:

- die Beeinflussung der Struktur der Gefäße mittels Proliferationshemmung der glatten Muskelzellen⁵⁶,

- Inhibition der Thrombozytenaggregation und Leukozytenadhäsion an das Endothel.^57,

58

Dabei fungiert cGMP als Second Messenger, der eine Vielzahl der biologischen Wirkungen von NO vermittelt.59, 60, 61 Die kontinuierliche Synthese von NO aus den Endothelzellen sorgt für die Aufrechterhaltung eines Basaltonus der Gefäßmuskulatur.

Aktuell zeigen neueste Untersuchungen, dass NO wohl auch eine essentielle Rolle bei der Mobilisation von endothelialen Progenitorzellen (EPC) spielt, die eine wichtige Rolle bei Reparaturprozessen spielen.⁶²

Die Lokalisation der NO – Signalkaskade in der Endothelzelle des Gefäßes zeigt die sofortige Verfügbarkeit bei Bedarfszuständen, um je nach Situation eine Vasodilatation zu ermöglichen. Dabei ermöglicht die enge Nachbarschaft zur Muskelzelle (Zielort) eine schnelle Wirkung.

Abbildung 4: Endothel und NOS mit NO - Signalkaskade

Aufgrund der beschriebenen Wirkungen wird deutlich, dass NO eine bedeutende Rolle im atherogenen Prozess zukommt, es wird auch als anti-arteriosklerotisch bezeichnet.^63,

64, 65, 66, 67

Ein NO – Mangel definiert daher ein frühes Stadium der Atherosklerose – die endotheliale Dysfunktion.⁶⁸

2.4. ADMA

ADMA steht für asymmetrisches N^G, N^G- Di-Methyl-L-Arginin und ist ein endogener Inhibitor der Stickstoffmonoxidsynthase (NOS).

Neben diesem gibt es weitere methylierte L-Arginin-Analoga wie N^G-Monomethyl-L- Arginin (L-NMMA), N^G-Nitro-L-Arginin (L-NNA) oder N^G-Nitro-L-Arginin- Methylester (L-NAME) und N^G, N^G-Dimethyl-L-Arginin (SDMA). Symmetrisches Dimethylarginin ist ein strukturelles Isomer von ADMA, das keinen Einfluss auf die NOS hat. Lediglich L-NMMA und ADMA hemmen die NOS.⁶⁹

Abbildung 5: Kompetitive Hemmung der NOS und folglich verminderte/fehlende NO – Bildung

ADMA fungiert als kompetitiver Inhibitor der NOS, indem es mit L - Arginin, dem Substrat der NOS, um eine Bindung am katalytischen Zentrum der Synthase konkurriert (Abbildung 5).

Der Grund für all die Bestrebungen, mehr über das Verhalten von ADMA im menschlichen Organismus zu erfahren, ist, dass ADMA in 10fach höherer Konzentration im Serum vorkommt als L-NMMA und der dominante endogene Inhibitor der NOS nach Angaben mehrerer Studien ist.

Seit 1992, als Vallance et al. erstmals über die Bedeutung des endogenen Inhibitors der NO – Synthase bei terminal niereninsuffizienten Patienten berichteten, nimmt das Interesse an ADMA stetig zu.⁷⁰ Seither wurden mehr als 500 Artikel zum Thema ADMA veröffentlicht.

2.4.1. ADMA - Synthese

Asymmetrisches Dimethylarginin ist eine natürlich vorkommende Aminosäure. Bei der Proteolyse methylierter Proteine entsteht der uns interessierende Stoff ADMA.⁷¹ Die endogene Entstehung und Verstoffwechselung findet in vielen verschiedenen Zellen statt.⁷² Das verantwortliche Enzym ist die Protein- Arginin- N- Methyltransferase (PRMT), die in zwei Typen unterteilt wird. Aktuell sind 7 Isoformen bekannt. PRMT

L-Arginin

Citrullin +

+

ADMA

NO

Inhibition

NOS

Asymmetrisches Dimethyl – L - Arginin

einfache Methylierung der beiden endständig vorkommenden Stickstoffatome, wodurch SDMA gebildet wird.^{73, 74}

Abbildung 6: Strukturformel von L – Arginin und dessen methylierte Analoga

Sowohl PRMT Typ I als auch Typ II bilden NMMA, was am ehesten als Zwischenstufe zur Bildung von SDMA und ADMA angesehen werden kann. Hauptquelle der Methylreste ist das S -Adenosylmethionin, ein Zwischenprodukt im Methionin - Homozystein – Stoffwechsel.^75,76 ADMA ist zu circa 2/3 intrazellulär an

„heterogeneous nuclear ribonuclear protein“ (hnRNP) gebunden. Dabei ist interessanterweise festzustellen, das hnRNP ein natürliches Substrat der PRMT Typ I ist. Weitere Substrate des Typ I der PRMT sind Histone, Fibrillarin und Nucleolin.⁷⁷ Fibrillarin ist als Bestandteil von U3RNP zuständig für das Splicing der Vorläufer der m- RNA.⁷⁸ Hingegen ist das Substrat der PRMT Typ II myelinbasisches Protein, welches Bestandteil der Myelinscheide nervaler Axone ist. Möglicherweise hängt die Stabilisierung und Integrität der Myelinscheide von der Methylierung von Argininresten ab.⁷⁹

2.4.2. ADMA - Stoffwechsel

Da Vallance et al. 1992 erhöhte ADMA- Spiegel bei Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz fanden, bestand lange die Annahme, dass ADMA vorwiegend renal ausgeschieden wird.⁷⁰

Tierexperimentelle Untersuchungen am Hasen veranlassten McDermott und Mitarbeiter jedoch bereits 1976 neben der renalen Exkretion einen Metabolismus für ADMA zu postulieren.⁸⁰ Im Jahre 1989 gelang Ogawa et al. das Enzym Dimethylamine-

Dimethylaminohydrolase (DDAH) zu identifizieren und charakterisieren, welches haupsächlich für den Abbau von ADMA verantwortlich ist.⁸¹

DDAH metabolisiert ADMA zu L-Citrullin und Dimethylamin. Zuletzt genanntes Molekül dient als Indexparameter für die Aktivität der DDAH. Es wurden bisher zwei Isoformen der DDAH nachgewiesen, Isoform I und II. Dabei ist die Isoform I vorwiegend bei Erkrankungen, die neuronale NOS exprimieren, anzutreffen und die Isoform II bei endothelialer NOS- Exprimierung.⁸² DDAH I ist im Bereich des Chromosom 1 kodiert und Isoform II bei Chromosom 6.⁸³

Hemmstoff der DDAH ist die S2-Amino-4/3-methylguanidino-Buttersäure , auch 4124W genannt.⁸⁴ Es konnte in vitro anhand von Rattenaortenringen und humanen Vena saphena –Präparaten eine signifikante Akkumulation von ADMA nach Zugabe von 4124 W nachgewiesen werden, die zur Vasokonstriktion führte. Dieser Effekt zeigte sich unter L-Arginin - Gabe reversibel. Dies war das erste Experiment welches die Bedeutung dieses Enzyms für die Regulation des ADMA- Spiegels belegte. Effektiv werden von täglich 300 µmol gebildetem ADMA mindestens 250 µmol durch die DDAH verstoffwechselt.⁸⁵

Tabelle 5: ADMA – Normalwerte⁸⁶

Arbeitsgruppe ADMA in µM Methode

Chen et al., 1997 0,84 ± 0,12 HPLC / FLU

Petterson et al., 1997 0,58 ± 0,02 HPLC / FLU

Meyer et al., 1997 0,4 HPLC / FLU

Causse et al., 2000 0,343 ± 0,022 CE / LIF

Vishwanathan et al., 2000 0,124 ± 0,046 HPLC / MS

Pi et al. 2000 0,30 ± 0,05 HPLC / FLU

Teerlink et al., 2002 0,42 ± 0,06 HPLC / FLU

Tsikas et al., 2003 0,390 ± 0,062 GC / MS-MS

Zhang and Kaye, 2004 0,763 ± 0,117 HPLC / FLU

Schulze et al, 2005⁸⁷ 0,69 ± 0,2 ELISA (DLD Diagnostics)

Martens – Lobenhoffer et al. bestimmten ein Referenzintervall für ADMA von 0,225 bis 0,485 µmol mit der HPLC – Massenspektroskopie.

Fasst man bisherige Erkenntnisse der Synthese und des Abbaus von ADMA zusammen, ergibt sich die folgende Übersicht.

Abbildung 7:Herkunft und Abbauwege von ADMA (nach Kielstein et al.⁸⁸)

2.4.3. Ursachen eines erhöhten ADMA - Spiegels

Erhöhte ADMA Spiegel wurden bei einer Vielzahl von Erkrankungen beschrieben. In verschiedenen Studien wurde eine Assoziation zwischen erhöhten ADMA – Spiegeln und kardiovaskulären Risikofaktoren nachgewiesen. Dazu gehören Alter, Hypertonus, Diabetes, Insulinresistenz, Hypercholesterinämie, Hypertriglyceridämie und Hyperhomocysteinämie.⁸⁹ Die hier genannten Faktoren erhöhen ebenso das Risiko, einen zerebralen Insult zu erleiden.

Die ADMA - Serumkonzentration ist abhängig von dessen Synthese und dem täglichen Abbau sowie der renalen Exkretion und liegt folglich über dem Normwert, wenn die Syntheserate erhöht oder der Abbau/die Ausscheidung vermindert ist.

Eine Rolle spielt die Zunahme der Expression des ADMA – bildenden Enzyms PRMT Typ I. Bisher ist bekannt, das oxidierte Lipoproteine und nLDL den PRMT-Spiegel um nahezu das Dreifache anheben. Verantwortlich hierfür wird die erhöhte Genexpression

L-Arginin

Protein

Protein mit ADMA

PRMT I

Hydrolyse

ADMA

NO

Alphaketonsäure Derivate

DPT

NOS

Cholesterol Homocystein Hyperglycämie

+ Citrullin

Citrullin + Dimethylamin

Renale Excretion Inhibition

D

D A H

Inhibition

IL-1 ß Östrogen

upregulation

der N-Methyltransferase gezeichnet.⁵⁷ Des Weiteren ist bekannt, dass Scheerstress die PRMT I – Expression in Endothelzellen und folglich auch das ADMA - Level erhöht.⁹¹ Eine weitere Rolle spielt die Hemmung des ADMA – Abbaus. Diese wird durch Inhibition der DDAH moduliert. Ito et al. zeigten, dass steigende LDL – Konzentrationen eine Senkung der DDAH – Aktivität verursachen.⁹¹ Hypercholesterinämie, Cytokine sowie eine diabetische Stoffwechsellage können die DDAH – Aktivität hemmen.^{6, 92}

Zusammenfassend ist festzuhalten, dass ein erhöhter ADMA – Spiegel Folge einer Zunahme der PRMT- 1 – Expression oder einer DDAH – Inhibition ist. Bei beiden Zuständen ist eine verminderte NO – Verfügbarkeit und somit eine endotheliale Dysfunktion die Folge.

2.5. Augmentationsindex

Die Palpation des peripheren Pulses an den üblichen Lokalisationen gehört zu jeder klinischen Untersuchung des Patienten. Man erhält nicht nur Aufschluss über die Pulsfrequenz peripher, man prüft auch den Rhythmus und die Qualität des Pulsanschlages (flatternd, kräftig usw.). Um diese subjektiven Parameter zu objektivieren, wurde auf dem Boden der Dopplersonographie das Verfahren der Applationstonometrie entwickelt. Mittels einer Messung der Pulskurve in der Peripherie kann auf die zentrale Aortenpulskurve Rückschluss gezogen werden, in dem man den Augmentationsindex bestimmt.

Unter anderem ist die Augmentation ein der musikalischen Notenlehre entlehnter Begriff, der dort die Verlängerung einer Note um circa die Hälfte ausdrückt.

Die Augmentation (AG) in der Humanmedizin ist die Differenz der systolischen Blutdruckwelle P 1 und der im kapillären Gefäßbett reflektierten Pulswelle P 2 und ist im jungen Alter negativ, da bei normaler Gefäßelastizität die erste Pulswelle größer als ihre Reflexion ist. Die Aortenpulswelle wird sozusagen durch ihre Reflexion moduliert und verlängert.

Abbildung 8: Blutdruckabhängiger Pulswellenverlauf

Erstmals wurden 1874 Konturanalysen der Pulskurvenform durchgeführt und zwar von Mahomed bei Patienten mit der Bright´schen Erkrankung.⁹³ Bei der Bright´schen Erkrankung handelt es sich um das Nephrotische Syndrom, wobei Richard Bright 1827 einen Zusammenhang zwischen morphologischen Veränderungen der Niere und dem Auftreten von Ödemen und Proteinurie herstellte. Das Nephrotische Syndrom war noch bis 1905 als Bright`sche Krankheit bezeichnet worden.

Die Untersuchungsmethode ist also nicht neu und wurde dank der zunehmenden Durchdringung medizinischer Bereiche mit computergestützten Verfahren in der heutigen Klinikroutine praktikabel.

Der Augmentationsindex (Alx) wird als Prozentsatz des Quotienten AG/PP angegeben und zwar als Anteil von 100 % des Maximaldruckes. Er stellt das Verhältnis des späten Anteils des systolischen Druckes, der durch die reflektierte Druckwelle des kapillären Gefäßbettes moduliert wird, zum Pulsdruck (PP) dar.⁹⁴

Mittels computergestützter Messung der Elastizitätsparameter wurde in verschiedenen Studien zuverlässig nachgewiesen, dass sich der Alx ändert, wenn die Steifigkeit der arteriellen Gefäße zunimmt.⁹⁵

Um die Änderung des Elastizitätsverhaltens der Gefäße unter ADMA – Gabe zu verifizieren, führten wir ergänzend zur Blutdruck- und Pulsmessung die Messung bzw.

Bestimmung des Augmentationsindex mittels SphymoCor computergestützt durch. Bei diesem Verfahren werden mit Hilfe eines Applanationstonometers Pulsdruckkurven registriert, die dann mittels eines Computerprogramms weiter berechnet werden.

Die Augmentation wird von verschiedenen Faktoren beeinflusst, wie Lebensalter (Siehe Tabelle), Körpergröße (Zunahme des Alx mit abnehmender Körpergröße), Geschlecht (Frauen circa 6 % > Männer), Body Mass Index (positive Korrelation) und körperliche Aktivität (negative Korrelation).

Abbildung 9: Vergleich der Augmentation bei elastischen und arteriosklerotischen Gefäßen

Aus den vorliegenden Studien ergeben sich altersabhängige Normwerte.

Tabelle 6: Normwertverteilung des Augmentationsindex^{96, 97}

Alter Mittelwert der Population in %

Oberes Konfidenzintervall

5 %, Angabe in %

Unteres Konfidenzintervall

5 %, Angabe in %

20 - 4,67 - 23,27 16,87

30 3,03 - 15,57 24,57

40 10,73 - 7,87 32,27

50 18,43 - 0,17 39,97

60 26,13 7,53 47,67

70 33,83 15,23 55,37

80 41,53 22,93 63,07

3. Fragestellung

Durch ADMA - Infusion induzierte pathophysiologisch relevante Plasmakonzentrationen führen bei gesunden Probanden zu einem dosisabhängigen Abfall des renalen Plasmastromes, zu einem Anstieg des renovaskulären Widerstandes, sowie zu einem signifikanten Anstieg des systemischen Widerstandes um ca. 11% zum Ausgangswert.

Für uns stellt sich die Frage, ob ADMA auch eine Veränderung der zerebralen Perfusion induziert, und somit bei der Entstehung von zerebovaskulären Erkrankungen eine Rolle spielen könnte.

Des Weiteren wollen wir herausfinden, ob die Gefäßelastizität durch eine systemische Erhöhung der ADMA - Konzentration beeinflussbar ist.

3.1. Zielsetzung

• Welchen Einfluß hat eine systemische ADMA Konzentrationen von ~10 µmol/l auf die Perfusion des Hirns und dessen Perfusionsmuster unter Ruhebedingungen bei gesunden männlichen Probanden?

• Besteht ein nachweisbarer Einfluss auf die Gefäßelastizität bei einer systemischen ADMA-Konzentration von ~ 10 µmol/l?

4. Methoden

4.1. Probanden

Nach Genehmigung des Versuchsvorhabens durch die Ethik-Kommission der MHH wurden potentielle männliche Probanden einbestellt, um die Eignung für die Studie zu prüfen.

Nach ausführlicher Schilderung des Ablaufs der Untersuchung und nach der Aushändigung des Probandeninformationsbogens (Siehe Kapitel 10) wurde ausreichend Zeit zur Verfügung gestellt (mindestens 24 Stunden), bevor die weitere Untersuchung geplant wurde. Initial wurde eine ausführliche Anamnese erhoben, vor allem in Hinsicht auf Vorerkrankungen und familiäre Belastung im Sinne kardiovaskulärer Ereignisse und Risikofaktoren. Es erfolgte eine körperliche Untersuchung und die Bestimmung von Serumwerten (Retentionsparameter, Leberenzyme, Elektrolyte, Herzenzyme, Elektrolyte) und Blutbild. Des Weiteren erfolgte insbesondere mindestens 24 Stunden vor Untersuchungsbeginn die Aufklärung über den Ablauf, die Risiken und Nebenwirkungen der Magnetresonanztomografie, einschließlich Kontrastmittelgabe.

4.1.1. Ein- und Ausschlusskriterien

Einschlusskriterien: - Alter: 20-40 Jahre - Geschlecht: männlich

- Unauffällige körperliche Untersuchung

- Unterzeichnung der schriftlichen Einverständniserklärung für die Teilnahme an der Studie

- 24 – stündige Nahrungs-, Alkohol- und Koffeinkarenz vor der Untersuchung

Ausschlusskriterien: - Teilnahme an einer anderen Untersuchung innerhalb der letzten 3 Monate

- Rauchen - Hypertonus - Diabetes mellitus

- Einnahme diverser Pharmaka

- Herzschrittmacher, ferromagnetische Clips nach Gefäßoperationen, Metallsplitter, elektronische Implantate (z.B.

Innenohrprothesen)

- Auftreten von Kontraindikationen gegen Gadovist (Nierenfunktionsstörungen, allergische Veranlagungen, schwere Herz-Kreislauf-Erkrankungen)

- Pathologika in der vorher durchgeführten laborchemischen Blutwertkontrolle

- Alle Erkrankungen, die aus medizinischer Sicht eine Kontraindikation darstellen.

4.2. Ablauf der Untersuchung

Am Untersuchungstag wurden die Probanden in Empfang genommen und darauf hingewiesen, jegliche Metallgegenstände abzulegen. Er erfolgte die nochmalige Befragung über das Einverständnis und das Nichtvorhandensein von Allergien und implantierten Metallteilen.

Danach nahmen die Probanden jeweils auf einer Untersuchungsliege Platz. Es wurde sowohl links als auch rechts ein venöser dauerhafter Zugang geschaffen (Braunüle, Venenverweilkanüle mit Injektionsventil der Standardgröße 20 G 1 ¼; 1,1 x 33 mm). In den meisten Fällen wurde über den linken Arm während der Magnetresonanztomografie das gadoliniumhaltige Kontrastmittel appliziert (Name: Gadovist, Wirkstoff:

Gadobutrol Hersteller: Schering, Menge:30 ml, Infusionsdauer: 30 sec). Der rechte Arm stand somit für die Blutentnahmen zur Verfügung. In wenigen Fällen wurde dies entsprechend seitenumgekehrt durchgeführt.

4.2.1. Gliederung des Untersuchungungsablaufes I. Ruhephase

- 40 min ruhig liegen,

-während dessen 2 Blutentnahmen (P0 initial, P1 nach 20 Minuten),

- MRT (Ausschluss von Anomalien jeglicher Art –Siehe Methodik- vor der ADMA- Infusion)

II. Infusionsphase

- Beginn der ADMA- Infusion, wobei vor der Initialisierung die 3. Blutentnahme (P2) erfolgt

- Dauer der Infusion ca. 40 min, währenddessen 4. (nach 20 min Infusion) und 5. (nach 40 min Infusion) Blutentnahme (P3, P4)

III. Messphase

- MRT direkt im Anschluss nach Infusionsende

- 20 min. nach Infusionsende 6. und letzte Blutentnahme (P5)

4.2.1.1. Ruhephase

Insgesamt 40 Minuten dauerte die initiale Ruhephase. Während dieser Zeit wurden halbautomatisch zwei bis fünf Mal der Blutdruck nach Riva Rocci (Gerät: Critikon Dinamap 1846 SX Version 058), die Herzfrequenz und der mittlere arterielle Druck gemessen. Insgesamt drei venöse Blutentnahmen aus dem in der Cubitalvene liegenden Zugang fanden statt (bei 0, 20 und 40 Minuten). Zwischen zweiter und dritter Blutentnahme wurde die Magnetresonanztomografie durch einen klinisch erfahrenen Neuroradiologen (Oberarzt Dr. med. F. Donnerstag) durchgeführt. Um einen Kontakt zum außerhalb der Untersuchungskabine befindlichen Personal zu ermöglichen, wurde der Proband mit einer manuell über einen Gummiball bedienbaren Klingel ausgestattet.

Zudem ist Blickkontakt über einen Spiegel möglich. Keiner der Probanden wollte die Untersuchung vorzeitig unterbrechen.

Es wurde nicht nur eine Ausgangsmessung der zerebralen Perfusion durchgeführt, es erfolgte vor allem der Ausschluss etwaiger zerebraler oder zerebellärer Gefäßanomalien.

4.2.1.2. Infusionsphase

Im Anschluss an die 40-minütige Ruhephase wurde die Infusion verabreicht. Es erfolgte die randomisierte und doppelt geblindete Aufteilung der 20 Probanden in zwei Gruppen zu gleichen Anteilen. Entweder wurde eine Placeboinfusion (isotone Kochsalzlösung) oder eine entsprechend dem Körpergewicht dosierte ADMA - Infusion (3 mg/kg Körpergewicht) vorbereitet. Die notwendige Dosierung zum Erreichen eines

Chemicals, USA und wurde präinterventionell steril filtriert und in 50 ml physiologischer Kochsalzlösung (0,9 %ig NaCl) gelöst. Die Infusion wurde über einen Zeitraum von 40 Minuten verabreicht. Vorher wurde mittels Spülung von physiologischer Kochsalzlösung und Aspiration von Blut die korrekte Lage der Venenverweilkanüle geprüft. Es erfolgte nach 20 Minuten Infusionsgabe (nach 60 Minuten Dauer der Untersuchung) und nach Beendigung der Infusion (nach 80 Minuten Dauer der gesamten Untersuchung) jeweils eine Blutentnahme aus der kontralateralen Venenverweilkanüle. Nach jeder Blutentnahme wurde die Kanüle mit physiologischer Kochsalzlösung gespült, um eine weitere Durchgängigkeit zu gewährleisten.

Entsprechend wurde vor jeder Probenasservation eine Menge von circa 2-5 ml, durch Kochsalz verdünntes, Blut entnommen und verworfen.

Wir führten bis zu acht Messungen des Blutdruckes nach Riva Rocci, der Herzfrequenz und des mittleren arteriellen Druckes während der Infusionsgabe durch.

Vor, während und nach der Probeninfusion wurde mittels Dopplersonde (Sphygmocor apparatus mit Sphygmocor Atecor Medical, Version 6.2.) die Gefäßelastizität mittels Augmentationsindex bestimmt.

Während der gesamten Dauer der Untersuchung befand sich der Proband in einer liegenden Position in einem ruhigem Raum bei konstanter Temperatur (circa 22º Celsius) und ohne störende Einflüsse, wie Lärm oder wechselnde Lichtquellen.

4.2.1.3. Messphase

Im direkten Anschluss an die Gabe der Infusionslösung erfolgte die zweite Hirngefäßdarstellung mittels kontrastmittelunterstützer MRT-Untersuchung. Es erfolgte kein Positionswechsel der Probanden, da die Untersuchungsliege portabel zwischen MRT – Untersuchungsraum und dem Raum, in dem die Gabe der Infusion, die Blutentnahmen und die begleitende Messung des Blutdruckes, Puls und Augmentationsindex erfolgte, verschoben werden konnte. Die abschließende Blutentnahme wurde 20 Minuten nach Infusionsende vorgenommen.

Nach Beendigung der Untersuchung entfernten wir die Venenverweilkanülen beidseits und komprimierten die Punktionsstelle bis zum vollständigen Sistieren der sichtbaren Blutung. Die Probanden wurden hinsichtlich Missempfindungen, Schwindel, Unwohlsein und Schmerzen befragt. Nach einer circa zehnminütigen Nachbeobachtungszeit wurden die Probanden, mit dem Hinweis, sich bei etwaigen Auffälligkeiten im Befinden sofort zu melden, entlassen.

4.3. Probenasservation

Tabelle 7: Zeitablauf der Blutentnahmen

Blutentnahme Zeitpunkt

P 0 0 min

P 1 20 min

P 2 40 min

P 3 60 min

P 4 80 min

P 5 100 min

Je Blutentnahme wurde eine EDTA- und eine Serumprobe asserviert. Die Proben wurden sofort nach Entnahme auf Eis gelagert und nachfolgend mittels Zentrifugation (Kühlzentrifuge Megafuge 3.0 R, Hersteller: Heraeus Sepatech ) bei 3500 U/min bei 4°

Celsius für 15 Minuten. Umgehend wurde mit Eppendorf-Pipetten das Serum aus den Serummonovetten und das Plasma aus den EDTA-Monovetten entnommen und in Eppendorfgefäße gefüllt. Die Aliquots wurden ohne Zeitverlust bei –80° Celsius eingefroren.

4.4. ADMA- Bestimmung

Die Bestimmung der ADMA-Konzentration erfolgte nach Abschluss der Untersuchungen unserer Probanden im Institut für Klinische Pharmakologie der Universität Magdeburg mittels HPLC-Chromatografie.

Die „high performance- liquid chromatographie“ ist die am häufigsten verwandte Bestimmungsmethode von ADMA-, SDMA- oder L- Arginin - Konzentrationen. Nach Bode-Böger SM et al. 1996 umfasst die Methode den im Folgenden geschilderten Ablauf.⁹⁸

Der erste Schritt ist eine Festphasenextraktion mit Kationenaustauschersäule zur

derivatisiert, um die Detektion mittels Fluoreszenzdetektor zu ermöglichen. Die Selektivität und Sensitivität nehmen zu, da nur derivatisierte Substanzen aus der Probe gemessen werden und da die Fluoreszenzmessung sehr empfindlich ist. Anschließend wird die Trennung mittels einer Phenylsäule und einem Methanol – Citratpuffer – Gemisch (30 + 60) als Eluenten vorgenommen.⁹⁸

Nach 1996 wurden einige Modifikationen der Methode ausprobiert, um die Bestimmungszeit zu verkürzen, die Trennung zwischen ADMA und SDMA zu verbessern sowie die Verfügbarkeit der Methode zu erhöhen.

Abbildung 10: Auftrennung von ADMA, SDMA und L – Arginin zur Quantifizierung der Anteile im Humanserum. L – Homoarginin wird als Standard zugeben. Dauer der Messung in diesem Fall circa 50 min.

Erst mit der Einführung der GC – Tandem MS und der GC – MS (Gaschromatographie – Massenspektrometrie)⁹⁹ wurden entscheidende Verbesserungen möglich. Die Analysenzeit wird auf circa 10 min verkürzt und die Auftrennung zwischen ADMA und SDMA geschieht vollständig, da unterschiedliche Fragmente ihrer Derivate vorliegen.

Durch die Herstellung von stabil isotopenmarkiertem ADMA ist es der Arbeitsgruppe von Böger et al gelungen, die GC – tandem MS weiter zu verbessern. Als interner Standard dient isotopenmarkiertes D 6 - ADMA, welches bei identischen chemischen Eigenschaften eine um sechs Einheiten höhere molekulare Masse besitzt. Dies ermöglicht eine Unterscheidung vom ADMA im Massenspektrometer. Die Genauigkeit und Präzision der Messung wird durch die Zugabe dieses internen Standards optimiert.

So werden Verluste während der Probenvorbereitung und eventuelle Matrixeffekte ausgeglichen. Ein MS-Detektor erlaubt aufgrund der hohen Selektivität eine störungsfreie Analyse. Die bis vor Einführung der Methode aufwendige Probenvorbereitung entfällt. In allen Proben ist neben ADMA auch SDMA enthalten.

Systematische Fehler werden aufgrund einer von der verwendeten biologischen Matrix unabhängigen Kalibrierung minimiert.

4.5. Bestimmung des Augmentationsindex

Neben der Messung der Pulskurvenkonturen der A. brachialis, der A. carotis communis und der A. femoralis je Proband nach der Sphygmocormethode gingen jeweils die Größe, das Gewicht, das Alter und der Blutdruck des untersuchten Probanden ein. Die Messung erfolgt nach ausführlicher Einarbeitung und zahlreichen Tests an diversen Probanden bei jeder Untersuchungsmessung durch nur einen Untersucher, um konstante Messbedingungen zu schaffen. Zur Berechnung des Augmentationsindex wurde die Software Sphygmocor Atecor 6.2. verwandt.

Aus der mittels Applationstonometer (Siehe Abbildung 11) ermittelten Radialiskurve errechnet das System die Druckkurve in der aszendierenden Aorta. Beide Kurven werden gemittelt. Aus den Wendepunkten der gemittelten Kurven kann man verschiedene Parameter, die über die hämodynamischen Verhältnisse Auskunft geben, ableiten. Des Weiteren kann man die Pulswelle ähnlich von der Carotis ableiten.

Die Transferfunktion wurde an der Universität Sydney unter Prof. Dr. med. M.

O'Rourke und Prof. Avolio entwickelt und validiert.⁹⁵

4.6. Hirnperfusionsmessung mittels MRT

Die Magnetresonanztomografie ist ein radiologisch-diagnostisches Verfahren zur Erzeugung von Schnittbildern in einer frei wählbaren Raumebene ohne Verwendung von Röntgenstrahlung. Aufgrund der fehlenden Strahlenbelastung und der klinisch erzielten hohen Aussagekraft der MRT entschieden wir uns für diese Untersuchungsvariante der zerebralen Durchblutungsmessung. In der Medizinischen Hochschule Hannover stand uns ein Signa NV/i 1,5 Tesla der Firma General Electric (Milwaukee, USA) zur Verfügung, ein Ganzkörperscanner, der neurovaskulär optimiert arbeitet. Die verwendete Kopfspule ist ebenfalls ein Produkt dieser Firma.

Abbildung 12: Signa NV/i 1,5 Tesla der Firma General

Um aussagekräftige, vergleichbare und reproduzierbare Daten zu erhalten sowie relevante vorbestehende Erkrankungen des Gehirns oder der Hirngefäße auszuschließen, wurden das Parenchym und die Gefäße Gehirns mittels vier Sequenzen untersucht, die im Folgenden benannt und näher beschrieben werden.

1. T2-gewichtete Sequenz mit Flüssigkeitsunterdrückung (FLAIR) 2. Diffusionsgewichtete Sequenz

3. Einstromangiographie-Sequenz =TOF (Time of flight) 4. Spinecho-EPI-Sequenz für die Hirnperfusion

4.6.1. T2-gewichtete Sequenz mit Flüssigkeitsunterdrückung (FLAIR)

Die T2-gewichtete Sequenz ist durch eine längere Repetitionszeit TR (Zeit zwischen zwei Anregungen; TR=8400 ms) und eine längere Echozeit TE (Zeit zwischen Anregung und Signalaufnahme; TE=145 ms) charakterisiert. Die TI beträgt 2100 ms bei unserer Untersuchung. Um Signale bestimmter Gewebe, z.B. Wasser, zu unterdrücken, werden vor der eigentlichen Anregung Sättigungsimpulse eingefügt. Die Signale der übrigen Gewebe treten stärker hervor. Die verwendete Matrix betrug 256 x 192.

Diese Suchsequenz wurde initial mit 19 Schichten und einer Schichtdicke von 6 mm gefahren. Dies ist eine bikommisural ausgerichtete, axiale T2-Flair, mittels derer man Fehlbildungen, größere stattgehabte Ischämieherde, Ödeme und auch Hirntumoren weitestgehend ausschließen kann. Liquor, Ödeme und Zysten erscheinen wegen einer langen T2 hell.

4.6.2. Diffusionsgewichtete Sequenz (GR EPI – DWI)

Diese axiale, bikommisural ausgerichtete Sequenz ermöglicht die Detektion akuter Ischämien. Die Schichtdicke betrug 5 mm bei lückenloser Schichtführung, insgesamt wurde mit circa 28 Schichten das gesamte Gehirn erfasst. Die TR betrug 8000 ms, die TE 88,4 ms. Der B-Wert ist ein Maß für die Stärke der Diffusionswichtung und beträgt bei unserer Untersuchung für das Gehirn optimiert 1000 s/mm². Bei einer Matrix von

Zugrunde liegt der Funktionsverlust der Na-K-ATPase bei hypoxisch - hypoxämischen Zellen. Aufgrund der dadurch entstandenen Verschiebung im Elektrolytgefälle zwischen intra - und extrazellulär kommt es zum passiven H2O-Einstrom. Die Brown´sche Molekularbewegung wird gestört. Bei intakter Zellfunktion und aufrechterhaltener Brown´scher Molekularbewegung werden die Protonen im Magnetfeld durch einen ersten Diffusionsgradienten angeregt. Nach einem kurzen Zeitintervall wird ein zweiter Diffusionsgradient geschaltet, der zum Signalverlust führt: es entstehen graue Bilder des gesunden Hirngewebes. Bei akkumuliertem Wasser (Protonen) in ischämisch geschädigten Zellen bleibt die Anregung trotz zweitem Diffusionsgradienten erhalten, es ist ein hyperintenses (helles) Signal nachweisbar.

4.6.3. TOF (Time of flight)

Es handelt sich hier um eine Gradientenecho (GE) - Sequenz (kürzere Messzeit, Untersuchung in Atemstillstand möglich). Dabei betrug die TR exakt 39 ms, die TE dauerte 6,9 ms bei einem Flip – Winkel von 20º. Die Matrix misst 256 x 160. Die effektive Schichtdicke betrug 1,6 mm. Es kommt zur hellen (hyperintensen) Darstellung einströmender Spins. Man nutzt die Bewegung der Teilchen im Blut aus. Stationäres Gewebe wird durch Anregung in kurzen Zeitabständen gesättigt, diese Schichten werden ausgeblendet. Eine Kontrastmittelgabe ist nicht notwendig. Aus der Summe der Einzelbilder kann man über eine MIP (maximal intensity projection) ein der Angiographie ähnliches Gefäßbild erzeugen. Dies geschieht zum Zweck des Ausschlusses von Gefäßanomalien vor der Infusionsgabe.

4.6.4. EPI – echoplanar imaging

Im Rahmen dieser T2-gewichteten Sequenz werden 12 Schichten 35-mal gescannt mit einer Schichtdicke von 10 mm. Bei dieser Sequenz betrug die TR 2000 ms und die TE 60 ms, wobei die Matrix 128 x 128 maß. Das gadoliniumhaltige Kontrastmittel löst einen deutlichen Abfall des T2-Signals aus (15 ml Gadobutrol und 30 ml NaCl wurden mit einer Flussrate von 5 ml/sec über Einwegkatheter injiziert). Der bereitstehende Kontrastmittelapplikator war ein Power injector der Firma MEDRAD (Indianola, USA).

Es wurden drei regionale Hirnparameter gemessen:

- Blutvolumen (regional) - Blutfluss (regional) - Mittlere Transitzeit.

Die Auswertung des regionalen Blutflusses erfolgt bilateral mittels vier visuell platzierter standardisierter ROI`s (region of interest). Davon werden frontal, occipital und im Bereich der Stammganglien à 300 mm³ die Stromgebiete der A. cerebri anterior, der A. cerebri posterior und der Bereich der proximalen A. cerebri media markiert. Ein Bereich von 1000 mm³ wird temporal im Bereich der A. cerebri media gekennzeichnet.

Die Echoplanarbildgebung gestattet bei hohen Feldstärken (1,5 Tesla) die vollständige zweidimensionale Gehirnaufnahme bei nur einer einzigen Hochfrequenzanregung.⁹⁹

Abbildung 13: Diffusionsgewichtete Sequenz mit gewählten ROI`s

Die von uns genutzte Software zur Berechnung des regionalen cerebralen Blutflusses (rCBF) ist die FUNCTOOL Version 1.9. von General electric (Milwaukee, USA).

Abbildung 14: Darstellung der standardisiert manuell gewählten ROI`s bei der Auswertung der T2-gewichteten Sequenz mit Functool

5. Ergebnisse

5.1. Probandendaten

Neben konstitutionellen Daten, wie Alter, Größe und Gewicht, entnahmen wir mehrere Tage vor der eigentlichen Untersuchung venöses Blut und bestimmten bei allen Probanden hämatologische und serologische Parameter, um pathologische Veränderungen auszuschließen. Zudem erfolgte die klinische Untersuchung, die die Auskultation und Perkussion der Pulmo, des Herzens sowie des Abdomens umfasste.

Die Palpation der peripheren arteriellen Pulse wurde ebenfalls durchgeführt. Bei den in die Studie eingeschlossenen 20 Probanden wurde kein pathologischer Befund erhoben.

Bei allen Probanden zeigten sich die ermittelten Werte im Normbereich wie folgt.

Tabelle 8: Hämatologische und serologische Parameter aller Probanden (n = 20)

Parameter Mittelwert der 20 Probanden

Leukozyten 6,035/nl

Hämoglobin 14,77 g/dl

Thrombozyten 201/nl

Kreatinin 1,05 mg/dl

Harnsäure 5,2 mg/dl

Glucose 55 mg/dl

Natrium 141 mmol/l

Kalium 4,0 mmol/l

Calcium 2,57 mmol/l

Eiweiß 7,8 g/dl

Die Proben wurden in einem von der Medizinischen Hochschule Hannover unabhängigem Labor untersucht. Sie wurden nur unter Angabe einer Probandennummer anonym verschickt.

Alle Werte wurden durch mich entsprechend ausgewertet, wonach die Selektion der Probanden erfolgte. Ein möglicher Proband schied aus, da sich erhöhte

Nachfolgend sind die betreffs ADMA interessierenden klinischen und laborchemischen Parameter in den beiden untersuchten Gruppen separat aufgeführt.

Tabelle 9: Klinische und laborchemische Charakterisierung der Probanden in den beiden Studienarmen

Placebo ADMA

Probandenzahl 10 10

Alter 28 ± 3 26 ± 4

BMI 23 ± 2 23 ± 2

Cholesterol (mg/dl) 176 ± 33 177 ± 51

HDL-Cholesterol (mg/dl) 59 ± 8 53 ± 15

LDL-Cholesterol (mg/dl) 95 ± 33 99 ± 37

Triglyceride 107 ±34 114 ± 40

Mittlerer arterieller Blutdruck (mm Hg) vor der Infusion 92 ± 10 89 ± 9 Mittlerer arterieller Blutdruck (mm Hg) nach der Infusion 90 ± 7 89 ± 6

Herzfrequenz vor der Infusion 63 ± 3 61 ± 9

Herzfrequenz nach der Infusion 60 ± 4 56 ± 9*

* p<0.05 – Vergleich der Herzfrequenz vor und nach der Infusion

Während und nach der ADMA – Infusion zeigt sich eine Senkung der Herzfrequenz, die Placebogabe hatte darauf keinen Effekt.

Weder ADMA noch die Placebogabe veränderten während der gesamten Untersuchung den mittleren arteriellen Blutdruck, der halbautomatisch mit dem Gerät Critikon Dinamap 1846 SX Version 058 unter konstanten äußeren Bedingungen bestimmt wurde.

5.2. ADMA

Bei allen Probanden wurden insgesamt 6 Proben entnommen, der zeitliche Verlauf ist in der Tabelle 7 aufgeführt.

Die initial entnommenen Serumproben zeigen einen mittleren ADMA – Gehalt (statistischer Mittelwert) von P 0 = 0,452 µmol/l bei den untersuchten 20 Probanden.

A D M A P 0 0 ,6 0 0

0 ,4 0 0

1 1

6

Abbildung 15: ADMA – Gehalt in der initial entnommenen Probe aller 20 Probanden

Mittels SPSS 14.00 erfolgte die beschreibende Statistik, die für die initiale Probe hier aufgeführt wird.

Tabelle 10: ADMA – Gehalt bei allen 20 Probanden zu Beginn der Untersuchung in der statistischen Auswertung.

Statistik Standardfehler

ADMA P 0 Mittelwert in µmol/l 0,45180 0,016591

Median 0,44100

Standardabweichung 0,074195

Minimum 0,310

Diese Werte blieben unter Ruhebedingungen ohne weitere äußere Einflüsse in den weiteren zwei Messungen für alle 20 Probanden nahezu konstant, P 1 = 0,437 µmol/l sowie P 2 = 0,443 µmol/l, wie die Abbildung 13 zeigt.

In der Placebogruppe ist während der Infusion ein Mittelwert von P 3 = 0,463 µmol/l und P 4 = 0,451 µmol/l gemessen worden. Nach Beendigung der Infusion wurde bei den zehn Probanden, denen eine Placeboinfusion verabreicht wurde, im Mittel ein Wert von P 5 = 0,434 µmol/l bestimmt.

Tabelle 11: Deskriptive Statistik des ADMA – Gehaltes in µmol/l der 10 Probanden, die eine Placebo – Infusion erhielten.

N Minimum Maximum Mittelwert Standardabweichung

P 0 Placebo 10 0,411 0,507 0,45060 0,029267

P 1 Placebo 10 0,341 0,513 0,43116 0,045282

P 2 Placebo 10 0,379 0,496 0,43536 0,032375

P 3 Placebo 10 0,405 0,517 0,46297 0,031923

P 4 Placebo 10 0,411 0,485 0,45121 0,023785

P 5 Placebo 10 0,380 0,504 0,43419 0,036779

Es zeigt sich also im gesamten Untersuchungsverlauf ein nahezu konstanter ADMA – Gehalt im Serum, wobei die Mittelwerte bei den einzelnen Messungen zwischen 0,431 und 0,463 µmol/l variieren. In anderen Studien wurden mittels HPLC – Massenspektroskopie ähnliche Normwerte für gesunde Probanden ermittelt (Siehe Tabelle 5).

Nach ADMA – Infusion zeigt sich eine sofortige Steigerung der Serumwerte. Nach 20 – minütiger ADMA – Gabe weisen die zehn Probanden einen mittleren ADMA – Wert im Serum von P 3 = 15,418 µmol/l auf. Nach insgesamt 40 min zeigt sich eine Steigerung auf P 4 = 33,968 µmol/l. Weitere 20 min nach Beendigung der Infusion zeigt sich wieder ein Abfall der ADMA – Konzentration auf P 5 = 14,220 µmol/l.

Tabelle 12: Deskriptive Statistik der Probandendaten, die ADMA erhielten, P 3 – P5 in µmol/l.

N Minimum Maximum Mittelwert

P 3 ADMA 10 6,401 20,456 15,41762

P 4 ADMA 10 9,905 93,715 33,96840

P 5 ADMA 10 1,584 77,419 14,22030

5.3. Zerebraler Blutfluss

Im MRT ergeben sich folgende Bilder bei der Nachberechnung der Rohdaten zur Perfusionsbestimmung.

Die von uns genutzte Software zur Berechnung des regionalen cerebralen Blutflusses (rCBF) ist die FUNCTOOL Version 1.9. von General electric (Milwaukee, USA).

Die bestimmten Daten wurden dann mittels gepaartem t – Test ausgewertet. Wir nutzten zur statistischen Auswertung das Programm SPSS 11.51 und 14.00 für Windows.

Nach Infusionsgabe von 0,10 mg ADMA/kg/min über einen Zeitraum von 40 min zeigt sich (Siehe Abbildung 17) ein Abfall der zerebralen Perfusion um 15,1 ± 4,5 % (p=0,014)*.

Hingegen ist unter Placebo – Infusion (# hier in der Abbildung mit pre vehicle und post vehicle deklariert) ein Anstieg der zerebralen Perfusion um 7,7 ± 2,8 % messbar.

50 60 70 80 90 100 110

Zerebraler Blutfluss (ml/100g/min)

*

vor ADMA nach ADMA vor Placebo nach Placebo

#

Abbildung 17: Zerebraler Blutfluss unter ADMA- Infusion und Placebogabe. (* und # p<0,05 zwischen den Daten vor und nach Infusion)

Im Rahmen der MRT – Untersuchung wurde neben der Messung des zerebralen Blutflusses auch das Blutvolumen sowie die mittlere Transitzeit im anterioren Stammganglienbereich bestimmt (s.o. Kap. 4.6.4). Die mittlere Transitzeit ist der Quotient aus zerebralem Blutvolumen und zerebralem Blutfluss, MTT = CBV/CBF.

Die folgende Tabelle gibt die eben genannten Parameter als Mittelwert mit der entsprechenden Standardabweichung an.

Tabelle 13: Zerebraler Blutfluss, zerebrales Blutvolumen und die mittlere Transitzeit im anterioren Stammganglienbereich in beiden Studiengruppen vor und nach der Infusion.

CBV CBF in

ml/100g/min MTT

Vor Placebogabe 7,67 ± 2,58 115,19 ± 17,24 3,92 ± 0,98 Nach Placebogabe 8,46 ± 2,02 120,20 ± 7,48 4,12 ± 0,90 Vor ADMA – Gabe 9,98 ± 4,39 115,89 ± 15,46 5,07 ± 1,79

Nach ADMA -

Gabe 8,56 ± 4,94 97,25 ± 14,63* 5,07 ± 2,13

*p<0,05 vor und nach ADMA – Infusion